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| タイトル： | 公開特許公報(A)_芽胞形成細菌芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出方法 |
| 出願番号： | 2008142578 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C12Q 1/68 |
特許情報キャッシュ
中西 弘一 木ノ内 智之 JP 2009284853 公開特許公報(A) 20091210 2008142578 20080530 芽胞形成細菌芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出方法 キリンビバレッジ株式会社 391058381 廣田 雅紀 100107984 小澤 誠次 100102255 中西 弘一 木ノ内 智之 C12N 15/09 20060101AFI20091113BHJP C12Q 1/68 20060101ALI20091113BHJP JPC12N15/00 AC12Q1/68 A 6 ＯＬ 11 4B024 4B063 4B024AA11 4B024AA20 4B024CA01 4B024GA30 4B024HA20 4B063QA01 4B063QA08 4B063QQ42 4B063QR32 4B063QR62 4B063QS16 4B063QS25 4B063QS39 4B063QX01 本発明は、芽胞形成細菌の芽胞の遺伝的分析等における試料を調製するために、芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・取得する方法、特に、芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得を発芽による栄養細胞の調製を行なうことなく、温和な条件下で、効率的に行なうゲノムＤＮＡの抽出・取得方法に関する。 従来より、細菌を分析するには、培地に細菌を移し、細菌を培養し、増殖させて観察する培養法が主流であった。しかしながら、培養に日数を要するため、近年では、細菌の遺伝子を抽出して増幅し、その遺伝子を検出することで、目的とする細菌の有無を判別する遺伝子検査法が取り入れられてきている。これらの遺伝子検査法においては、細菌試料からの遺伝子、すなわちゲノムＤＮＡを分離、取得し、遺伝子解析のための試料を調製することが必要となる。しかしながら、バチルス目などの芽胞形成細菌においては、周囲に水分が少なく、栄養が枯渇した状況になると芽胞を形成するため、遺伝子解析のためのゲノムＤＮＡを直接取り出すことが難しくなる。すなわち、芽胞は硬い芽胞殻に覆われ、熱や化学物質等に強い抵抗力をもっており、その内側にある染色体ゲノムＤＮＡを直接取り出すことは非常に困難である。 したがって、従来法では、芽胞形成細菌の芽胞から遺伝子を取り出し分子生物学的な解析を行うには、まず、芽胞を発芽させた後、栄養細胞として増殖させ、培養後ゲノムＤＮＡを抽出するステップが必要であった。かかる芽胞を発芽させた後、遺伝子を取り出す方法においては、芽胞の発芽に日数がかかることから、アラニン、アデノシン、グルコースを含有するブイヨン等の芽胞の発芽促進剤を用いる方法が開示されている（特開２００５−２５３３６５号公報、特開２００６−３４５７２７号公報）。 また、細胞からＤＮＡを高純度で、かつ簡便に分離精製するために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムのような界面活性剤や、リゾチームやクロモペプチダーゼのような細胞壁多糖類分解酵素を用いて、細胞崩壊を行なう方法（特開平７−１４３８７９号公報）や、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸のようなイオン性界面活性剤を用いて、超音波破壊や凍結融解等による破壊操作を行なうことなく細胞膜を破壊して、細胞内容物を溶出する方法（特開２０００−３５０５９５号公報）が開示されている。 しかしながら、これらの方法は、その処理に日数がかかったり、また、細胞からのＤＮＡの効率的な取得が難しかったり、或いは、取得した細胞内容物からのＤＮＡ等の分離・精製が難しかったりして、更には、分離・取得する成分の酵素的分解等の問題があり、例えば、芽胞形成細菌の芽胞からの遺伝子の分離・取得手段としては十分なものではなかった。したがって、従来、芽胞形成細菌からのゲノムＤＮＡの分離・取得には、主として芽胞形成細菌の芽胞を発芽させ栄養細胞を調製した状態で物理的に破壊し、抽出する方法が採られていた。 