生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_インフルエンザウイルスの増殖方法 |
| 出願番号： | 2008515529 |
| 年次： | 2013 |
| IPC分類： | C12N 7/00,C12N 5/07,C12N 5/02 |
特許情報キャッシュ
野内 俊伸 西山 清人 菅原 敬信 JP 5322636 特許公報(B2) 20130726 2008515529 20070511 インフルエンザウイルスの増殖方法 一般財団法人化学及血清療法研究所 000173555 田中 光雄 100081422 山崎 宏 100084146 冨田 憲史 100122301 山中 伸一郎 100156111 野内 俊伸 西山 清人 菅原 敬信 JP 2006132049 20060511 20131023 C12N 7/00 20060101AFI20131003BHJP C12N 5/07 20100101ALI20131003BHJP C12N 5/02 20060101ALI20131003BHJP JPC12N7/00C12N5/00 202ZC12N5/02 Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８ ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ） 特表２０００−５０７８２５（ＪＰ，Ａ） 国際公開第０１／０９４８４６（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第２００５／０２６３３３（ＷＯ，Ａ１） 3 JP2007059730 20070511 WO2007132763 20071122 10 20100323 水落 登希子 本発明は、組織培養におけるインフルエンザウイルスの増殖方法に関する。より詳細には、MDCK細胞（犬腎臓由来の株化細胞）の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを、培地又は緩衝液で洗浄することにより除去又は低減した後、該細胞にインフルエンザウイルスを接種し、該インフルエンザウイルス接種細胞を高濃度トリプシン含有培地にて高密度で培養することを特徴とする、インフルエンザウイルスの増殖方法に関する。 インフルエンザウイルスは、直径約1万分の1ミリ（100nm）の多形性のオルソミクソウイルス科のRNAウイルスで、このウイルスがヒトに感染した場合は、38℃以上の発熱、頭痛、関節痛、筋肉痛などに加えて、咽頭痛、鼻汁、咳などの症状が見られる。インフルエンザウイルスは、鼻腔や咽頭粘膜表面の上皮細胞にあるシアル酸に吸着し、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれたのち、膜融合によってリボヌクレオプロテイン（RNP）が細胞内に放出される。このRNPは細胞核へ輸送され、細胞の転写・翻訳システムでウイルスゲノムにコードされたウイルスの各構成成分が合成され、細胞由来の脂質膜を使って細胞表面上にウイルス粒子が形成される。ウイルス粒子は、ウイルス自身のノイラミニダーゼの働きにより細胞から切り離され、細胞外へ放出される。 インフルエンザウイルスにはA，B，Cの3型があり、流行的な広がりを見せるのはA型とB型である。A型とB型ウイルス粒子表面には赤血球凝集素（HA）とノイラミニダーゼ（NA）という糖蛋白があり、これらが感染防御免疫の標的抗原となっている。とくにA型では、HAには15亜型、NAには9亜型の抗原性の異なる亜型が存在し、これらの様々な組み合わせを持つウイルスが、ヒト以外にもブタやトリなどその他の宿主に広く分布している。このため、人獣共通感染症として動物由来の亜型ウイルスがヒトの世界にも侵入する。 インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子表面に存在する赤血球凝集素（HA）がHA1+HA2へ開裂することにより感染力を獲得し、感染が多段階に進行する。このHAの開裂は、トリでは、標的臓器である腸や気道から分泌されるトリプシン様のプロテアーゼにより行われる。このようにして、HAが開裂活性化されることで、その臓器における感染が進行し、病原性が発現する。また、木戸らは、インフルエンザウイルスの感染メカニズムの研究から、感染成立には、宿主由来のプロテアーゼ（トリプターゼクララ）によるウイルス表面のHA抗原の解裂活性化が重要であることを示した（例えば、非特許文献１参照）。 現行のインフルエンザワクチンは、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵の尿膜腔内に接種して培養、増殖させ、漿尿液から遠心にて濃縮・精製し、ウイルス粒子をエーテル又は界面活性剤等で処理し、その副反応の原因と考えられる脂質成分の大部分を除去したHA画分浮遊液とし、更にホルマリンで不活化（病原性をなくすこと）したスプリットワクチン又はウイルス粒子を界面活性剤で破砕後更に精製を行ったサブユニットワクチンである。