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角藤 嘉記 丸山 広恵 荒木 陽子 JP 5250302 特許公報(B2) 20130419 2008124765 20080512 血糖上昇抑制剤 アピ株式会社 591045471 恩田 博宣 100068755 恩田 誠 100105957 角藤 嘉記 丸山 広恵 荒木 陽子 20130731 A61K 38/00 20060101AFI20130711BHJP A61K 35/64 20060101ALI20130711BHJP A61P 3/10 20060101ALI20130711BHJP JPA61K37/02A61K35/64A61P3/10 Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８ Ａ６１Ｋ ３５／６４ ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） 特開２００１−００２５８３（ＪＰ，Ａ） 特開２００５−００６５３３（ＪＰ，Ａ） 国際公開第０６／０６７８５６（ＷＯ，Ａ１） 特開２００５−２６３７８２（ＪＰ，Ａ） 特開２００７−２１７３５８（ＪＰ，Ａ） Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５年，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２，ｐ２２２−２３０ 日本食品科学工学会誌，２００３年，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．７，ｐ３１０−３１５ 日本食品科学工学会誌，２００６年，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．４，ｐ２００−２０６ 日本食品科学工学会誌，２００３年，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．６，ｐ２８６−２８８ 日本食品科学工学会誌，２００３年，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１０，ｐ４５７−４６２ 新薬と臨床，２００５年，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．５，ｐ６０２−６１９ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，２００６年，Ｖｏｌ．２００６，ｐ５−１３ 糖尿病，２０００年，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌ．１，ｐＳ−２６３，ＩＩ−Ｏ−１０ 糖尿病，２００６年，Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌ．１，ｐＳ−１２２，Ｉ−Ｐ−２０２ 医療薬学，２００３年，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．６，ｐ７５０−７５５ 内分泌・糖尿病科，２００１年，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．４，ｐ３９１−３９７ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１０，ｐ１５４１−１５４５ 日本水産学会誌，２００２年，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．２，ｐ１９２−１９６ Ｔｏｈｏｋｕ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６年，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．１／２，ｐ１−８ 化学工学論文集，１９９９年，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２，ｐ２４４−２４７ 日本醸造協会誌，２００２年，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．４，ｐ２５３−２５６ Ｎｅｗ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００１年，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１２，ｐ１５−１８ 食品と開発，１９９９年，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．７，ｐ１２−１４ 日本畜産学会大会講演要旨，２００８年 ３月，Ｖｏｌ．１０９ｔｈ，ｐ６３，ＩＶ２９−２０ 香川県産業技術センター研究報告，２００１年，Ｎｏ．１，ｐ１２７−１２９ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ ＆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８１年，Ｖｏｌ．