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| タイトル： | 公開特許公報(A)_非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法及びその装置 |
| 出願番号： | 2008220313 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | A61B 5/00,G01N 21/27,A61B 5/107 |
特許情報キャッシュ
宗田 孝之 中村 厚 大坪 真也 會沢 勝夫 永岡 隆 古川 雅代 JP 2010051589 公開特許公報(A) 20100311 2008220313 20080828 非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法及びその装置 学校法人早稲田大学 899000068 静岡県 590002389 一丸ファルコス株式会社 000119472 牛木 護 100080089 吉田 正義 100137800 清水 栄松 100119312 宗田 孝之 中村 厚 大坪 真也 會沢 勝夫 永岡 隆 古川 雅代 A61B 5/00 20060101AFI20100212BHJP G01N 21/27 20060101ALI20100212BHJP A61B 5/107 20060101ALI20100212BHJP JPA61B5/00 MG01N21/27 BA61B5/10 300QA61B5/00 101AG01N21/27 FG01N21/27 E 8 1 ＯＬ 17 （出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願 2G059 4C038 4C117 2G059AA01 2G059BB12 2G059CC16 2G059CC18 2G059EE01 2G059EE02 2G059EE12 2G059EE13 2G059FF03 2G059HH02 2G059HH06 2G059JJ05 2G059JJ11 2G059JJ19 2G059KK04 2G059MM01 2G059MM12 2G059NN01 2G059PP04 4C038VA20 4C038VB22 4C038VC01 4C117XA05 4C117XB20 4C117XD05 4C117XE03 4C117XE33 4C117XE43 4C117XJ13 本発明は、非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法及びその装置に関する。 可視−近赤領域でのメラニンの光吸収特性については、長波長化に伴い単調減少スペクトルを示し、メラニン量が増えれば波長領域全域でスペクトル強度が増加することが知られている。従来の技術では、吸光度スペクトル強度をメラニン量に見立てることによって、ある波長（或いは波長バンド）での吸光度スペクトル強度分布をもってメラニン分布としていた。或いは、可視−近赤全領域での拡散反射フルスペクトルから計算される色座標パラメータ、若しくはそれらを波長バンドで計測した光強度で代表させたもの、の強度分布をもってメラニン分布としていた。しかし、これらの方法は、メラニン分布状態を定性的に観察するものであり、定量的にメラニン分布を測定するものではなかった。 また、皮膚から計測した拡散反射スペクトルを分解してメラニン量を推定する方法も知られている（特許文献１）。この方法では、メラニンを含む色素自体の吸収或いは吸光度スペクトルが既知であることが前提となる。しかし、合成メラニンの吸収或いは吸光度スペクトルは分かっているものの、人体内で産生されるメラニンを含む色素自体の本当の吸収或いは吸光度スペクトルがどのようなものかは未だ分かっていないため、正確な定量ができなかった。 このため、光スペクトルを利用してヒト皮膚メラニンを正確に定量しようとするとき、バイオプシー（生体採取）が避けられなかった。しかし、バイオプシーは人体に負担を強いることになり、好ましくない。国際公開ＷＯ２００５／０７９６６１号パンフレット そこで、本発明は、バイオプシーを行わずに、ヒト皮膚メラニンを正確に定量し、その分布を観察、表示することのできる、新規の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法及びその装置を提供することを目的とする。 