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| タイトル： | 特許公報(B2)_グルタチオンの結晶およびその製造法 |
| 出願番号： | 2008539823 |
| 年次： | 2013 |
| IPC分類： | C07K 5/093,A61K 38/00,A61K 9/20 |
特許情報キャッシュ
下瀬 強 村田 英城 林 忠志 佐久間 崇浩 JP 5243963 特許公報(B2) 20130412 2008539823 20071016 グルタチオンの結晶およびその製造法 協和発酵バイオ株式会社 308032666 下瀬 強 村田 英城 林 忠志 佐久間 崇浩 JP 2006281709 20061016 20130724 C07K 5/093 20060101AFI20130704BHJP A61K 38/00 20060101ALI20130704BHJP A61K 9/20 20060101ALI20130704BHJP JPC07K5/093A61K37/02A61K9/20 Ｃ０７Ｋ ５／００−５／１２ Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２ Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８ ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ） 特公昭４６−０４３５２９（ＪＰ，Ｂ２） J.Biol.Chem.，１９２９年，Vol.84，p.657-674 J.Biol.Chem.，１９２９年，Vol.84，p.269-320 分析化学，１９６９年，Vol.18，p.874-878 3 JP2007070171 20071016 WO2008047792 20080424 12 20101012 水落 登希子 本発明は、グルタチオンの結晶、該結晶を含有する錠剤、および該結晶の製造法に関する。 グルタチオン（γ‐L-グルタミル-L−シスチニル‐グリシン）は、生物に広く存在する物質であり、補酵素として作用するほか、肝臓において解毒作用を有することが知られている。よってグルタチオンは医薬品、健康食品および化粧品等の製品、原料または中間体として広く用いられている。 グルタチオンを経口摂取する場合の剤形としては、錠剤、顆粒、および液剤などが考えられるが、液剤は摂取が容易である点において好ましく、錠剤は携帯性に優れ、一定量を容易に、かつ味を気にすることなく服用できるので好ましい形態である。 グルタチオンを含有する液剤の製造においては、製造工程のハンドリング、および液剤中の成分の均一性の観点から、流動性が良く、かつ水溶液への溶解性が良いグルタチオンの粉末が求められる。 グルタチオンを含有する錠剤の製造においては、製造工程のハンドリング、および錠剤内部成分の均一性の観点から、原料に用いるグルタチオンの粉末は流動性が良いものが求められ、特にグルタチオンを高含有する錠剤を製造する場合は、流動性とともに高い圧縮成型性も求められる。流動性が悪い場合、錠剤そのものが製造できない場合もある。また、単純に流動性を良くするために、粒子径が大きい粉末を原料に用いた場合、割れ、欠け、キャッピングなどの打錠障害が生じる可能性があり、また高い錠剤硬度を有する錠剤を取得し難いことが一般的に知られている。 またグルタチオンの粉末は、吸湿性および安全性等の面から非結晶アモルファスではなく、結晶性粉末が好ましく、さらに輸送の容易性およびコストの面から比容積が小さいグルタチオンの結晶が望まれている。 グルタチオンの製造法としては、酵母などの微生物を用いた発酵法、および酵素法（非特許文献１）などが知られている。それら方法で得られるグルタチオンを含有する培養物または反応液から取得されたグルタチオンの結晶も市販されているが、流動性、充填性、打錠性および溶解容易性などの点において難点があり、これらの点が改善されたグルタチオンの結晶が求められているが、これまで流動性、充填性、打錠性および溶解容易性に優れたグルタチオンの結晶、および該結晶の製造法は知られていない。特開昭６０−１０５４９９号公報Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 233 (2004) 本発明は、流動性、充填性、打錠性および溶解容易性に優れたグルタチオンの結晶、およびその製造法を提供することを目的とする。 本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。（１）平均幅が７〜４０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μmであるグルタチオンの結晶。