５，ｐ４２９−４３９ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３年，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．１，ｐ５４−５９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９９５年，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ４１５−４２０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３年，Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．３，ｐ９９６−９９７ 日本農芸化学会大会講演要旨集，２００２年，Ｖｏｌ．２００２，ｐ１０９，３−３Ｅａ０６ 生物工学会誌，２００２年，Ｖｏｌ．８０，Ｎｏ．７，ｐ３１６ 1 2009274960 20091126 12 20091224 小森 潔 本発明は、ローヤルゼリー由来のタンパク質に中性プロテアーゼを作用させて、さらにペントースとともに加熱することにより得られるローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する血糖上昇抑制剤に関する。 一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。従来より、ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、創傷治癒促進、血清コレステロール低下作用、血流増加作用、性中枢老化防止作用、抗菌作用、成長促進作用、放射線及び化学療法剤の副作用軽減作用、慢性疾患に対する作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。したがって、ローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品、化粧品等の用途にも用いられてきた。 ローヤルゼリーを利用する形態として、特許文献１に開示される方法が知られている。特許文献１は、ローヤルゼリーにバチルス・サブティリス由来のエンド型中性プロテアーゼを用いて加水分解処理を施すことにより得られる酵素処理ローヤルゼリーについて開示する。かかる酵素処理ローヤルゼリーは、血圧降下作用を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを含有している。特開２００７−７８号公報 本発明は、ローヤルゼリー由来のタンパク質に中性プロテアーゼを作用させて生成したペプチドに、さらにペントースを作用させることにより、抗酸化作用の向上効果等の生体に有用な作用効果が得られることを発見したことに基づくものである。 本発明の目的とするところは、様々な用途に利用することが可能なローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する血糖上昇抑制剤を提供することにある。 上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明の血糖上昇抑制剤は、ローヤルゼリー由来のタンパク質をサーモリシンにより加水分解し、該加水分解されたタンパク質をキシロースとともに７０〜８５℃で１〜５時間加熱することにより得られるローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。 本発明によれば、様々な用途に利用することが可能なローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する血糖上昇抑制剤を提供することができる。 以下、本発明のローヤルゼリーペプチドを具体化した実施形態を説明する。以下、ローヤルゼリーをＲＪと略記する。 本実施形態のＲＪペプチドは、ＲＪ由来のタンパク質を中性プロテアーゼにより加水分解し、該加水分解されたタンパク質とペントースを加熱することにより得られる。ＲＪは、主な生理活性成分として、例えば、タンパク質、糖類、ＲＪに特有な１０−ハイドロキシデセン酸等の有機酸類、脂質、ビタミンＢ類や葉酸、ニコチン酸、パントテン酸等のビタミン類、各種ミネラル類等を含有している。本実施形態のＲＪペプチドの生成に用いられるＲＪとしては、生ＲＪ又は該生ＲＪを乾燥させて粉末化したＲＪ粉末のいずれを採用してもよい。また、ＲＪの産地は、特に限定されず、例えば日本、中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、及びアメリカ等のいずれであってもよい。尚、後述するようにＲＪ中のタンパク質を抽出したものを使用してもよい。 ＲＪには、タンパク質が高含有されているため、生ＲＪ又は乾燥ＲＪ粉末を中性プロテアーゼ処理原料であるＲＪ由来のタンパク質として、直接プロテアーゼを作用させてもよい。また、生ＲＪ又は乾燥ＲＪ粉末を前処理、例えばメタノール、アセトン、エタノール、及びヘキサン等を用いた脱脂処理、活性炭処理、又は活性白土処理してもよい。また、生ＲＪ又は乾燥ＲＪ粉末から公知の方法を用いてタンパク質を抽出又は精製したものを使用してもよい。タンパク質を分離・精製する方法としては、例えば、加熱・冷却、酸・アルカリ、加圧、及び変性剤等によってタンパク質を沈殿させる方法、塩析を用いてタンパク質を沈殿させる方法、並びに各種クロマトグラフィ等を用いる方法等が挙げられる。