本発明の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法は、産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚において拡散反射スペクトルを計測して空間的に平均された拡散反射スペクトルを求める第１のステップと、化学的に３次元モデル皮膚のメラニン量を定量する第２のステップと、第１のステップで求めた拡散反射スペクトル対して主成分分析を施してローディングベクトルとスコアを求める第３のステップと、第３のステップで求めたスコアと第２のステップで定量したメラニン量の関係を式（ここで、Ｓは拡散反射スペクトルデータ群より算出したスコア、Ｍは化学的手法によって求められたメラニン量）に当てはめて検量線を求める第４のステップと、計測対象物の拡散反射スペクトルを第３のステップで求めたローディングベクトルに射影することでスコアを算出する第５のステップと、第５のステップで求めたスコアを第４のステップで求めた検量線に当てはめて計測対象物のメラニン量を算出する第６のステップとを備えたことを特徴とする。 また、拡散反射スペクトルの波長域を６２０ｎｍ−７２０ｎｍとすることを特徴とする。 また、産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚において拡散反射スペクトルを計測して空間的に平均された拡散反射スペクトルを求める第１のステップと、化学的に３次元モデル皮膚のメラニン量を定量する第２のステップと、第１のステップで求めた拡散反射スペクトルから式（ここで、Ｒ１，２，…，ｎは光の拡散反射率、Ｔｉは第ｉ層の拡散透過率）を用いて各波長のｘｉ、ｙｉスペクトル強度を同定する第３のステップと、第３のステップで同定された各波長のｘｉ、ｙｉスペクトル強度と第２のステップで定量されたメラニン量との関係から検量線を求める第４のステップと、計測対象物の拡散反射スペクトルからｘｉ、ｙｉスペクトル強度を算出する第５のステップと、第５のステップで求めたｘｉ、ｙｉスペクトル強度を第４のステップで求めた検量線に当てはめて計測対象物のメラニン量を算出する第６のステップとを備えたことを特徴とする。 本発明の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置は、計測対象物に白色光を照射する白色光源と、前記計測対象物により拡散反射された光を分光する分光器と、この分光器により分光された拡散反射スペクトルを検出する検出器と、この検出器により検出された拡散反射スペクトルのデータが入力されるデータ処理装置と、前記白色光源からの白色光を直線偏光化しこの白色光の偏光面と垂直な直線偏光成分のみを前記分光器に入射させる偏光板とを備えたことを特徴とする。 また、前記データ処理装置には３次元モデル皮膚のメラニン量のデータが入力されるとともに、前記データ処理装置は、本発明の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法にしたがって計測対象物のメラニン量を算出可能に構成されたことを特徴とする。 また、前記検出器は、計測中央部に常に焦点を合わせることができる自動焦点機能を有していることを特徴とする。 また、顕微光学系機能を有することを特徴とする。 バイオプシーを行わずに、ヒト皮膚メラニンを正確に定量し、その分布を観察、表示することができる。 以下、本発明の好ましい実施形態について説明する。 はじめに、本発明による非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置の一実施例について図１と図２を参照して説明する。図１において、１は計測対象物Ｓを置くステージ、２は白色光源である。ステージの上方にはスリット３を備えた分光器４が設けられている。分光器４は、透過型グレーティングを搭載したイメージング分光器である。計測対象物の１ラインから反射した光はスリット３を通り、分光器で分光されて検出器たるＣＣＤカメラ５の受光面に結像する。すなわち、ＣＣＤカメラ５の受光面のＸ軸は計測対象物の１ライン上の位置に対応し、Ｙ軸方向は分光された光のスペクトルとなる。 図２に分光器４の詳細構造を示す。スリット３はスリット本体３ａと集光するためのレンズ３ｂとで構成されている。さらに２枚のレンズ４ａ、４ｃとの間にある透過型グレーティング方式のプリズム４ｂとにより構成されている。ＣＣＤカメラ５には、ＥＭ（Electron Multiplying）ＣＣＤカメラや光電子増倍管が搭載されたＣＣＤカメラなどを用いて、微弱な光にも感じるように感度を高めている。 この装置の光学的部分の構成はこのようになっているので、ＣＣＤカメラの１フレームで、計測対象物Ｓの１ラインの拡散反射スペクトルデータを取得できる。このデータはデータ処理装置６に入力される。