このように、インフルエンザワクチンは有精卵から作られるため、急な大量生産は出来ないので、毎年種々の状況を検討し、生産量が慎重に決められている。 組織培養によるウイルスの増殖方法として、Vero細胞でヒトインフルエンザウイルスを培養する際に、インフルエンザウイルスの増殖サイクルを通して、培養培地中に約0.05μg/mlの最少濃度(好ましくは、約0.05μg/mlと約0.5μg/ml)のトリプシンの存在下で行う方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、この方法はインフルエンザウイルス感染動物から効果的に当該ウイルスを単離する方法であって、ワクチン製造に適した方法を開示するものではない。特許公表平１１−５０９０８１FEBS LETTERS, 322, p115-119 (1993) 前述したように、発育鶏卵を用いたインフルエンザウイルスの生産方法は、ウイルス生産量の安定性の面で問題がある。これに替わるウイルス生産方法として、組織培養方法によるウイルスの生産方法が挙げられるが、これまでに、ワクチン製造に十分なウイルス量を得る方法が開発されているとは言い難い。 したがって、本発明はインフルエンザワクチンの開発において、そのワクチン材料となるウイルスを十分に確保する為の新規なウイルス増殖方法を提供することを目的とする。 本発明者等は、上記の目的を達成する為に鋭意研究を重ねた結果、MDCK細胞の培養液中にトリプシンインヒビター活性を有する物質が分泌されることを発見し（特願2004-329966、特願2005-184500）、インフルエンザウイルスをMDCK細胞に接種する前に、培地又は適当な緩衝液で細胞を洗浄し、培養液中に分泌されたトリプシンインヒビターを除去又は低減することにより、インフルエンザウイルスの産生量が増加することを発見した。更に、インフルエンザウイルス感染細胞を培養する際にトリプシンを添加すると一定のトリプシン濃度の範囲においてその効果が増大することを突き止め、本発明を完成するに至った。 したがって、本発明は、以下に示すインフルエンザウイルスの増殖方法を提供するものである。１．インフルエンザウイルス感受性細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを、培地又は緩衝液で洗浄することにより除去又は低減した後に、該細胞にインフルエンザウイルスを接種し、該インフルエンザウイルス接種細胞を培養することを特徴とするインフルエンザウイルスの増殖方法。２．0.45〜2.7U/mLのトリプシンを含有する培地でインフルエンザウイルス接種細胞を培養することを特徴とする、上記１の増殖方法。３．下記（１）ないし（５）の工程からなる上記１記載の増殖方法：（１）細胞培養物を低速遠心又は膜ろ過により培養上清と細胞を分離する工程、（２）細胞を培地又は緩衝液で洗浄する工程、（３）細胞にインフルエンザウイルスを接種する工程、（４）インフルエンザウイルス接種細胞を培養する工程、及び（５）前記インフルエンザウイルス接種細胞の培養時に終濃度が0.45〜2.7U/mLとなるようにトリプシン液を添加する工程。４．インフルエンザウイルスのm.o.iが0.0001〜0.01、初期ウイルス培養時におけるインフルエンザウイルス接種細胞の細胞密度が3〜11×106個/mLである、上記１ないし３の何れかの増殖方法。５．インフルエンザウイルス感受性細胞が、MDCK細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Vero細胞(アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞）、EBx細胞（ニワトリ胚幹細胞由来の株化細胞）、PER.C6（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）又はSK-NEP-1細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）からなる群より選択されることを特徴とする、上記１ないし４の何れかの増殖方法。６．浮遊培養によりインフルエンザウイルス接種細胞を培養することを特徴とする、上記１ないし５の何れかの増殖方法。 本発明の方法によれば、インフルエンザウイルスを大量生産する方法が提供される。インフルエンザウイルスを該ウイルス感受性細胞に接種する前に、細胞を培地又は適当な緩衝液で洗浄する。これにより、インフルエンザウイルスの増殖を阻害するトリプシンインヒビターが除去又は低減（培地交換率が50％以上）されるので大量のインフルエンザウイルスを培地中に生産させることができる。インフルエンザウイルス接種細胞を培養するときに、高濃度のトリプシン（0.45〜2.7U/mL）を含有させることによりインフルエンザウイルスの生産量を更に増大させることができる。好ましくは、高密度の細胞（細胞密度が3〜11×106個/mL）が使用される。これにより、培養液量あたりのウイルス産生量も、細胞数あたりのウイルス産生量も増え、精製時のウイルス処理液量を少なくすることができる。図１は、組織培養によるウイルス生産において、種々の初期細胞密度を用いたときの培地中のウイルス量を示したグラフである。