また、親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を用いて抽出処理し、可溶性画分（ＲＪエキス）を入手する際に生ずる不溶性画分を中性プロテアーゼ処理原料であるＲＪ由来のタンパク質として使用してもよい。この抽出溶媒に不溶性の画分には、主として水溶性タンパク質が高含有されている。 本実施形態のＲＪペプチドを得るためには、まず上記のＲＪ由来のタンパク質をプロテアーゼ処理（タンパク加水分解処理）する。プロテアーゼ処理は、中性プロテアーゼを用いてＲＪ由来のタンパク質のペプチド結合を加水分解し、低分子化する処理である。かかる処理により、ＲＪ由来のタンパク質から加水分解タンパク質が生成する。中性プロテアーゼとしては、至適ｐＨを中性付近（ｐＨ５．０〜８．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５）に有するプロテアーゼを挙げることができる。中性プロテアーゼには、ペプチドの末端から加水分解するエキソ型プロテアーゼとペプチドの途中から分解するエンド型プロテアーゼとが存在するが、いずれのプロテアーゼも使用することができる。中性プロテアーゼとして、具体的には、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（バチルス・サーモプロテオライティクス・ロッコ（Bacillus thermoproteolyticus Rokko））由来の中性プロテアーゼであるサーモリシン、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼ、及びバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼを挙げることができる。これらの中で、酵素処理により抗酸化活性の向上効果の高いサーモリシン由来の中性プロテアーゼが好ましい。 サーモリシンは、金属プロテアーゼに分類され、至適ｐＨは約６．５〜８．５である。サーモリシンは、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン等の大きな疎水性側鎖を持つアミノ残基を含むペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼである。市販品としては、例えばサモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を挙げることができる。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりサーモリシンと同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。サーモリシンを用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは４０〜７５℃、さらに好ましくは５０〜７０℃の条件下で行われる。 中性プロテアーゼを用いたプロテアーゼ処理は、ＲＪ由来のタンパク質、中性プロテアーゼ及び水（又は緩衝液）を含む反応液を、所定条件下でインキュベートすることにより実施される。プロテアーゼ処理の処理時間は、反応温度、酵素活性（力価）等により適宜設定されるが、例えば０．１〜２４時間である。なお、このプロテアーゼ処理は、前記インキュベート後の反応液を加熱して前記プロテアーゼを失活させる処理を行ってもよい。 前記反応液には、ＲＪ由来のタンパク質に起因する粘度上昇を抑えてプロテアーゼ処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有されている。溶媒は、処理原料（タンパク質）の重量に対して２〜１５倍量、好ましくは２〜１４倍量、より好ましくは３〜１０倍量の水又は緩衝液が含有されていることが望ましい。処理原料の重量に対して２倍量未満の溶媒が加えられる場合、タンパク質に起因する溶媒の粘度上昇を十分に抑えることができないため、プロテアーゼ処理を迅速に進行させることが困難になる。逆に、処理原料（タンパク質）の重量に対して１５倍量を超える溶媒が加えられる場合、得られた酵素処理ＲＪを粉末化する場合に、多くの時間を要するという不都合が発生する。 ペントース（五炭糖）は、上記加水分解タンパク質（酵素処理ＲＪ）とのメイラード反応によりメラノイジンの生成を促進させるために配合される。メイラード反応は、還元糖（ペントース）とアミノ化合物（加水分解タンパク質）が重合して、褐色物質であるメラノイジンを生成させる褐変反応である。かかる褐変反応により、上記加水分解タンパク質から抗酸化作用及び血糖上昇抑制作用を有する本実施形態のＲＪペプチドが生成する。メイラード反応に用いられるペントースとしては、アルドペントース及びケトペントースが挙げられる。アルドペントースとしては、リボース、アラビノース、キシロース及びリキソースが挙げられる。ケトペントースとしては、リブロース及びキシルロースが挙げられる。これらの中で、キシロース及びアラビノースが好ましい。 ペントースは、プロテアーゼ処理前又は処理後のいずれの時点において添加してもよい。好ましくは、ペントースはプロテアーゼ処理後に添加される。