続いて、ステージを微小な長さ動かして次の１ライン拡散反射スペクトルデータをＣＣＤカメラの次のフレームに取得し、データ処理装置に送る。この動作を繰り返すことにより、２次元の面の拡散反射スペクトルデータを取得できる。実際には、上記Ｘ軸に対応する計測対象物表面の１ラインに垂直な方向に掃引させる機構、例えば、調節手段７でステージをほぼ連続的に移動させながら、その動作に同期してＣＣＤカメラ５でデータを取得するようになっている。 また、図示しないが、本実施例の装置は、一組の偏光板を備えている。この偏光板により、白色光源２からの光が直線偏光化されるとともに、この直線偏光化された白色光源２からの光の偏光面と垂直な直線偏光成分のみを分光器４に入射させるようになっている。これにより、計測対象物Ｓの表面で生じる乱反射の影響が抑制されるようになっている。なお、この２つの直線偏光の向きは任意に設定できるように構成されている。 また、図示しないが、本実施例の装置は、計測中央部に常に焦点を合わせることができる自動焦点（ＡＦ）機能を有している。これにより、計測対象物Ｓの表面の比較的空間周波数の大きな凹凸に起因する影の影響を抑制することができるようになっている。 さらに、図示しないが、本実施例の装置は、色素病変と正常部との境界領域観察に優れる顕微光学系機能を有している。 そして、この装置は、搭載しているスリット３の光学スリット長と分光器４の光学系倍率が決める計測画面縦寸法と、スリット３の光学スリット幅と調節手段７の駆動ソフト設定が決める計測画面横寸法と、ＣＣＤカメラ５の１画素寸法、スリット３の光学スリット幅と分光器４の光学系倍率が決める１画素寸法、を２次元画像の基本長さスケールとして、２次元画像内各画素に分光器４の特性が決める波長範囲内の拡散反射スペクトルを格納できる。この装置は、位置の情報と拡散反射スペクトルの情報を、光学スリットの長手方向と垂直方向に掃引、すなわちラインスキャンすることで、短時間で取得可能である。取得した計測対象の拡散反射スペクトルの解析は、２次元スペクトル画像の描画を可能にする。したがって、この装置によれば、拡散反射スペクトルに定性的・定量的な違いがあれば、そのような光学的に違いがある領域を強調表示することができる。拡散反射スペクトルから色の三原色各要素値を計算して、それをもとに描画すれば、カラー写真と遜色ない擬似カラー画像も再構成できる。 つぎに、本発明による非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法について説明する。本発明による非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法は、非臨床シミュレーションという新しい概念に基づくものである。すなわち、角質層、顆粒層、有棘層、ヒト由来のメラノサイトを含む基底層からなる表皮に対する３次元モデル皮膚を、メラニンが産生、拡散される表皮のシミュレーターとする。一定条件のＵＶＢ照射下で２週間培養した３次元モデル皮膚の拡散反射スペクトルを計測すると同時に、そこで実際に産生されたメラニン量を化学的方法で定量する。これにより、計測された平均拡散反射スペクトルあるいはそれらから提案する数理モデル（後述）に基づいて抽出される各種パラメータ値と、実際のメラニン量との１：１対応が可能となる。さらにその数理モデルは、３次元モデル皮膚と実際の皮膚で計測される拡散反射スペクトル或いは抽出されたパラメータとを関係づけることができるので、実際のヒト皮膚で計測される拡散反射スペクトルからメラニン量を推定できることになる。その推定値は、生体内で合成されるメラニン高分子との関連が不明な合成メラニン高分子のスペクトルを用いる従来法に比べて、信頼性が高い。ヒト皮膚から計測される拡散反射スペクトルに基づいて最終的に描画される画像は、定量的な２次元メラニン量分布図を与える。以下、数理モデルＩ、IIについて詳細に説明する。 ［数理モデルＩ］ 主成分分析は本来統計的手法の一つであり、得られたデータ群から互いに独立した成分を導出する教師なしの多変量解析であり、現在、スペクトルを用いた定量法の一つとしてしばしば用いられている。元となる式は以下の通りである。 ここで、Ａは一つにつきＭ個の波長で計測されたＮ個のデータ群でありＮ×Ｍ行列となる。また、ＴはＮ×Ｍ行列のスコア、ＰはＭ×Ｍ行列のローディングベクトルと呼ばれる。 主成分分析を行うと、スペクトルを構成する波長の数Ｍと同じだけのローディングベクトルとスコアが得られる。このローディングベクトルはＭ次の多次元空間を構成する軸として捉えられ、スコアはその軸上の座標に相当する。