図２は、A/New Caledonia株で50Lファーメンターを用い大量培養したときの培養プロファイルを示したグラフである。図３は、B/Shanghai株で50Lファーメンターを用い大量培養したときの培養プロファイルを示したグラフである。図４は、A/New Caledonia株で600Lファーメンターを用い大量培養したときの培養プロファイルを示したグラフである。 本発明は、インフルエンザウイルス感受性細胞を培地又は緩衝液で洗浄した後に、該細胞にインフルエンザウイルスを接種し、該インフルエンザウイルス接種細胞を培養する工程、場合によっては、インフルエンザウイルス感染細胞を培養するときに高濃度のトリプシンを含有させる工程、からなるインフルエンザウイルスの増殖方法によって特徴付けられる。 本発明に用いる細胞は、インフルエンザウイルスに感受性であれば如何なる細胞も使用できる。このような細胞として、例えば、MDCK細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Vero細胞(アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞)、EBx細胞（ニワトリ胚幹細胞由来の株化細胞）、PER.C6（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）又はSK-NEP-1細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）が挙げられる。これらの細胞は、ATCC(American Type Culture Collection)に、それぞれCCL-34、CCL-81及びHTB-48として登録されたものであり、購入することができる。 培地は、通常細胞培養に用いられる培地、例えば、M202（JRH Bioscience社、特注品）、T7m（JRH Bioscience社、特注品）、EX-CELL293（JRH Bioscience社、14570）、EX-CELL MDCK（JRH Bioscience社、14580）、M199-earle base（日水）、イーグルMEM（E-MEM）（日水）、ダルベッコMEM（D-MEM）（日水）、SC-UCM102（日水）、UP-SFM（GIBCO BRL）、EX-CELL302（ニチレイ）、EX-CELL293-S（ニチレイ）、TFBM-01（ニチレイ）、ASF104（味の素）等が挙げられるが何れを使用しても良い。細胞の増殖時には、アミノ酸、塩類、抗カビ・抗菌剤等を添加した培地、あるいは、細胞の増殖効率を上げるために、植物由来加水分解産物等を添加した培地を用いることもある。しかしながら、細胞培養物を回収して精製を行う段階では、添加物を含まない培地が用いられる。ここで、細胞培養物とは、組織培養により培養した細胞と培地の混液をいう。インフルエンザワクチンの材料とするときには、全ての工程で当該加水分解物を添加しない方が好ましい。培地のpHは、適当な緩衝液（例えば、炭酸水素ナトリウム、HEPES）で動物細胞の増殖に適した6.5〜8、好ましくは、6.8〜7.3に調整される。 細胞培養の方法としては、培養器の底に細胞を付着させた静止培養、細胞を培地中に浮遊させて培養する浮遊培養が挙げられるが、工業生産レベルで行なうときは、浮遊培養が好ましい。浮遊培養の方法としては、マイクロキャリアなどの担体に細胞を付着させてこれを浮遊させて培養する方法又は担体を用いずに細胞を浮遊させて培養する方法等が挙げられるが、何れの方法を用いても良い。好ましくは、マイクロキャリアを使用しなくても浮遊培養することのできる浮遊培養用に馴化したMDCK細胞（以下、「浮遊化MDCK細胞」と称することもある）が用いられる。マイクロキャリアを使用する場合は、サイズ、形状、密度、表面荷電及び表面コート材質などタイプの異なる種々のマイクロビーズが市販されているので、この中から適宜選択して用いれば良い。例えば、サイトデックス、バイオシロン（ナルジェヌンクインターナショナル）、CELLYARD（ペンタックス社）などのマイクロビーズが挙げられるが、好ましくは、サイトデックス（Cytodex I，アマシャムバイオサイエンス社）である。当該サイトデックスの使用量は、培養液1Ｌあたり、1〜10ｇ、好ましくは、3〜5ｇである。 ウイルスを浮遊化MDCK細胞に接種する前に、新鮮な培地又は適当な緩衝液、例えば、PBS、トリス緩衝液により細胞の洗浄が行なわれるが、好ましくは、新鮮な培地が用いられる。これにより、細胞増殖に使用された培地が新鮮な培地に交換される。細胞の洗浄による培地交換率は、50％以上、好ましくは、75％以上、より好ましくは、100％である。具体的には、スピナ-フラスコ等で培養増殖したMDCK細胞を低速遠心又は膜ろ過し、細胞と培養上清に分離する。遠心沈渣又は膜ろ過濃縮液の細胞に新鮮培地を加え、細胞を懸濁することにより培地交換が行われる。培地交換率が低い場合は、この操作を繰り返すことにより100％（すなわち、ほぼ完全に新鮮な培地に交換されたことを意味する）の培地交換率を達成できる。こうして得られる細胞懸濁液に、インフルエンザウイルス液が添加され、一定条件下で培養が行なわれる。