メイラード反応におけるペントースと加水分解タンパク質の配合比率は特に限定されないが、ペントースの質量１に対し加水分解タンパク質の質量（乾燥質量）が１〜２０の範囲が好ましく、５〜１５の範囲がより好ましい。処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有される。この溶媒のｐＨは、特に限定されないが、反応を進行させるために、好ましくは酸性〜中性領域に調整され、より好ましくはｐＨ３〜６の範囲に調整される。メイラード反応は、一般に常温〜加熱条件下で進行する。本実施形態においてはペントースを用いたメイラード反応を進行させるために加熱処理される。加熱温度は、好ましくは５０〜１００℃、より好ましくは７０〜９０℃、さらに好ましくは７５〜８５℃の条件下で行われる。加熱温度が５０℃未満であるとメイラード反応の進行に長時間を要することになるため、生産性が大幅に低下することがある。一方、加熱温度が、１００℃を超えると溶媒の著しい揮発を招くおそれがある。また、嗜好性が低下する場合がある。メイラード反応の処理時間は、ペントースの配合量及び処理温度等により適宜設定されるが、例えば０．１〜２４時間、好ましくは１〜５時間である。処理温度が上がると比較的短時間に反応を終了させることができる。 本実施形態のＲＪペプチドは、高い抗酸化作用及び血糖上昇抑制作用を有する。したがって、それらの作用効果を得ることを目的とした抗酸化剤、及び血糖上昇抑制剤として適用することができる。具体的な配合形態としては、それらの作用効果を得ることを目的とした飲食品、化粧品及び医薬品等として適用することができる。 本実施形態のＲＪペプチドを飲食品に適用する場合、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。 本実施形態のＲＪペプチドを化粧品に適用する場合、化粧品基材に配合することにより製造することができる。化粧品の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状などのいずれであってもよい。このような美白化粧品を肌に適用することにより、抗酸化作用等の効果を得ることができる。化粧品基剤は、一般に化粧品に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。 本実施形態のＲＪペプチドを医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。本実施形態のＲＪペプチドは経口摂取により投与されることが望ましい。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。 本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。 （１）本実施形態において、ＲＪ由来のタンパク質を中性プロテアーゼにより加水分解し、該加水分解されたタンパク質をペントースとともに加熱することにより得られるＲＪペプチドは、高い抗酸化作用を有している。したがって、抗酸化剤として抗酸化作用を目的とした化粧品、飲食品及び医薬品に好ましく適用することができる。 （２）本実施形態において、ＲＪ由来のタンパク質を中性プロテアーゼにより加水分解し、該加水分解されたタンパク質をペントースとともに加熱することにより得られるＲＪペプチドは、高い血糖上昇抑制作用を有している。したがって、血糖上昇抑制作用を目的とした飲食品及び血糖上昇抑制剤として用いられる医薬品等により好ましく適用することができる。 （３）本実施形態において、ＲＪペプチドを得るために用いられるペントースは、キシロース及びアラビノースから選ばれる少なくとも一種が好ましく用いられる。したがって、最終的に得られるＲＪペプチドの抗酸化作用及び血糖上昇抑制作用をより高めることができる。 （４）本実施形態において、ＲＪペプチドを得るために用いられる中性プロテアーゼは、サーモリシンが好ましく適用される。したがって、酵素処理によって抗酸化作用及び血糖上昇抑制作用をより高めることができる。 なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。 ・上記実施形態のＲＪペプチドは、ヒトに適用される飲食品、及び医薬品のみならず、家畜等の飼養動物に対するサプリメント、栄養補助食品、及び医薬品として適用してもよい。 ・上記実施形態のＲＪペプチドは、好ましくは糖尿病等の高血糖症の患者の治療に適用される。しかしながら、治療の用途のみならず、健常者が高血糖症の予防のために摂取してもよい。 以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 （試験例１、メイラード反応と加熱処理温度との関係） メイラード反応と加熱処理温度との関係について試験した。中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））１ｋｇをエタノールにより脱脂処理を施した。次に脱脂処理ＲＪ中の固形分に対して溶媒として１０倍量の蒸留水を添加し、６５℃まで昇温した。次に、５ＮのＮａＯＨを用いて溶媒のｐＨを７．５に調整後、中性プロテアーゼとしてサーモリシン(脱脂処理ＲＪ中の固形分に対して２％)を添加し、加水分解反応を行なった。尚、サーモリシンは、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を使用した。