データ群Ａが吸収スペクトルによって構成されている場合、ランベルト・ベール則からローディングベクトルは測定対象を構成する成分の一つが表す吸収スペクトル、スコアはその構成成分の量に対応すると考えられる。 データ群Ａが拡散反射スペクトルによって構成されている場合には、測定対象を多層として捉えることによりローディングベクトルは各界面からの反射率、スコアは成分量に対応すると考えられる。ただし、拡散反射測定では対象表面での正反射光が強いため、正しくメラニンの拡散反射スペクトルに対応するローディングベクトルを得ることが困難になる。これを解決するため、偏光板の導入は効果的である。 本発明では、上述した装置を用いて、まず、産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚において拡散反射スペクトルを計測し、空間的に平均された拡散反射スペクトルを求める。一方で化学分解法（chemical degradation method）を用いた化学的手法によるメラニン定量を行なう。この段階で、化学的に定量されたメラニン量に１：１で対応する平均拡散反射スペクトルが得られる。このデータ群に対して主成分分析を施し、メラニンの拡散反射スペクトルに対応するローディングベクトルとスコアを求める。 具体的には、ローディングベクトルとスコアはつぎのようにして求める。Ｎ×Ｍ行列で表されるデータ群Ａに関して期待値０とした共分散行列を求め、これに関して固有値問題を解くことで得られる固有ベクトルが全成分（Ｍ個）のローディングベクトルＰとなる。 ここで算出されたローディングベクトルは直交化されているので、Ｍ次元空間中の軸を表すと考えられる。Ｎ個のデータ中のｉ番目のものＡｉを第ｊ主成分のローディングベクトルＰｊに射影することで、スコアＴｊ，ｉが得られる。 つぎにスコアとメラニン量の関係、すなわち検量線を求める。なお、検討の結果、このとき以下の式がデータとベストフィットすることがわかっている。 ここで、Ｓは拡散反射スペクトルデータ群より算出したスコア、Ｍは化学的手法によって求められたメラニン量である。 同じ装置を用いて計測対象物であるヒト皮膚の拡散反射スペクトルをメラニンに対応する上で求めたローディングベクトルに射影することで、簡単にスコア量が算出できる。このスコア量を上述の検量線に当てはめると、メラニン量を算出できる。その結果、ヒト皮膚のメラニン量分布画像を描画可能である。 ヒト皮膚の構造は、表層から表皮、真皮、皮下組織となっており、真皮組織より奥には血管網が存在する。したがって、ヒト皮膚から計測する拡散反射スペクトルでは、メラニンスペクトルとヘモグロビンスペクトルが干渉している。本方法は、波長域を限定することで、ヘモグロビンスペクトルの影響を抑制することができる。例えば波長域６２０ｎｍ−７２０ｎｍを利用する。このようにしてもスペクトル干渉の影響を完全に除去することはできないと考えられるが、その簡便さゆえに極めて有用な方法である。 ［数理モデルII］ 本方法によれば、ヒト皮膚から計測される拡散反射スペクトルでのメラニンスペクトルとヘモグロビンスペクトルの干渉を原理的に１００％除去できる。 クベルカ（Kubelka）とムンク（Munk）は、色の見え方すなわち拡散反射の本質が、物質による光の吸収と散乱にあることを明らかにしている（P. Kubelka and F. Munk, Z. tech. Phys. 12, p593(1931)）。多層モデルを考え光の多重反射を考慮した理論はクベルカによって定式化されている。ｎ層モデルにおいて、第ｉ層の吸収係数をＫｉ、散乱係数をＳｉとすると、全層におけるもどり光の総和、つまり観察される光の拡散反射率Ｒ１，２，…，ｎは式（１）のように表される（P. Kubelka, Journal of the Optical Society of America 38, 5: pp.448-457, 1948, ibid. 44, 4: pp.330-335, 1954）。 Ｔｉは第ｉ層の拡散透過率を表す。第ｉ層の厚みをｄｉとし、とすると、式（１）は式（３）のように書き換えることができる。 式（３）に含まれる２ｎ個の未知変数ｘｉ、ｙｉがわかっていると、ｎ層の多層モデルにおける理論的な拡散反射率を得ることができる。逆に、理論的には、拡散反射率から適切な拘束条件下で２ｎ個の未知変数ｘｉ、ｙｉを逆算することが可能である。 実際のヒト皮膚では表皮、真皮などにおける変数を個別に計測することはほぼ不可能である。したがって、式（３）を用いて実験で得られた拡散反射スペクトルから、２ｎ個の未知変数ｘｉ、ｙｉを同定する作業に必要とされる拘束条件を見出す手法は、既知の合成メラニンスペクトルやヘモグロビンスペクトルに頼らざるをえない。