（２）安息角が５３度以下である上記（１）のグルタチオンの結晶。（３）粗比容積が５．０cm3/g以下である上記（１）または（２）のグルタチオンの結晶。（４）グルタチオンの結晶がα晶である上記（１）〜（３）のいずれか１つの結晶。（５）上記（１）〜（４）のいずれか１つのグルタチオンの結晶を含有する錠剤。（６）グルタチオンが溶解している水溶液にグルタチオンの結晶を種晶として添加した後、５時間以上撹拌し、該水溶液中にグルタチオンを晶析させ、該水溶液からグルタチオンの結晶を採取することを含む上記（１）〜（４）のいずれか１つのグルタチオンの結晶の製造法。 本発明により、工業的に有用な流動性、充填性、打錠性および溶解容易性に優れたグルタチオンの結晶、該結晶を含有する錠剤、および該結晶の製造法が提供される。１．本発明のグルタチオンの結晶 結晶の形状は、結晶の縦方向の「長さ」（Ｌ）と横方向の「幅」（Ｄ）の比（Ｌ／Ｄ）で表すことができる。同じＬ／Ｄを有する結晶であっても、針状結晶と柱状結晶の幅を比較したとき、柱状結晶の幅の方が有意に大きい。 本発明のグルタチオンの結晶としては、平均幅が７〜４０μm、好ましくは１５〜４０μm、より好ましくは、２０〜４０μm、さらに好ましくは２５〜３０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μm、好ましくは２０〜６０μm、より好ましくは３０〜６０μm、さらに好ましくは４０〜５５μmの結晶をあげることができる。 平均幅が７μm未満、特に５μm以下であり、かつ平均粒径が１０μm未満のグルタチオンの結晶は流動性が悪く、グルタチオンを高含有する錠剤、例えば３０重量％以上含有する錠剤を打錠機を用いて圧縮成型する際、臼へ均一に充填されないため打錠ができないなどの障害がある。 また本発明のグルタチオンの結晶としては、平均幅が７〜４０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μmであって、さらにその安息角が５３度以下、好ましくは５２度以下、さらに好ましくは５１度以下、より好ましくは５０度以下の結晶をあげることができる。安息角が５３度よりも大きいグルタチオンの結晶は、ホッパーから排出する際、ホッパー底部の傾斜角が５３度より大きくなければホッパー底部から完全に排出することができないので、装置が限定され、ハンドリングが煩雑である。 さらに本発明のグルタチオンの結晶としては、平均幅が７〜４０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μmであって、加えて粗比容積が５．０cm3/g以下、好ましくは２．０〜５．０cm3/g、より好ましくは３．０〜５．０cm3/gである結晶をあげることができる。粗比容積が５．０cm3/g以下の結晶は、充填性に優れるため、粗比容積が５．０cm3/gより大きい結晶に比べ、各種加工におけるハンドリングが容易であり、また輸送面でのコストも低い。 さらに本発明のグルタチオンの結晶としては、平均幅が７〜４０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μmであり、加えて水への溶解性が優れた結晶をあげることができる。 水への溶解性が優れた結晶としては、３７℃に保温した２００mlの脱イオン水に、グルタチオンの結晶を１２g投入し、１２０rpmで撹拌したときの投入時から完全に結晶が溶解するまでの時間が、１００秒以内、好ましくは８０秒以内、より好ましくは７０秒以内、さらに好ましくは６８秒以内、特に好ましくは６５秒以内のグルタチオンの結晶をあげることができる。 本発明のグルタチオンの結晶は、α晶およびβ晶などの結晶多形を含む結晶性粉末であってもよいが、グルタチオンの結晶としてはα晶が好ましく、結晶性粉末としては総グルタチオンに占めるα晶の比率が９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは９９．９％以上である結晶性粉末をあげることができる。２．本発明のグルタチオン含有錠剤 本発明のグルタチオンの結晶を含有する錠剤としては、上記した本発明のグルタチオンの結晶、賦形剤、滑沢剤などの粉末を混合して圧縮成型等することにより得られる錠剤をあげることができる。 本発明の錠剤とは、普通錠、コーティング錠、徐放錠、口腔内速崩錠、バッカル錠、チュアブル錠などであり、本発明のグルタチオンの結晶を主成分とし、それ以外に、通常の栄養食品または医薬品において用いられる通常の賦形剤、崩壊剤などを含有してもよい。また、更に結合剤、滑沢剤、その他の添加成分などを所望により含有させることもできる。錠剤中でグルタチオンが占める割合は、好ましくは約１０〜９５重量％、より好ましくは約２０〜８０重量％、さらに好ましくは約３０〜６０重量％である。 