サモアーゼＰＣ１０Ｆは、９００００ＰＵ／ｇ以上の力価（１ＰＵ＝カゼイン（終濃度０．５％）にｐＨ７．２、３５℃で作用するとき、反応初期の１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性低分子分解産物を生成するのに必要な酵素量）を有している。 ４時間の加水分解反応後、濾過助剤として珪藻土６００Ｓを脱脂処理ＲＪ中の固形分に対して５０％量を添加し、吸引濾過した。濾液を凍結乾燥し、得られた粉末を酵素処理ＲＪとした。この酵素処理ＲＪ９重量部に対して、キシロースを１重量部、及び蒸留水を１００重量部添加後、３ＮのＨＣｌを用いてｐＨ５．０に調整した。調整した混合液は、下記表１に示される各温度で３時間加熱処理した。冷却後、メイラード反応で生じる褐変物質(メラノイジン)の吸収波長（abs460nm）を測定した。結果を表１に示す。尚、ブランクは加熱処理を行なっていないものを使用した。 嗜好性は、加熱処理を行なっていないものに対し、味覚による官能評価を行なった。嗜好性の低下が全く認められない：○、嗜好性の低下が僅かに認められる：△、嗜好性の低下が明らかに認められる：×として評価した。 表１に示されるように、加熱処理温度の上昇とともに吸光度が上昇していることが確認される。メイラード反応が進行し、メラノイジンの生成が促進されたものと思料される。一方、加熱処理温度が上昇すると嗜好性が若干低下することが確認された。加熱処理温度は、反応性及び嗜好性の観点から８０℃前後が最も好ましいことが確認された。 （試験例２：各種糖添加による褐変物質の生成） 中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））１ｋｇをエタノールにより脱脂処理を施した。次に脱脂処理ＲＪ中の固形分に対して溶媒として１０倍量の蒸留水を添加し、６５℃まで昇温した。次に、５ＮのＮａＯＨを用いて溶媒のｐＨを７．５に調整後、中性プロテアーゼとしてサーモリシン(脱脂処理ＲＪ中の固形分に対して２％)を添加し、加水分解反応を行なった。尚、サーモリシンは、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を使用した。サモアーゼＰＣ１０Ｆは、９００００ＰＵ／ｇ以上の力価（１ＰＵ＝カゼイン（終濃度０．５％）にｐＨ７．２、３５℃で作用するとき、反応初期の１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性低分子分解産物を生成するのに必要な酵素量）を有している。 ４時間の加水分解反応後、濾過助剤として珪藻土６００Ｓを脱脂処理ＲＪ中の固形分に対して５０％量を添加し、吸引濾過した。濾液を凍結乾燥し、得られた粉末を酵素処理ＲＪとした。この酵素処理ＲＪ９重量部に対して、表２に示される実施例１、参考例２及び各比較例の糖を１重量部、並びに蒸留水を１００重量部添加後、３ＮのＨＣｌを用いてｐＨ５．０に調整した。調整した混合液は、８０℃で３時間加熱処理した。冷却後、メイラード反応で生じる褐変物質(メラノイジン)の吸収波長（abs460nm）を測定した。結果を表２に示す。尚、比較例１は糖を添加せず且つ加熱処理を行なっていない。また、比較例２は、糖を添加せずに加熱処理を行なった。 表２に示されるように実施例１及び参考例２は、褐色物質が多く生成したことが確認された。一方、ヘキソースを使用した比較例３〜５は、加熱による褐色物質の生成はほとんど見られなかった。二糖類を使用した比較例６，８は、加熱による褐色物質の生成はほとんど見られなかった。テトロースアルコール（４炭糖）を使用した比較例７は、加熱による褐色物質の生成はほとんど見られなかった。 （試験例３、血糖値上昇抑制作用試験） ＲＪペプチドの血糖値上昇抑制作用を確認するため、ショ糖をラットに経口負荷し、その血糖値の時間推移に及ぼす影響を検討した。 本試験例には、６週齢の雄性Wistarラットを日本ＳＬＣ社より入手して使用した。動物は室温２３±１℃、相対湿度５５±１０％、照明時間１２時間／日（８：００〜２０：００）の条件で、日本チャールズリバー社の固形飼料ＣＲＦ−１を与えて飼育し、飲料水は水道水を自由に摂取させた。入荷後、１週間の予備飼育を行い、健康状態に異常を認めない動物を試験に用いた。 試験試料として、実施例の試料は、上記実施例１の糖としてキシロースを使用したＲＪペプチド（凍結乾燥）を使用した。比較例９の試料として、プロテアーゼ（サモアーゼ）処理前の脱脂処理したＲＪ（凍結乾燥）を使用した。比較例１０として、実施例１と同様の条件でサモアーゼ処理した後の酵素処理ＲＪ（凍結乾燥）を使用した。比較例１１として、サモアーゼ処理前の脱脂処理したＲＪに糖としてＤ−キシロースを添加し、実施例１と同様の条件で加熱処理したＲＪ（凍結乾燥）を使用した。また、陽性対照として、α-グルコシダーゼ阻害活性を有するアルカボースを使用した。各試料は、２ｇ／ｋｇ／１０ｍＬになるように蒸留水に懸濁し調製した。アルカボースは１０ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬに調製した。 ７週齢の雄性Wistarラットを１晩絶食させた後(１群５匹)、非麻酔下で尾静脈より採血し、直接、血糖測定器（エキストラ、アボットジャパン社製）を用いて血中グルコース濃度を測定し、０時間の時の血糖値とした。