本方法は、拘束条件として、ヒトの表皮における変数ｘｉ、ｙｉの初期値として、３次元モデル皮膚において求められた波長に依存する値を用いるという、これまでにない発想に基づいている。 ヒト３次元モデル皮膚をはじめとした各種培養細胞は一般に非常に薄く、その反射スペクトルを計測する場合、培養細胞に照射された光は細胞を透過し、その下に置かれた素材の反射・吸収の影響を強く受ける。そこで、本手法ではつぎのような工夫を加えることが望ましい。３次元モデル皮膚が入った石英ガラス製シャーレの下に、基準白色板を置く。この配置に対して、可視近赤光に対して透明である石英ガラス製シャーレを無視して、３次元モデル皮膚を第１層、下に置かれた基準白色板を第２層とする多層モデルを考え、３次元モデル皮膚固有の変数ｘｉ、ｙｉ（ｉ＝１）を求める。このモデルでは、式（３）においてＴ２＝０、Ｒ２＝Ｃ（一定値）とおくことができ、観察される反射率Ｒは第１層での多重散乱効果を考慮しない場合、式（４）のように表すことができ、考慮した場合、式（５）のように表すことができる。 式（４）において、波長ごとの未知変数はｘ１、ｙ１の２つである。ｘ１，ｙ１は式（２）に示したとおり、吸光係数・散乱係数に関連した変数であり、３次元モデル皮膚固有の変数である。そのようなｘ１、ｙ１は、式（５）を満たすように決定される。そして、式（６）にしたがってｘ１、ｙ１が求められる。 ただしＲｅｘｐは計測によって得られた３次元モデル皮膚の拡散反射率であり、λは計測したスペクトルの波長範囲にわたって和を取ることを意味する。未知変数の最適化には、例えば、ガウス・ニュートン法（非線形最小二乗法）を用いることができる。 これらの演算には位置情報は含まれないため、計測対象に含まれる全ての点（計測に用いるＣＣＤカメラの画素寸法が決める）における拡散反射スペクトルに対して個別にｘ１、ｙ１スペクトルを算出することができる。したがって、各波長におけるｘ１、ｙ１の２次元分布を描画できる。このことはメラニンの２次元分布描画を可能にすることを意味する。その具体的方法を以下に述べる。 数理モデルＩで述べたように、産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚において拡散反射スペクトルを計測し、空間的に平均された拡散反射スペクトルを求める。一方で化学分解法を用いた化学的手法によるメラニン定量を行う。次に、平均拡散反射スペクトルからｘ１、ｙ１スペクトルを同定する。この後、例えば各波長のｘ１、ｙ１スペクトル強度と、メラニン量との関係を求めれば、検量線が得られる。これを用いれば、ｘ１、ｙ１スペクトルからメラニン量を推定することができる。 つぎに、ヒト皮膚のメラニン量推定法について説明する。既に述べたように、ヒト皮膚の構造は、表層から表皮、真皮、皮下組織となっており、真皮組織より奥には血管網が存在する。したがって、拡散反射スペクトルでは、メラニンスペクトルとヘモグロビンスペクトルが干渉している。 本方法は式（３）に示したとおり多層に展開が可能であるので、皮膚の物理的構造を反映させたモデルに対する理論式導出が可能である。最も簡単なモデルは、２層モデルである。そこでは有限の厚さをもった表皮層と奥行き無限大と簡略化した真皮層を考える。モデルに基づいて理論式を導出すると、必要となるパラメータは、表皮層ではｘ１、ｙ１スペクトル、真皮層ではｘ２スペクトルだけとなる。実際に計測された拡散反射スペクトルを再現できるように表皮層のｘ１、ｙ１スペクトルと真皮層のｘ２スペクトルを同定するには、適切な拘束条件が必要となる。その拘束条件して、ｘ１、ｙ１スペクトルとして３次元モデル皮膚で求めたスペクトルを初期値とし、ｘ２スペクトルに対しては、例えば誰でも利用可能な１００％酸化状態でのヘモグロビンスペクトルを初期値として設定するという初期値設定条件を利用することができる。こうすることで、式（４）の収束を高速化することができ、また誤収束を防ぐように、表皮層のｘ１、ｙ１スペクトルはメラニンに支配され、真皮層のｘ２スペクトルはヘモグロビンに支配されている物理的に意味があるパラメータを導出可能となる。同定された表皮層のｘ１、ｙ１スペクトルを、上述の検量線を用いてメラニン量に換算すると、ヒト皮膚のメラニン量分布を描画できる。 同定された真皮層のｘ２スペクトルからは、ヘモグロビン総量の相対値を算出することも、従来から行われている方法で酸素飽和度を算出することも可能である。また、３層構造モデルのような重層モデルを考えることも可能である。この場合、真皮層と皮下組織別々にヘモグロビン起因のスペクトルを同定可能である。数理モデルIIは、数理モデルＩに比べて、より厳密にメラニン量を推定可能である。 