賦形剤としては、例えば糖類（単糖類、二糖類、多糖類）、糖アルコールなどがあげられ、好ましくは、単糖類、二糖類、糖アルコールがあげられる。錠剤中で賦形剤が占める割合は、好ましくは約１０〜９０重量％、より好ましくは約１５〜６０重量％、さらに好ましくは約２０〜４０重量％である。 単糖類または二糖類としては、例えば、乳糖、ショ糖、マルトース、トレハロースなどがあげられる。糖アルコールとしては、例えばマンニトール、還元麦芽糖水飴、還元パラチノース、マルチトール、マルトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等があげられる。単糖類、二糖類または糖アルコールは、酸化型グルタチオン含有量などによって任意に１種または２種以上の組み合わせから選択することができる。 また、賦形剤としての多糖類として、好ましくはβ-シクロデキストリン、結晶セルロースなどがあげられ、特に口腔速崩壊錠剤の形態おいて、β-シクロデキストリンが好ましい。 崩壊剤としては、例えば、コーンスターチ、バレイショデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムなどがあげられ、好ましくはカルボキシメチルセルロースカルシウムまたはデンプングリコール酸ナトリウムがあげられる。錠剤中で崩壊剤が占める割合は、好ましくは０．５〜２０重量％、より好ましくは０．５〜５重量％、さらに好ましくは０．５〜２重量％である。 結合剤としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、プルラン、アクリル酸系高分子、ポリビニルアルコール、ゼラチン、寒天、アラビアガム、アラビアガム末、キサンタンガム、トランガム、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、部分α化デンプン、マクロゴールなどがあげられる。錠剤中で結合剤が占める割合は、好ましくは０．５〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％、さらに好ましくは０．５〜２重量％である。 滑沢剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、軽質無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素などがあげられる。錠剤中で滑沢剤が占める割合は、好ましくは０．０５〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％、さらに好ましくは０．１〜３重量％である。 その他の添加成分としては、ベータカロチン、食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号等の食用色素、食用レーキ色素、ベンガラナイアシン等の着色剤、ビタミンＥ、アスコルビン酸、ビタミンＢ類、ビタミンＡ、ビタミンＤまたはこれらの誘導体などのビタミン類、ナトリウム等のミネラル類、アスパルテーム、グルコース、フルクトース、スクラロース、ステビア、サッカロース、サッカリンナトリウム、ソーマチン、アセスルファムカリウムなどの甘味料、二酸化ケイ酸、ケイ酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、タルク、リン酸水素カルシウム等の固化防止剤、重曹などの発泡剤、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料、レモンフレーバー、レモンライムフレーバー、オレンジフレーバー、グレープフルーツフレーバー、メントールなどの香料などがあげられ、これらの中から１種又は２種以上を所望により使用することができる。錠剤中でその他の添加成分が占める割合は、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．１〜３重量％、さらに好ましくは０．１〜１重量％である。 本発明のグルタチオンの結晶および、賦形剤、滑沢剤などを配合したものは、直接圧縮成形法、湿式法による打錠法のどちらでも錠剤を得ることができる。錠剤の製造方法としては、例えば、本発明のグルタチオンの結晶、賦形剤および滑沢剤などの粉末をできるだけ均一に混合し、打錠機に直接フィードして打錠する方法があげられる。 本発明の錠剤の硬度は、３〜２０ｋｇｆで、好ましくは４〜１５ｋｇｆである。１錠の大きさは通常直径５〜２０ｍｍが好ましく、またその重量は２００〜２０００ｍｇが好ましい。また前記錠剤の形状は、丸型、四角型、六角型、円柱型等様々あるが特に限定されるものではない。３．