コントロールとして蒸留水を使用した。各試料群は１ｇ／ｋｇ（体重）、陽性対照群ではアルカボース１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の割合で経口投与した。投与してから３０分経過した後、全群にスクロース溶液２ｇ／ｋｇ（体重）を経口投与した。スクロース経口投与から３０分後の血中グルコース濃度を測定した。抑制率は、コントロールの血糖値を抑制率０％、０時間の時の血糖値を抑制率１００％として計算した。コントロール群と各投与群間における血糖値の統計学的な差の検定はStudentのｔ検定を用いる。得られた値は平均値±標準偏差で表記し、検定での有意水準は１％未満とした。 表３に示されるように、陽性対照を含む、全ての試験群において血糖値の上昇抑制作用を有する傾向があることが確認された。その中でも実施例１が有意に血糖値の上昇抑制作用を有することが確認された。以上の結果から、ＲＪの加熱により得られる血糖値上昇抑制能は、ＲＪ中のタンパク質を中性プロテアーゼによりペプチド化し、さらにペントースとともに加熱する事によって、大幅に上昇することが確認された。 （試験例４、抗酸化活性としてのラジカル捕捉能試験を参考例として示す） ＲＪペプチドの生理活性作用の一つである抗酸化作用をラジカル捕捉能試験によって比較した。本試験例では、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨ(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)が抗酸化物質により還元されて退色することを利用するものである。試験試料として、試験例３で使用した実施例１及び比較例９〜１１で得られた試料（凍結乾燥）を使用した。 各例の試料を無水エタノール中に１％、２％、及び３％の濃度になるようにそれぞれ溶解させて試料溶液を調製した。前記各試料溶液１００μＬに、１７０μＭのＤＰＰＨエタノール溶液１．９ｍＬを加えて混合し、ＤＰＰＨエタノール試料溶液とした後、室温（２２℃）で１５分間反応させた。そして、分光光度計（島津製作所製ＵＶ-１２００）を用いて、各ＤＰＰＨエタノール試料溶液の光の波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。尚、対照（コントロール）として溶媒のみを用いて同操作を行なった。ＤＰＰＨラジカル捕捉率は以下の式より求めた。そして、検量線を作成して５０％阻害濃度ＩＣ50(ｍｇ/ｍｌ)を算出した（試験はｎ＝２で測定）。その結果を表４に示す。なお、表４においてＩＣ50の値が低いほど抗酸化作用が強いことを示している。 ＤＰＰＨラジカル捕捉率（％）＝｛（Ａｃ−Ａｓ）／Ａｃ｝×１００ Ａｃ：コントロールの吸光度 Ａｓ：ＤＰＰＨ溶液添加時の吸光度−エタノールのみ添加時の吸光度 表４に示されるように、脱脂処理したＲＪをサモアーゼで処理し、さらにペントースを用いてメイラード反応を行なった実施例１は、サモアーゼ処理のみ行なった比較例１０及びメイラード反応のみ行なった比較例１１よりもＤＰＰＨラジカル捕捉率が高いことが確認される。 フリーラジカルは、悪性腫瘍、心疾患、脳血管疾患等の種々の疾患の原因因子と考えられている。フリーラジカルを除去する作用を有するＲＪペプチドはそれらの疾患の予防及び治療のための有効な成分になり得る。したがって、フリーラジカル除去能の発揮を目的とする飲食品、化粧品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。 （試験例５、メイラード反応と抗酸化活性との関係を参考例として示す） メイラード反応と抗酸化活性との関係について試験した。試験例１に示される方法により、中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））からサーモリシンを用いて、最終的に粉末状の酵素処理ＲＪを得た。この酵素処理ＲＪ１８重量部に対して、キシロースを２重量部、及び蒸留水を２００重量部添加後、３ＮのＨＣｌを用いてｐＨ５．０に調整した。調整した混合液は、温度９０℃で加熱処理した。３０分毎（最高７時間）に反応液を採取し、メイラード反応で生じる褐変物質(メラノイジン)の生成を吸収波長（abs460nm）で測定するとともに抗酸化作用（ＤＰＰＨラジカル捕捉率）も併せて測定した。抗酸化作用は、試験例４の方法にしたがって測定した。結果を図１に示す。 図１に示されるように、加熱処理時間と共に吸光度（abs460nm）も上昇していることが確認される。また、加熱処理時間と共に抗酸化活性も上昇していることが確認される。つまり、褐変物質の生成に比例して抗酸化活性も上昇していることが確認される。酵素処理とメイラード反応を行った加熱処理ＲＪペプチドによる抗酸化活性の上昇は、褐変物質(メラノイジン)由来の作用であることが推認された。メイラード反応と抗酸化活性との関係を示すグラフ。 ローヤルゼリー由来のタンパク質をサーモリシンにより加水分解し、該加水分解されたタンパク質をキシロースとともに７０〜８５℃で１〜５時間加熱することにより得られるローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有することを特徴とする血糖上昇抑制剤。

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