芽胞形成細菌からの遺伝子の分離・取得方法として、芽胞形成細菌を物理的に破壊する方法としては、「凍結破砕法」、「超音波破壊方法」、「摩砕剤、圧力、又はホモジナイザーを用いた物理的破壊法」などが知られている。凍結破砕法は、試料を極低温で凍結させ、脆弱化したところに強い外圧を加えて細胞を破壊し、内容物を抽出する方法であり、処理や、設備的な問題と、芽胞のような難溶性の物質には使用が難しいというような問題がある。超音波破壊方法は、超音波をかけて細胞を破壊するものであるが、破壊力が強力であるため、芽胞とともにＤＮＡ等が細片に寸断されるという問題がある。摩砕剤を用いた物理的破壊法は、ガラスビーズやアルミナの粉末とサンプルとを混合し機械的に摺り合わせることで細胞等の破壊を行なうものであり、圧力を用いた物理的破壊法は、急な減圧や、小孔から高圧で試料を噴射させて細胞等の破壊を行なうものであり、また、ホモジナイザーを用いた物理的破壊法は、ホモジナイザーを用いて細胞等の破壊を行なうものであるが、安全性や設備の問題、或いは試料が微量の場合に適用が困難であったり、ＤＮＡなどの寸断の問題もあり、芽胞から直接、効率的に分離・取得することはできない。 これらの物理的破壊法の問題を解決しようとする試みも開示されている。例えば、特開２００６−１４１２９２号公報には、ビーズを用いた細胞破砕処理において、細胞破砕用ビーズの大きさを調整したり、細胞破砕時の容器の空間容量を調整したり、界面活性剤を含まない状態で細胞破砕処理を行ない、細胞破砕後に界面活性剤を添加し、核酸抽出操作を行なうこと等により、簡便、迅速、かつ高効率に細胞を破砕し、核酸の抽出効率を上昇させる方法が開示されている。しかしながら、これらの方法も、温和な条件下で、芽胞形成細菌の芽胞から簡便・迅速かつ効果的にゲノムＤＮＡを抽出・取得できるというものではなかった。特開平７−１４３８７９号公報。特開２０００−３５０５９５号公報。特開２００５−２５３３６５号公報。特開２００６−１４１２９２号公報。特開２００６−３４５７２７号公報。 従来、細菌の細胞から遺伝子ゲノム等の試料を抽出・採取するために用いられていた方法では、芽胞形成細菌の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得に当たっては、培養法を併用し、芽胞を発芽させ栄養細胞を調製しなければならず時間がかかったり、例えば、試料中に芽胞菌が存在するかどうか直接判断したい場合には、培養法を必要としない芽胞からの直接ゲノム抽出が必須となり、培養法だけでは直接判断ができないという問題点があった。また、物理的破砕を使用する方法では、ビーズ等の選択により、効率をあげること等が紹介されているが、処理条件の設定や操作が煩雑であり、菌数が少ない場合は効率良くゲノムを抽出できないという問題があった。更に、リゾチームやアクロモペプチダーゼなどの細胞壁溶解酵素を使用する方法でも、処理条件の設定や操作が煩雑になることや、有効な菌が限られてしまったり、酵素が混入してしまうという問題があり、また界面活性剤を使用する方法では、細胞を変性させることは、グラム陰性菌については極めて有効であるが、グラム陽性菌、特にバチルス目などの芽胞形成細菌には十分な溶菌効果を発揮できないという問題があった。 そこで、本発明の課題は、芽胞形成細菌の芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・取得する場合に適用することができ、かかる芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・分離する場合に、芽胞の粉砕手段のような手段を用いることなく、温和な条件下で、芽胞からゲノムＤＮＡを簡便・迅速に抽出・取得する方法を提供することにある。 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究する中で、芽胞形成細菌の芽胞の外観が、静菌性乳化剤を接触させることにより、膨潤した状態に変化することをナノサーチ顕微鏡による観察結果から見出した。更に、本発明者は、静菌性乳化剤を接触させた芽胞がゲノムＤＮＡ等の内容物を溶出し易い状態に変化することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、芽胞形成細菌の芽胞を、静菌性乳化剤の存在下に、溶液中でインキュベートするという、温和な条件下で、芽胞からゲノムＤＮＡを溶出・抽出するものであり、かかる方法により、簡便・迅速に芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・取得することを可能としたものである。