本発明のグルタチオンの結晶の製造法 本発明のグルタチオンの結晶の製造法は、グルタチオンが溶解している水溶液にグルタチオンの結晶を種晶として添加した後、５時間以上撹拌し、該水溶液中にグルタチオンを晶析させ、該水溶液からグルタチオンの結晶を採取する方法である。 グルタチオンが溶解している水溶液としては、公知のグルタチオンの製造法で得られるグルタチオン含有溶液、例えばグルタチオンを生産する能力を有する微生物を培養して得られるグルタチオンを含有する培養物、および酵素法で得られるグルタチオン含有反応液［Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 233 (2004)、および特開昭６０−１０５４９９号など］などから不溶物を除去するなどして調製して得られる溶液などをあげることができる。 酵素法で用いられるグルタチオンを生産する能力を有する微生物としては、Candida Krusei IFO 0011（特開昭６０−１６０８９４号）、Saccharomyce scerevisiae IFO 2044（特開昭５４−１３８１９０号）、Escherichia coli ATCC 11303（特開昭６０−１０５４９９号）、Corynebacterium glutamicum ATCC 21171（特開昭６０−２７３９７号）、およびProteus mirabilis IFO 3849（特開昭５７−２６９８号）など、並びにγ−グルタミルシステインシンセターゼ（GSHI）をコードするＤＮＡ（gshA）またはグルタチオンシンセターゼ（GSHII）をコードするＤＮＡ（gshB）で形質転換された微生物をあげることができる。そのような形質転換株としては、特開平２−３１６９０に記載のEschrichia coli由来のgshAまたはgshBを有するE. coli RC912/pBR322-gshII（FERM BP-336）およびE. coli RC912/pBR325-gshI・II（FERM BP-337）などをあげることができる。 上記のグルタチオンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にグルタチオンを生成、蓄積させることによりグルタチオンを含有する培養物を取得することができる。 グルタチオンを生産する能力を有する微生物を培養するための培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、およびアミノ酸の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。 炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。 窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。 無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。 ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じてグルタチオンを生産する能力を有する微生物が生育に要求する物質を添加することができる。 培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは２８〜３８℃である。培養時のpHは５〜９、好ましくは６〜７．５である。培養時間は、５時間〜５日間、好ましくは１６時間〜３日間である。 グルタチオンの酵素的製造法には、培養途中または終了後の培養物をそのまま酵素源として用いることもできるが、培養物から遠心分離または膜処理などにより培養物から分離した菌体、またはその洗浄菌体、乾燥菌体、凍結菌体、凍結乾燥菌体、界面活性剤、有機溶媒または酵素で処理した菌体など、菌の形状を保持し、処理前の菌体と実質的に同じ活性を有する菌体も同様に酵素源として用いることができる。 界面活性剤としては、ポリエチレングリコールステアリルアミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社製）、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（例えばサニゾールB-50、花王社製）などのカチオン性界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム（例えばパーソフトSL、日本油脂社製）などのアニオン性界面活性剤、ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート（例えばノニオンST221、日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤、ジメチルラウリルベタイン（例えばニッサンアノンBL、日本油脂社製）などの両性界面活性剤などがあげられ、これらは通常０．