遠心分離後の細胞を少量の培地で懸濁した後、インフルエンザウイルスを接種し、その後、適当量の培地を加えても良い。場合によっては、培地にトリプシンが添加される。トリプシンはウイルス培養初期から培地中に含有させても良いし、培養している間に滴下する形で添加しても良い。 ウイルス培養開始時の初期細胞密度は3〜11×106cells/mLを用いることができるが、好ましくは、3〜8×106cells/mLである。より好ましくは、4〜7×106cells/mLの高密度である。 トリプシンは、通常細胞培養に用いられるトリプシン、例えば、豚由来のTrypsin250（DIFCO）、Trypsin（Merk,108444）、Trypsin cGMP（Sigma,T8395）、Trypsin(1:250)（GIBCO）、結晶トリプシン（和光、207-09891）や牛由来のTrypsin結晶（関東化学）、遺伝子組換えのTrypZean（Sigma）、rProtease（GIBCO）等が挙げられるが何れを使用しても良い。トリプシンは、水、緩衝液、培地等に溶解したトリプシン溶液が用いられる。本発明では、終濃度0.45〜2.7U/mLのトリプシンが使用される。好ましくは、0.45〜1.8U/mL、更に好ましくは、0.45〜0.9U/mLである。インフルエンザウイルスとしては、国立感染症研究所から分与されたA/New Caledonia株、B/Shandong株、A/Wyoming株などが使用される。インフルエンザウイルス感染患者から直接分離したウイルスを使用することもできる。インフルエンザウイルスを分離するときは、ウエブスター等が開示した低い感染多重度でインフルエンザウイルスを複製する方法に従えば良い（特表平11-509081）。簡単には、インフルエンザウイルスの分離は、インフルエンザの臨床徴候を有する患者の喉の洗浄物を細胞に加え、該細胞を約1％トリプシン含有培地で培養することにより行なわれる。本発明の実施例では、A/New Caledonia株又はB/Shandong株が使用される。組織培養に使用するインフルエンザウイルスは、通常のウイルス感染に使用されるm.o.i 0.00001〜0.01で使用すればよい。好ましくは、m.o.i 0.001〜0.0001である。 培養条件は、細胞の種類、ウイルス接種量及び培養スケール・方法等の組み合わせにより適切に調節される。例えば、培養温度は、32℃〜38℃、好ましくは33〜34℃、培養期間は、3〜5日間、好ましくは3〜4日間、炭酸ガス濃度は4〜6％、好ましくは、5％、酸素濃度は、2〜10ppm、好ましくは、3ppmが使用される。 細胞密度の測定は、血球計算盤等による一般的な方法に従って行えばよい。培地中のウイルス含量は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（HA）に対する抗体を用いたELISA（μg/mL）あるいはニワトリ血球を用いた血球凝集法（希釈倍数）により測定される。本発明の実施例では、ELISAによりウイルス含量を測定した。 HAに対する抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が使用できる。感度、特異性などを検討し、目的に合致した抗体を選択すれば良い。ポリクローナル抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として精製HAを必要に応じてフロイントの完全アジュバントや不完全アジュバント等の適切なアジュバントとともに腹腔内投与、皮下投与、皮内投与あるいは静脈内投与し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血し抗血清を得る。免疫する動物は、特に制限されることはない。例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる様な動物種を選択して使用すればよい。ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。抗体の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。 モノクローナル抗体は、以下の方法により得ることができる。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、例えば、Milsteinらの方法（Method Enzymol., 73, 3−46, 1981）に従って、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。マウスミエローマ細胞としては、NSI-Aｇ4/1（Eur. J. Immunol., 6:511, 1976）、P3X63-Ag8.U1（Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81:1, 1978）、X63-Ag8.653（J. Immunol., 123:1548, 1979）等を使用することができる。ハイブリドーマは、未融合細胞が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間HAT培地中で培養することにより得られる。