本発明の芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・取得する方法は、従来方法では、抽出・取得が困難であった芽胞形成細菌の芽胞から、ゲノムＤＮＡの細片化等の変性を生じることなく、直接ゲノムを簡便な手段で抽出することを可能としたものである。 本発明の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法において用いられる静菌性乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及び糖アルコール脂肪酸エステル等を挙げることができる。本発明において、グラム陽性細菌の芽胞形成細菌の代表的な細菌としては、バチルス目に属する細菌を挙げることができる。 本発明において、芽胞形成細菌の芽胞の静菌性乳化剤の存在下での溶液中のインキュベートは、常温下、静置状態で行なわれる。本発明の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法を用いることにより、芽胞形成細菌の芽胞からのゲノムＤＮＡを分離、取得し、ゲノムＤＮＡの試料を調製して、遺伝的解析を行い、芽胞形成細菌の芽胞の遺伝的分析を行なうことができる。 すなわち具体的には本発明は、［１］芽胞形成細菌の芽胞を、静菌性乳化剤の存在下に、溶液中でインキュベートすることを特徴とする芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法や、［２］静菌性乳化剤が、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及び糖アルコール脂肪酸エステルから選択される１又は２以上であることを特徴とする上記［１］記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法や、［３］芽胞形成細菌が、グラム陽性細菌であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法からなる。 また本発明は、［４］芽胞形成細菌が、バチルス目に属する細菌であることを特徴とする上記［３］記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法や、［５］芽胞形成細菌の芽胞の静菌性界面活性剤の存在下での、溶液中のインキュベートが、常温下、静置状態で行なわれることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法や、[６]上記［１］〜[５]のいずれか記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法を用いることにより、芽胞形成細菌の芽胞からのゲノムＤＮＡを分離、取得することを特徴とする芽胞形成細菌の芽胞の遺伝的分析を行なうための試料の調製方法からなる。 本発明の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法は、従来法では、その有効な抽出・取得が困難であった、芽胞形成細菌の芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・取得する場合に適用することができる。しかも、かかる芽胞からゲノムＤＮＡを抽出・分離する場合に、芽胞の粉砕手段のような手段を用いることがなく、温和な条件下で、芽胞からゲノムＤＮＡを取得することが可能なため、ＤＮＡの細片化等の試料の変性を生ずることがなく、正確な試料の遺伝子的な分析を行うためのゲノムＤＮＡの抽出・取得を可能とする。更に、本発明のゲノムＤＮＡの抽出・取得方法は、芽胞形成細菌の芽胞を、静菌性乳化剤の存在下に、溶液中でインキュベートするという処理操作によって行うことが可能であるため、装置や処理操作の複雑さの問題を解消し、簡便・迅速に芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得を可能とする実用的な手段を提供する。 本発明は、芽胞形成細菌の芽胞の遺伝的分析等における試料を調製するに際して、芽胞形成細菌の芽胞を、静菌性界面活性剤の存在下に、溶液中でインキュベートすることにより、芽胞から直接ゲノムを溶出させ、抽出することにより、ゲノムＤＮＡを抽出・取得する方法からなる。 本発明の方法で用いられる静菌性乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及び糖アルコール脂肪酸エステルから選択される１又は２以上を挙げることができる。グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノグリセリン脂肪酸エステル、ジグリセリン脂肪酸エステル、トリグリセリン脂肪酸エステルを挙げることができる。