１〜２０g/l、好ましくは１〜１０g/lの濃度で用いられる。 有機溶媒としては、トルエン、キシレン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、これらは通常０．１〜５０ml/l、好ましくは１〜２０ml/lの濃度で用いられる。 上記した培養物、該培養物から得られる菌体、または該菌体の処理物を酵素源に用い、L-グルタミン酸、L-システインまたはL-シスチンおよびグリシンを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にグルタチオンを生成、蓄積させる。必要に応じてＡＴＰ、またはエネルギー供与体、リン酸イオン、およびマグネシウムイオンなど、上記した酵素源の活性を利用してＡＤＰからＡＴＰを生成するために必要な成分を該媒体中に存在させてもよい。 ＡＴＰは、０．５〜２００mmol/lの濃度で用いることができる。 エネルギー供与体としては、上記した酵素源により資化されて、ＡＴＰを生成させることができる物質であれば限定されないが、該物質としてはグルコース、アラビノース、ラクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、糖蜜、澱粉分解物などの炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸、α-ケトグルタル酸などの有機酸、グルタミン酸などのアミノ酸などを用いることができ、これらは１〜２００g/lの濃度で用いられる。 リン酸イオンおよびマグネシウムイオンの濃度は、水性媒体中において４〜４００mmol/lの範囲で保持することが好ましい。リン酸イオンとしては、リン酸のナトリウム塩、カリウム塩およびマグネシウム塩など、いずれも用いることができる。マグネシウムイオンとしては、塩化マグネシウムなどの無機塩、リン酸マグネシウムなどの有機塩のいずれも用いることができる。 L-システインとL-シスチンは、それぞれ単独で、または混合して用いることができる。L-グルタミン酸、L-システインまたはL-シスチンおよびグリシンは、それぞれ１〜３００mmol/lの濃度で用いられる。 水性媒体としては、グルタチオンの生成反応を妨げない限り、いずれの媒体であっても良く、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液などがあげられる。また形質転換体を培養して得られる培養物の上清をそのまま水性媒体として用いることもできる。 また上記水性媒体には必要に応じて界面活性剤または有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤または有機溶媒を添加することにより、グルタチオンの生産効率をあげることができる。界面活性剤および有機溶媒の種類、並びに濃度は上記した菌体を処理するときのものと同じである。 グルタチオンを生成させる反応は、温度を１０〜７０℃、好ましくは２０〜４０℃、pHをpH４〜１０、好ましくは６〜９の範囲で調整しながら、１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間行う。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。 グルタチオンの生成反応終了後、１〜２０時間、好ましくは５〜１７時間、より好ましくは８〜１５時間、無通気、無撹拌のまま反応液を放置しておくことにより、反応液中のグルタチオンを還元することができる。 上記方法により取得したグルタチオンを含有する培養物を遠心分離、または膜処理することによりグルタチオンを含有する培養液を取得することができる。 反応終了後、反応液を遠心分離または膜処理などすることにより沈殿物を除去する。得られた反応液に、亜酸化銅を添加することにより、グルタチオンの銅塩錯体を取得することができる。該銅塩錯体を洗浄後、硫化水素により銅を除去してから、活性炭脱色を行い、減圧濃縮などにより反応液を濃縮することにより、グルタチオンを５００〜７００g/lの濃度で含むグルタチオン含有溶液を取得することができる。 グルタチオンが溶解している溶液に、グルタチオンの結晶を種晶として添加する。種晶の添加量は１０〜５００mg/l、好ましくは２０〜２００mg/l、より好ましくは３０〜１００mg/lである。種晶添加後は、０〜４５℃、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３５℃で５〜３０時間、好ましくは１０〜２５時間、より好ましくは１５〜２０時間攪拌する。 