本発明によれば、ヒト皮膚のメラニン量分布を非接触かつ非侵襲に計測できるため、例えばメラノーマといった色素性病変の診断に資するところが大きい。 なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、種々の変形実施が可能である。 以下の具体的実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。 ［皮膚モデル培養］ 皮膚モデルとして、マットテック社（MatTek Corporation）製のＭＥＬ−３００Ａを用いた。 はじめに、インサートを搬送用培地より取り出し、３７℃に予熱した０．９ｍｌのＥＰＩ−１００ＭＭ入り６ウェルプレートに移すことにより、組織移植を行った。そして、インサートが入ったプレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れ、１時間平衡させて前平衡を行った。 つぎに、処置済み組織が入ったプレートをインキュベーターに戻し、１４日間培養した。そして、１４日間の培養期間中、培地交換の作業を７回行った。 なお、培地交換は、以下の手順で行った。プレート内の培地を吸引除去し、滅菌済みステンレスワッシャーを各ウェルに２段積みし、インサートをその上に置いた。その後、予熱した新しい培地３．５ｍｌを各ウェルに添加した。前回添加したコウジ酸余剰分除去のため、ＰＢＳ洗浄液にてインサートの内外を洗浄した。 以上の培養は、メラニン生成抑制作用を有することが知られているコウジ酸を種々の濃度で加えてそれぞれ行うことで、種々の産生メラニン量を有する皮膚モデルを得た。 ［化学的手法によるメラニン定量］ 実施例１において培養終了後の皮膚組織をカップから外し、１．５ｍｌチューブに入れ、凍結乾燥処理を施し、乾燥皮膚組織の重量測定を行った。そして、組織に１．０ｍｌの超純水（miliQ-water）を加え、ガラスホモジネーターを用いてホモジナイズした。その後、超音波装置（Handy sonic model UR-20P）を用いてホモジナイズ後の組織に超音波処理を施した。サンプルを１００μｌずつスクリュー管へ分注した。 そして、以下の手順により、ユーメラニン（Eumelanin）、フェオメラニン（Pheomelanin）について定量を行った。 ［ユーメラニンの定量］ ＰＴＣＡ（pyrrole-2,3,5-tricarboxylic acid）を定量し、これを指標としてユーメラニンを定量した。 はじめに、１００μｌの組織溶解液に８００μｌの１Ｍ−Ｈ２ＳＯ４を添加した。そして、１００μｌのマウス肝ホモジナイズ液（５００ｍｇ／１０ｍｌ)を添加し、１０分間振盪した。振盪の間、１０μｌの３％ＫＭｎＯ４を加えた。また、振盪する間にＫＭｎＯ４の紫色が消えた時点で再度１０μｌの３％ＫＭｎＯ４を加えた。その後、１００μｌの１０％Ｎａ２ＳＯ３を加えた。 つぎに、この反応液に対し約７ｍｌのエーテル（アルミナ処理済）を加え、振盪し、エーテル画分をリム付き試験管に移した。そして、水性画分に再度約７ｍｌのエーテルを加え、振盪し、水性画分に再度約７ｍｌのエーテルを加え、エーテル画分を先ほどのリム付き試験管に移した。 その後、試験管濃縮器（TC-10D）を用い、減圧下にてエーテル画分を濃縮乾固してから、真空ポンプを用いて完全に濃縮させた。 そして、残渣に２００μｌの超純水（miliQ-water）を加え、ボルテックスにて混合した。溶液を１．５ｍｌチューブに移し、遠心分離（10000ｒｐｍ、１分間）した。 上清をＨＰＬＣ用チューブに移し、ＨＰＬＣ（検出器：JASCA 875-UV、ポンプ：JASCA PU-980、サンプラー：JASCA AS-2057plus、インテグレーター：JASCA 807-IT、カラム：JASCA 860-Co、バッファー：０．１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ２．１０）：ＭｅＯＨ＝９９：１）によりＰＴＣＡを定量した。そして、ＰＴＣＡ量を１６０倍した数値をユーメラニン量とした（K.Wakamatsu and S. Ito, Pigment Cell Res 15: pp.174-183, 2002）。 ［フェオメラニンの定量］ ４−ＡＨＰ（4-amino-3-hydroxyphenylalanine）を定量し、これを指標としてフェオメラニンを定量した。 はじめに、１００μｌの組織溶解液に３０μｌの３０％Ｈ３ＰＯ４を加えた。そして、５００μｌの５７％ＨＩを加え、オイルバスにて１３０℃で２０時間反応させた。放冷の後、別の試験管に反応液１００μｌを取り分けた。 つぎに、反応液を真空ポンプを用いて乾燥させ、残渣に２００μｌの０．