かくして得られるハイブリドーマに対し、その培養上清を用いて、通常の限界希釈法に従い、目的とする抗体産生株の選択及びクローン化が行われる。HAに特異的に結合する抗体を産生しているクローンの選択は、一般的に使用されるELISA法、RIA法、ウエスタンブロット法等の分析方法を用いれば良い。抗体の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の上述した公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。また、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al.、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK）によりHAと結合する抗体を作製することもできる。 こうして得られるHAに対する抗体は、HA抗原を検出する為の抗原−抗体測定系（例えば、ELISA）に組込まれる。ELISA用プレートは、種々の製品が市販されているのでこれらを使用すればよい。本発明で使用するHA抗原測定用ELISA系の構築は、以下のように行なわれる。96ウェルプレート（Nunc社）にHA抗体液（自家製抗血清をPBSで1000倍希釈）を入れ、4〜10℃、1夜静置することにより、HA抗体を吸着させる。HA抗体液を除去した後、適当な洗浄液（例えば、Tween20を含むリン酸緩衝液）で洗浄後、ブロックエース、スキムミルク等でHA非吸着部分をコーティングする。こうしてELISAプレートが作製される。HA抗原を測定するときは、インフルエンザ感染細胞を培養した培地を上記のELISA用プレートに入れ、37℃で1時間放置する。上記の洗浄液で洗浄後、RI、DIG、蛍光などで標識した抗HAウサギ抗体又は抗モルモット抗体を添加し、更に37℃で1時間放置する。上記の洗浄液で洗浄後、発色液（例えば、TMB+ Substrate-Chromogen、POD）を加え、発色させる。これを波長450nmで測定し、検量線からHA抗原量を測定する。本HA抗原測定系の感度は、3ng/mLである。 以下、実施例にて具体例を示す。特に断りのない限り、和光純薬、ナカライテスク社の試薬を使用した。 インフルエンザウイルスの高密度培養におけるトリプシン濃度の影響（１）A/New Caledonia株の高密度培養 T7m培地（JRH社）で浮遊培養した犬の腎臓細胞（MDCK）を低速遠心分離（2000rpm×3min）し、初期細胞密度3.16×106cells/mLとなるように新鮮T7m培地50mLに懸濁した。これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株（m.o.i 0.001）と各濃度のトリプシン（DIFCO、Trypsin250）を添加し、250mLシェイカーフラスコを用いて100rpm、34℃、5%CO2の培養条件下で培養した。ウイルス量は、HAに対する抗体を用いたELISA法により測定した。すなわち、抗HA抗体液でコートした98ウェルELISAプレート（Nunc社）に各培養液100μLを加え、37℃で、１時間放置した。PBSで洗浄後、HRPで標識した抗HA抗体100μLを加え、37℃で、１時間反応後、発色液100μLを加え、10分放置した。マイクロプレートリーダー（BIO-TEK社）により、波長450nmで測定した。コントロール（あるいは検量線）は精製ウイルスを用い、吸光度の値によりウイルス量を算出した。その結果を表１に示す。培地中のウイルス量は、トリプシン（DIFCO、Trypsin250）濃度0.9〜2.7Tryp.U/mLの範囲で高い値を示した。ウイルス量の単位はμg/mL、NDは未測定を示す。（２）B/Shanghai株の高密度培養 インフルエンザウイルスB/Shandon株（m.o.i 0.001）の高密度培養を行なった。トリプシン含量の変更と初期細胞密度3.83×106cells/mLを用いた以外は、実施例１−（１）と同様に行なった。その結果を表２に示す。培地中のウイルス量は、トリプシン濃度0.45〜1.8Tryp.U/mLの範囲で高い値を示した。ウイルス量の単位はμg/mL、NDは未測定を示す。 A/New Caledonia株の高密度培養における培地交換率の影響 T7m培地（JRH社）で浮遊培養したMDCK細胞を低速遠心分離（2000rpm×3min）し、沈渣の細胞と培養上清を分離した。この培養上清と新鮮T7m培地とを適当に混合して沈渣細胞に添加し、初期細胞密度4.21×106cells/mLとなるように細胞懸濁液を調整した。この細胞懸濁液50mLに、終濃度1.8Tryp.U/mLトリプシン液を加え、実施例１−（１）と同じ条件でウイルス感染細胞を培養し、培養液中のウイルス量を測定した。その結果を表３に示す。75％の新鮮T7m培地交換でウイルス量はプラトウに達し、それ以上の新鮮T7m培地交換ではウイルス量は横這いであった。ウイルス量の単位はμg/mL、NDは未測定を示す。 A/New Caledonia株の高密度培養における細胞密度の影響 T7m培地（JRH社）で浮遊培養したMDCK細胞を低速遠心分離（2000rpm×3min）し、初期細胞密度3〜11×106cells/mLとなるように新鮮T7m培地50mLに懸濁した。これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株（m.o.i 0.001）と1.8Tryp.U/mLのトリプシン（DIFCO、Trypsin250）を添加し、培養した。培養は、実施例１−(1)と同じ条件で行なった。その結果、培養液中のウイルス量は、細胞密度が3〜7×106cells/mLの範囲において細胞濃度に依存して増加し、その後プラトウに達した（図１）。 インフルエンザウイルスの培地交換後の高密度培養における大量生産 50L/50Lファーメンターを用いEX-CELL293培地（JRH社）で浮遊培養したMDCK細胞を無菌的に膜ろ過により培養上清を除去し、培地交換率が75％となるように新鮮EX-CELL293培地を添加した。初期細胞密度は5.9×106cells/mLとなった。これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株（m.o.i 0.001）と1.8Tryp.U/mLのトリプシン（Sigma、Trypsin cGMP）を添加し、50L/50Lファーメンターでウイルス培養した（図２）。培養条件として、50rpm、34℃、3ppm O2を用いた。培養４日目の培地中のウイルス量を実施例１と同じ方法で測定した。その結果、ウイルス量は、120μg/mL（初期細胞密度あたりの産生量：20μg/106cells）に達した。 B/Shanghai株についても同様に培養し、ウイルス生産量を調べた。このとき初期細胞密度3.3×106cells/mL、培地EX-CELL293、トリプシン濃度0.9Tryp.U/mLを用い、それ以外は、上記のA/New Caledonia株の場合と同じ条件で行なった（図３）。その結果、培養4日目で、ウイルス量は、60μg/mL（初期細胞密度あたりの産生量：18μg/106cells）に達した。A/New Caledonia株の培地による希釈でのインヒビター低減の影響 600Lファーメンターを用いM202培地（JRH社）で浮遊培養したMDCK細胞を新鮮M202培地で２倍希釈し、初期細胞密度1.53×106cells/mLとした。この細胞希釈液646Lに、終濃度0.23U/mLトリプシン液を加え、これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株（m.o.i 0.001）を添加し、600L培養槽を用いて50rpm、34℃、3ppm O2の培養条件下で培養した（図４）。培養４日目の培地中のウイルス量を実施例１と同じ方法で測定した。その結果、ウイルス量は、12.8μg/mL（初期細胞密度あたりの産生量：8.5μg/106cells）であった。 本発明のインフルエンザウイルスの生産方法は、インフルエンザワクチンの材料を大量に取得する方法として利用できる。 インフルエンザウイルス感受性細胞を無血清培地で培養し、当該インフルエンザウイルス感受性細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを、無血清培地又は緩衝液で洗浄することにより除去又は低減した後に、該細胞にインフルエンザウイルスを接種し、該インフルエンザウイルス接種細胞を0.45〜1.8U/mLのトリプシンを含有する無血清培地で浮遊培養により培養することを含み、インフルエンザウイルスのm.o.iが0.0001〜0.01かつ初期ウイルス培養時におけるインフルエンザウイルス接種細胞の細胞密度が3〜11×106個/mLであり、前記無血清培地が、T7m培地、EX-CELL293培地およびM202培地よりなる群から選ばれることを特徴とする、培養液量あたりのウイルス産生量および細胞数あたりのウイルス産生量がともに増大したインフルエンザウイルスの大量増殖方法。 下記（１）ないし（５）の工程からなる請求項１記載の増殖方法：（１）無血清培地で培養された細胞培養物を低速遠心又は膜ろ過により培養上清と細胞を分離する工程、（２）前記（１）の工程により得られた細胞を無血清培地又は緩衝液で洗浄する工程、（３）前記（２）の細胞にインフルエンザウイルスを接種する工程、（４）前記（３）のインフルエンザウイルス接種細胞を無血清培地で培養する工程、及び（５）前記（４）のインフルエンザウイルス接種細胞の培養時に終濃度が0.45〜2.7U/mLとなるようにトリプシン液を培養液に添加する工程。 インフルエンザウイルス感受性細胞が、MDCK細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Vero細胞(アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞)、EBx細胞（ニワトリ胚幹細胞由来の株化細胞）、PER.C6（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）又はSK-NEP-1細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の増殖方法。