その後、該グルタチオン溶液と等量の５０〜７０%v/v濃度のメタノール、エタノール、アセトンなどの水溶性有機溶媒の水溶液、好ましくはエタノール水溶液を０〜４５℃、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３５℃で、１〜１０時間、好ましくは２〜８時間、より好ましくは３〜６時間かけて添加した後、０〜３０℃、好ましくは０〜２５℃、より好ましくは０〜２０℃に冷却し、その後さらに３０分〜１０時間、好ましくは１〜８時間、より好ましくは２〜５時間攪拌をつづけることにより、結晶スラリーを取得することができる。 該結晶スラリーを０〜１５℃、好ましくは０〜１３℃、より好ましくは０〜１０℃に冷却した後、バスケット型遠心分離機などを用いて結晶を分離し、乾燥機で３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃で１〜４８時間、好ましくは５〜３６時間、より好ましくは１０〜３０時間乾燥することにより、本発明のグルタチオンの結晶を取得することができる。 種晶添加後の攪拌時間、および有機溶媒の添加時間および温度などを上記範囲内で制御することにより、平均幅が７〜４０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μmの範囲にある所望のグルタチオンの結晶を調製することができる。 また、上記方法で得られたグルタチオンの結晶を市販の粉砕機、および乳鉢などを用いて粉砕することにより、晶析によって得られた結晶よりも平均幅、および平均粒径が小さい本発明のグルタチオンの結晶を取得することができる。粉砕機を用いる場合は、回転数、投入速度およびスクリーン目の調整、乳鉢を用いる場合は、すり潰す時間の調整により所望の平均幅および平均粒径を有する本発明のグルタチオンの結晶を取得することができる。 なお、本明細書における結晶の平均幅、平均粒径、安息角、および粗比容積は以下のように測定した。（１）平均幅 デジタルマイクロスコープＶＨ−８０００（株式会社コーエンス）を用いて結晶を観察、撮影し、結晶約３００個についてその幅を測定し、算出した。（２）平均粒径 体積基準メジアン径と同義であり、レーザー回折・散乱式粒度分布測定装置SK LASER MICRON SIZER LMS-24(セイシン企業株式会社)を用いて測定し、累積重量５０％粒径で表した。（３）安息角 三輪式円筒回転法安息角測定器を用いて測定し、３回測定した平均値として表した。（４）粗比容積 日本薬局方に準拠して測定したかさ密度測定値の逆数で表した。グルタチオンの結晶の製造１ 下記の方法で用いたE. coli RC912/pBR325-gshI・II（FERM BP-337）は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターから入手可能である。 またE. coli RC912/pBR325-gshI・II は、以下の方法によっても作製することができる。すなわち、特開昭58-20196号（US4596775）およびJ. Gen. Microbiol., 128, 1047-1052(1982) に記載の方法に従い、グルタチオンによるγ−グルタミルシステイン合成酵素の阻害が解除された変異株（E. coli RC912）を作製する。E. coli RC912はFREM BP-47として上記した特許生物寄託センターから入手することもできる。 次に特開平2-31690号（EP107400）およびAppl. Environ. Microbiol., 44, 1444-1448 (1982) に記載の方法に従い、大腸菌RC912株染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素構造遺伝子を含むPstI断片を、プラスミドpBR322上にクローニングする。 さらに特開平2-31690号およびAgric. Biol. Chem., 47, 1381-1383 (1983) に記載の方法に従い、E. coli RC912株染色体上のグルタチオン合成酵素構造遺伝子を含むHindIII断片を、プラスミドpBR322上にクローニングする。また特開平2-31690号およびBioprocess Technol., 19, 159-183(1994) に記載の方法に従い、それら二つのクローン化断片を一つのベクタープラスミドpBR325上に導入し、特開平2-31690号またはBioprocess Technol., 19, 159-183(1994) に記載のpBR325-gshI・IIを作製することができる。 E. coli RC912/pBR325-gshI・II（FERM BP-337）を、10mlの種培地（1g/l グルコース、10g/l バクトトリプトン、5g/l 酵母エキス、5g/l 塩化ナトリウム、pH7.2に調整）に植菌し、30℃で16時間培養して得られた培養物を、さらに300mlの種培地に植菌し、30℃で8時間培養した。 