１Ｍ−ＨＣｌを添加し、ボルテックスにて混合した。そして、これを１．５ｍｌチューブに移し、遠心分離（10000rpm、１分間）した。 上清をＨＰＬＣ用チューブに移し、ＨＰＬＣ（検出器：JASCA 2020plus、ポンプ：JASCA 880-PU、サンプラー：JASCA AS-950-10、インテグレーター：JASCA 807-IT、カラム：JASCA catechol pack、バッファー：０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．００）：ＭｅＯＨ＝９６：４）により４−ＡＨＰを定量した。そして、４−ＡＨＰ量を９倍した数値をフェオメラニン量とした（K.Wakamatsu and S. Ito, Pigment Cell Res 15: pp.174-183, 2002）。 ユーメラニン（ＥＭ）とフェオメラニン（ＰＭ）の定量結果を表１に示す。 ［数理モデルＩへの当てはめ］ 実施例１において得られた種々の産生メラニン量を有する皮膚組織について、それぞれＰＢＳ洗浄液にてインサート内外を洗浄した後、石英ガラス製シャーレに移し、上述した装置を用いて拡散反射スペクトルを計測し、空間的に平均された拡散反射スペクトルを求めた。このデータ群に対して上述の数理モデルＩの主成分分析を施し、メラニンの拡散反射スペクトルに対応するローディングベクトルとスコアを求めた。そして、このスコアと実施例２で得られたメラニン量の関係を求めた。その結果を図３と図４に示す。なお、図３はフェオメラニン、図４はユーメラニンについての結果である。 図３、図４の関係を既述の以下の式に当てはめて、最小自乗法により係数ａ、ｂを求めたところ、図３において、ａ＝０．０８９９、ｂ＝０．０４３２のとき、相関係数の自乗Ｒ２は０．９１３、図４において、ａ＝０．０７７６、ｂ＝０．０２７１のとき、相関係数の自乗Ｒ２は０．８１６となった。このことから今回作製したローディングベクトルは十分にメラニンの拡散反射スペクトルに対応していることが確認された。 ここで、Ｓ（図３、４ではｙ）は本実施例で測定した拡散反射スペクトルデータ群より算出したスコア、Ｍ（図３、４ではｘ）は実施例２の化学的手法によって求められたメラニン量である。 上記の式を用いて第一スコアから求めたフェーメラニンとユーメラニンの分布を図５、図６に示す。 ［数理モデルIIへの当てはめ］ 実施例１において得られた種々の産生メラニン量を有する皮膚組織について、それぞれＰＢＳ洗浄液にてインサート内外を洗浄した後、石英ガラス製シャーレに移し、この下に基準白色板を置いた。そして、上述した装置を用いて拡散反射スペクトルを計測し、空間的に平均された拡散反射スペクトルを求めた。この３次元モデル皮膚の拡散反射スペクトルに対し、上述の数理モデルIIの手法を適用したところ、図７、図８に示すように、長波長化に伴い、ｘ１、ｙ１共に単調減少することがわかった。ヒト３次元モデル皮膚はほぼ一定の厚みをもつ構造をしているため、上述の式（２）より、吸収係数・散乱係数共に単調減少であると推定される。これは従来の知見とも一致している。また光学式顕微鏡により３次元モデル皮膚の厚みを実測し、式（２）より吸収係数・散乱係数を推定したところ、実際のヒト皮膚における乳頭状真皮（血液を含まない）に対して、インビトロで同定された吸収係数・散乱係数の値とほぼ一致した（R. R. Anderson and J. A. Parrish, The Journal of Investigative Dermatology 77: pp.13-19, 1981）。 図７、８は、フェオメラニン濃度とｘｉ、ｙｉスペクトルとの関係を示しており、これを用いることによりメラニン量を推定することができることが実証された。本発明による計測装置の概略図である。本発明による計測装置に搭載された分光器の構成図である。フェオメラニンの拡散反射スペクトルに対応するスコアとフェオメラニン量の関係を示すグラフである。ユーメラニンの拡散反射スペクトルに対応するスコアとユーメラニン量の関係を示すグラフである。フェオメラニンの分布を示す画像である。ユーメラニンの分布を示す画像である。フェオメラニン濃度とｘｉスペクトルとの関係を示すグラフである。フェオメラニン濃度とｙｉスペクトルとの関係を示すグラフである。