蔗糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸としては、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の炭素数８〜２２の飽和又は不飽和の直鎖脂肪酸を挙げることができる。ポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、ポリグリセリン（縮合度は好ましくは２〜３０）脂肪酸エステルが好ましく、糖アルコール脂肪酸エステルとしては、糖アルコールとして、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトールが、脂肪酸としては、炭素数７〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸を好適な脂肪酸として挙げることができる。 本発明において、芽胞形成細菌の芽胞の静菌性乳化剤の存在下での、溶液中のインキュベートは、常温（室温）下、静置状態で行なわれることができ、好ましくは、１〜７２時間を静置状態でインキュベートを行い、芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出を行なうことが好ましい。本発明においては、芽胞の粉砕手段のような手段を用いることがなく、温和な条件下で、芽胞をゲノムＤＮＡ等の内容物が溶出し易い状態に変化させるため、適宜公知のＤＮＡの分離・精製手段を適用することにより、効率的にゲノムＤＮＡを分離・精製することができる。 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 （供試菌株）Bacillus subtilis IFO3134株を供試菌株として用いた。 （芽胞の調製）（１）標準寒天培地（日水製薬）に、Bacillus subtilisの芽胞液を塗抹後、３５℃１週間培養した。（２）コロニーをかきとり適量の滅菌水で５０ｍｌのカルチャーチューブに懸濁した。（３）５０００ｒｐｍ×１０分間遠心し、菌体を回収した。（４）２０ｍｌのリゾチーム液［１０ｍＭ Tris-HCl（buffer ｐＨ７．６）にリゾチーム濃度１０ｍｇ／ｍｌ］を添加し、菌体を懸濁した。（５）３７℃で５分間静置した。（６）２０ｍｌのWash solution［１０ｍＭ Tris-HCl（buffer ｐＨ７．６）、５００ｍｌＮａＣｌ］を添加し、ボルテックスで混和後、１００００ｒｐｍ×１０分間遠心分離した。（７）上澄を取り除き、（６）の操作を３回繰り返した。（８）３０〜４０ｍｌの保存液に懸濁した。（９）希釈系列を作成し、標準寒天培地（日水製薬）にて細胞濃度を確認した。（１０）グラム染色にて、栄養細胞が取り除かれ、芽胞のみとなっていることを確認した。調製した芽胞を図１に示す。 （抽出処理）以下の手順に従って、芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出処理を行った：（１）５０ｍｌ用カルチャーチューブに、少量の滅菌水を添加し、以下の４種類の乳化剤を分散後、終濃度１０００ｐｐｍ（３０ｍｇ／３０ｇ滅菌水）になるように調整した。使用した乳化剤を表１に示す。（２）オートクレーブにて１００℃１０分加熱し、界面活性剤を溶解した。（３）サンプルに１０４オーダーＣＦＵ／ｍｌになるように供試芽胞を接種した。（４）常温で７２時間インキュベートした。（５）市販のゲノム抽出キットPrepMan Ultra Sample Preparation Reagent (Applied Biosystems社製)を用いてゲノムＤＮＡの抽出・分離を行なった。 （ＰＣＲ反応）１６ＳｒＲＮＡ全鎖長を増幅するプライマーを準備し、常法に従い、ＰＣＲ反応による遺伝子増幅を行った。 （電気泳動及びゲル撮影）２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＵＶイリュミネーターを用いて撮影した。 （結果）電気泳動結果を図２（ゲル写真）に示す。バンドの濃淡を表２に示す。静菌性乳化剤であるＰ１６７０、ＴＲＰ９７ＲＦ、Ｓ５７０において、はっきりバンドが確認された。Triton Ｘ−１００及びＷ−６０接触区、ネガティブコントロールの界面活性剤非接触区においては、バンドが確認できなかった。静菌性乳化剤を添加することによって、ゲノムＤＮＡ抽出効率が向上し、ＰＣＲ反応による遺伝子増幅を確認できることが判明した。 ［参考実験例：静菌性乳化剤との接触による芽胞の変化］ (供試菌株)Geobacillus stearothermophilus ＤＳＭ５３９４株を供試菌株として用いた。 (芽胞の調製)この実施例の上記（芽胞の調製）と同じ方法で、芽胞の調製を行なった。 (静菌性乳化剤との接触処理)（１）５０ｍｌ用カルチャーチューブに、少量の滅菌水を添加し、静菌性乳化剤(Ｐ−１６７０)を添加・分散後、終濃度５００ｐｐｍ（３０ｍｇ試料/３０ｇ滅菌水）になるように調整した。比較対照として、静菌性乳化剤を添加しないサンプルも調整した。（コンタミネーションを避けるため、操作はすべてクリーンベンチ内で行った。）（２）オートクレーブにて１００℃１０分加熱し、溶解した。（３）サンプルに１０４オーダーＣＦＵ／ｍｌになるように供試菌株を接種した。（４）常温で３日間インキュベーションした。 (芽胞の観察)ナノサーチ顕微鏡(ＳＦＴ３５００島津製作所)にて、芽胞の表面形状、分散・凝集状況を観察した。 (結果)静菌性乳化剤を接触させたGeobacillus stearothermophilusの芽胞を原子間力顕微鏡で観察したところ、芽胞の膨潤が認められた（図３）。図３に示されるように、静菌性乳化剤無添加の区（３−ａ）では、芽胞（大きさ：０．２〜０．３μｍ）は凝集して固まりの状態を示し、静菌性乳化剤添加（Ｐ１６７０ ５００ｐｐｍ添加）の区（３−ｂ）では、芽胞（大きさ：０．３〜０．５μｍ）は膨潤して、分散した状態を示した。本発明の実施例において調製した芽胞のグラム染色の結果（栄養細胞が取り除かれ、芽胞のみになっていることの確認）を示す写真である。本発明の実施例において、静菌性乳化剤に接触させることによって、抽出・取得したサンプルを２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＵＶイリュミネターを用いて撮影した結果を示す写真である。本発明の実施例において、静菌性乳化剤を接触させたGeobacillus stearothermophilusの芽胞を原子間力顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図中、３−ａは、静菌性乳化剤無添加の区を、３−ｂは、静菌性乳化剤添加（Ｐ１６７０ ５００ｐｐｍ添加）の区の写真である。芽胞形成細菌の芽胞を、静菌性乳化剤の存在下に、溶液中でインキュベートすることを特徴とする芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法。静菌性乳化剤が、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及び糖アルコール脂肪酸エステルから選択される１又は２以上であることを特徴とする請求項１記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法。芽胞形成細菌が、グラム陽性細菌であることを特徴とする請求項１又は２記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法。芽胞形成細菌が、バチルス目に属する細菌であることを特徴とする請求項３記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法。芽胞形成細菌の芽胞の静菌性界面活性剤の存在下での、溶液中のインキュベートが、常温下、静置状態で行なわれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法。請求項１〜５のいずれか記載の芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法を用いることにより、芽胞形成細菌の芽胞からのゲノムＤＮＡを分離、取得することを特徴とする芽胞形成細菌の芽胞の遺伝的分析を行なうための試料の調製方法。 【課題】芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得を発芽による栄養細胞の調製を行なうことなく、温和な条件下で、効率的に行なうゲノムＤＮＡの抽出・取得方法を提供すること。【解決手段】芽胞形成細菌の芽胞を、静菌性乳化剤の存在下に、溶液中でインキュベートすることにより、芽胞の発芽による栄養細胞の調製を行なうことなく、芽胞から直接ゲノムを溶出・抽出する。本発明において、芽胞からのゲノムＤＮＡの抽出・取得方法において用いられる静菌性界面活性剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及び糖アルコール脂肪酸エステル等の静菌性乳化剤を挙げることができる。本発明の方法は、芽胞の粉砕手段のような手段を用いることがないので、ゲノムＤＮＡの細片化等の変性を生じることなく、直接ゲノムを簡便な手段で抽出することができる。【選択図】なし