得られた培養物を10Lの主培地（10g/l グルコース、10g/l ペプトン、10g/l 酵母エキス、5g/l 肉エキス、1g/l 硫酸マグネシウム・7水和物、5g/l リン酸二水素カリウム、pH7.0に調整）に添加した。培養は、28℃、600rpm、10L/minの通気条件下で30時間培養した。 該培養物に900g/l グルコース、1g/l リン酸水素二ナトリウム、5g/l 硫酸マグネシウム・7水和物、1.5g/l フィチン酸、3.5g/l 硫酸カリウム、8g/l ナイミーンＳ−215（日本油脂社製）、10ml/l キシレン、25mmo/l グルタミン酸ナトリウム、25mmo/l グリシン、25mmo/l L-シスチンになるように各成分を加えて、pH7.2に調整し、34℃、600rpm、10L/minの通気条件下で7時間反応を行った。その後、反応液中のグルタチオンを還元するため、無通気、無撹拌の状態で13時間置した。 反応液を遠心分離して沈殿物を除去した後、亜酸化銅を添加して、グルタチオン銅塩錯体を得た。該銅塩錯体を洗浄し、硫化水素により脱銅を行った後、活性炭脱色を行い、減圧濃縮することで、グルタチオンを600g/lの濃度で含むグルタチオン溶液を取得した。 次に該グルタチオン溶液に、0.005gのグルタチオン結晶（株式会社興人製）を種晶として添加し、25℃で15時間攪拌した。その後、該グルタチオン溶液と等量の58%v/v濃度のエタノール水溶液を25℃で4時間かけて添加した後、15℃に冷却し、その後さらに3時間攪拌をつづけ、結晶スラリーを取得した。 該結晶スラリーを10℃に冷却した後、バスケット型遠心分離機で結晶を分離し、箱型乾燥機で40℃で24時間乾燥することにより、平均幅が25μm、平均粒径が52μmのグルタチオンの結晶（α晶）を得た。グルタチオンの結晶の製造２ 実施例１で得られたグルタチオンの結晶を乳鉢および乳棒を用いてすり潰した。結晶の平均幅および平均粒径を随時測定しながら操作を続け、平均幅が14μm であり、平均粒径が26μmのグルタチオンの結晶、および平均幅が7μm であり、平均粒径が11μmのグルタチオンの結晶を取得した。グルタチオンを含有する錠剤の製造 実施例１および２で取得したグルタチオンの結晶および、還元パラチノース（新三井製糖）、ショ糖脂肪酸エステル（第一化学工業）を表１の配合比率で混合し、ポリエチレン袋内で十分混合した。混合した粉末を単発打錠機（堅型成型機6B-２M、菊水製作所）を用いて直接圧縮成形し、直径９ｍｍ、３００ｍｇの錠剤を製造した。打錠圧を７６４ＫＧに設定した。錠剤硬度はKHT-20N硬度測定器（藤原製作所）を用いて計測した。打錠障害は認められず、また錠剤硬度の値も十分な錠剤が得られた。比較例１ 実施例１および２で得られたグルタチオンの結晶と市販のグルタチオン（市販品Ａ）の結晶の平均幅、平均粒径、安息角および粗比容積を比較した（表２）。 実施例１および２で取得したグルタチオンの結晶は柱状であるのに対し、市販品Ａは針状結晶であった。またグルタチオンの結晶として市販品ＢおよびＣについても、その結晶の平均幅を測定したところ、いずれも3μmであり、市販品Ａと同様、針状結晶で、ボソボソとした物性であった。比較例２ 市販のグルタチオンの結晶（市販品Ａ）を用いて実施例２と同様の方法でグルタチオンを含有する錠剤の製造を試みた。結果を表３に示す。 本発明のグルタチオンの結晶を用いた場合、実施例３に示すようにグルタチオンを３０％含む錠剤を成型することができたが、市販品Ａを用いた場合、原料が打錠機の臼に均一に充填されなかったため、錠剤そのものを製造することができなかった。比較例３ 実施例１で得られたグルタチオンの結晶と市販のグルタチオンの結晶（市販品Ａ）の水への溶解性を以下の方法で比較した。 37℃に保温した200mlの脱イオン水に、それぞれの結晶を12g投入し、120rpmで撹拌したときの投入時から完全に結晶が溶解するまでの時間を測定した。結果を表４に示す。 表４に示すように、本発明のグルタチオンの結晶の溶解性は市販品Ａより良好であることがわかった。 本発明の結晶は、流動性、充填性、打錠性および溶解容易性に優れており、工業的に有用である。平均幅が７〜４０μmであり、かつ平均粒径が１０〜６０μmであり、かつ粗比容積が２．０〜５．０cm3/gであるグルタチオンのα型結晶。請求項１に記載のグルタチオンのα型結晶を含有する錠剤。グルタチオンが溶解している水溶液にグルタチオンの結晶を種晶として添加した後、０〜４５℃で５〜３０時間攪拌し、その後、該水溶液にエタノール水溶液を１０〜３５℃で１〜１０時間かけて添加することにより、該水溶液中にグルタチオンを晶析させ、該水溶液からグルタチオンのα型結晶を採取することを含む請求項１に記載のグルタチオンのα型結晶の製造法。