符号の説明２ 白色光源４ 分光器５ ＣＣＤカメラ（検出器）６ データ処理装置産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚において拡散反射スペクトルを計測して空間的に平均された拡散反射スペクトルを求める第１のステップと、化学的に３次元モデル皮膚のメラニン量を定量する第２のステップと、第１のステップで求めた拡散反射スペクトル対して主成分分析を施してローディングベクトルとスコアを求める第３のステップと、第３のステップで求めたスコアと第２のステップで定量したメラニン量の関係を式（ここで、Ｓは拡散反射スペクトルデータ群より算出したスコア、Ｍは化学的手法によって求められたメラニン量）に当てはめて検量線を求める第４のステップと、計測対象物の拡散反射スペクトルを第３のステップで求めたローディングベクトルに射影することでスコアを算出する第５のステップと、第５のステップで求めたスコアを第４のステップで求めた検量線に当てはめて計測対象物のメラニン量を算出する第６のステップとを備えたことを特徴とする非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法。拡散反射スペクトルの波長域を６２０ｎｍ−７２０ｎｍとすることを特徴とする請求項１記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法。産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚において拡散反射スペクトルを計測して空間的に平均された拡散反射スペクトルを求める第１のステップと、化学的に３次元モデル皮膚のメラニン量を定量する第２のステップと、第１のステップで求めた拡散反射スペクトルから式（ここで、Ｒ１，２，…，ｎは光の拡散反射率、Ｔｉは第ｉ層の拡散透過率）を用いて各波長のｘｉ、ｙｉスペクトル強度を同定する第３のステップと、第３のステップで同定された各波長のｘｉ、ｙｉスペクトル強度と第２のステップで定量されたメラニン量との関係から検量線を求める第４のステップと、計測対象物の拡散反射スペクトルからｘｉ、ｙｉスペクトル強度を算出する第５のステップと、第５のステップで求めたｘｉ、ｙｉスペクトル強度を第４のステップで求めた検量線に当てはめて計測対象物のメラニン量を算出する第６のステップとを備えたことを特徴とする非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法。計測対象物に白色光を照射する白色光源と、前記計測対象物により拡散反射された光を分光する分光器と、この分光器により分光された拡散反射スペクトルを検出する検出器と、この検出器により検出された拡散反射スペクトルのデータが入力されるデータ処理装置と、前記白色光源からの白色光を直線偏光化しこの白色光の偏光面と垂直な直線偏光成分のみを前記分光器に入射させる偏光板とを備えたことを特徴とする非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置。前記データ処理装置には３次元モデル皮膚のメラニン量のデータが入力されるとともに、前記データ処理装置は、請求項１記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法にしたがって計測対象物のメラニン量を算出可能に構成されたことを特徴とする請求項４記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置。前記データ処理装置には３次元モデル皮膚のメラニン量のデータが入力されるとともに、前記データ処理装置は、請求項３記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法にしたがって計測対象物のメラニン量を算出可能に構成されたことを特徴とする請求項４記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置。前記検出器は、計測中央部に常に焦点を合わせることができる自動焦点機能を有していることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置。顕微光学系機能を有することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測装置。 【課題】バイオプシーを行わずに、ヒト皮膚メラニンを正確に定量し、その分布を観察、表示することのできる、新規の非侵襲ヒト皮膚メラニン計測法及びその装置を提供する。【解決手段】産生メラニン量が異なる３次元モデル皮膚における拡散反射スペクトルと、化学的に定量したメラニン量とが対応したデータ群を得た。このデータ群に対して主成分分析を施して得たスコアについて、メラニン量の検量線を求めた。計測対象物の拡散反射スペクトルからスコアを算出し、これを検量線に当てはめることによって計測対象物のメラニン量を算出した。【選択図】図１