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| タイトル： | 公開特許公報(A)_電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物 |
| 出願番号： | 2008079627 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C07D 491/16,C07D 213/22,C07F 15/00 |
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藤井 永治 JP 2009234934 公開特許公報(A) 20091015 2008079627 20080326 電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物 パナソニック株式会社 000005821 岩橋 文雄 100097445 内藤 浩樹 100109667 永野 大介 100109151 藤井 永治 C07D 491/16 20060101AFI20090918BHJP C07D 213/22 20060101ALI20090918BHJP C07F 15/00 20060101ALN20090918BHJP JPC07D491/16C07D213/22C07F15/00 A 7 ＯＬ 10 4C050 4C055 4H050 4C050AA02 4C050AA08 4C050BB07 4C050CC07 4C050DD08 4C050EE02 4C050FF05 4C050GG01 4C050HH04 4C055AA01 4C055AA15 4C055BA02 4C055BA50 4C055CA01 4C055DA01 4C055DA06 4C055DA28 4C055DB02 4C055DB11 4C055EA01 4C055GA02 4H050AA01 4H050AA03 4H050AB91 4H050WB14 4H050WB21 本発明は、電気化学発光物質の発光波長で蛍光色素を励起させ、蛍光を得る化学物質に関する。さらに詳しくは、本発明は、電気エネルギーを用いて電気化学発光物質を発光させ、この発光波長と蛍光物質の励起波長が重なっているため、蛍光共鳴エネルギー転移が生じて蛍光物質を励起可能な化合物に関する。 従来、生化学アッセイに用いられる光の測定法には、吸光・蛍光法や発光法等がある。発光法による測定は、高感度に測定が可能であることが知られている。この内電気エネルギーによって励起され発光する現象を、電気化学発光と呼ぶ。電気化学発光する物質としてルテニウム錯体やオスミウム錯体が挙げられる。電気化学発光の反応は、例えば電気化学発光を示す代表的な物質にルテニウムビピリジル錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+ がある。電気化学発光の作用機序は、電極上でトリプロピルアミン等によりラジカルを発生させ、ルテニウムビピリジル錯体に電子を渡し、励起状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３＋となり、基底状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）２＋に戻る時に発光を生じる（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。この様に電気化学発光は、電気化学エネルギーにより発光種を励起し、その励起状態が放射失括する際に可視光線を放出する。発光種の励起には電気化学エネルギーを利用するため、吸光法や蛍光法に比べバックグランドノイズを減らすことが可能である。 このため、電気化学発光法は、吸光法や蛍光法よりも高感度に測定が可能となる。電気化学発光による測定は、ＤＮＡ等の核酸測定や、抗原や抗体の測定として種々のアッセイに利用されつつある（例えば、非特許文献３参照）。また、蛍光法の一種である、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：以下ＦＲＥＴ）は、供与体となる分子の蛍光スペクトルと受容体となる分子の励起スペクトルに重なりがあり、それらの分子が近傍にある場合、供与体を励起するとエネルギーが受容体に移動して受容体となる分子が励起される現象である。異なる周波数(波長)で蛍光を発する２つの蛍光物質が一方の標識から他方へエネルギーを転移することができるのに十分に互いに隣接している場合に検出可能である。 ＦＲＥＴは、エネルギーが励起した供与体分子から受容体分子への移動である無放射プロセスである。この移動の効率は、エネルギー供与体と受容体分子との間の距離に依存する。エネルギー移動速度は、供与体と受容体との間の距離の関数で表され、エネルギー移動効率は、距離の変化に非常に感度が高く、エネルギー移動は、1−１０ｎｍの距離範囲で検出可能な効率が得られるといわれている（例えば、特許文献１参照及び特許文献２参照。）。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，７６，５３７９−５３８６Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００４，１０４，３００３−３０３６Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２、３１５５−３１５９特表２００６−５０５７７５号公報特表２００５−５３８７３５号公報 しかしながら、前記従来の構成では、供与体の蛍光波長で受容体を励起させるために、別途外部光源装置が必要となる。このため、外部光源装置のノイズをカットするために、フィルターを入れる必要があるという課題があった。 本発明は、前記従来の課題を解決するため、供与体の蛍光波長で受容体を励起させるための外部光源装置を必要とせずＦＲＥＴ測定が可能となる化合物を提供することを目的とする。 本発明は前記課題を解決するため、外部の励起光を必要とせず、電気化学発光の波長のみで、受容体を励起させることが可能であり、下記の化学式（化１）を満足する化合物であることを特徴とする。 本発明の測定方法は、電気化学発光による受容体の蛍光測定であるため、外部励起光のノイズを受けない高感度測定が可能となる。 以下に、本発明の免疫測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。 （実施の形態１） （電気化学発光物質と蛍光物質の合成） 前記化合物は、以下のようにして得る。まず、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。 一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た（収率４７％）。窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。 反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６１・５％）。塩化ルテニウム（III）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。 析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た（収率６８．２％）。窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、前記生成物Ｃ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率８１．６％）。さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。 次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｅを得た（収率７１．４％）。アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｅ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。 次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、（化２）に示す電気化学的に活性である物質を得た（収率８７．５％）。 表１は、前述のようにして得た化２に示す物質の１Ｈ‐ＮＭＲ結果である。 ＮＭＲの結果より、（化２）が得られたことが判明した。 続いて、標識剤化２と蛍光物質を以下のようにして結合させた。まず、蛍光物質であるＴｅｘａｓ Ｒｅｄ ２８３μｇ（２９．７ｐｍｏｌ）を蒸留水０．２ｍＬに溶解させ、１ｍＭに調製した化２の水溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、ＷＳＣ５．１ｍｇ（２６．７μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン０．９μＬ（９０．０ｐｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して標識剤と蛍光物質が直接結合した（化３）を得た（収率７９．８％）。 以下に本発明の（化３）を用いた電気化学発光測定について、その詳細を説明する。図1に測定に利用した電極の構造図を示す。電極は、作用極１、対極２及び参照極３とから成る。この電極に用いる材料は、特に限定されず、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体等が挙げられる。 また、例えば、ステンレス鉄線全般、純ニッケル、モネルメタル、チタニウム、銅、真鍮、アルミニウム及び同合金線、鉄線、亜鉛めっき鉄線などで作製されたメッシュ金網や、該メッシュ金網を金、白金、ニッケル、パラジウム、ロジウム、銅、銀、クロム、亜鉛、錫、半田、鉛などのメッキが可能な単一金属やこれらの合金で被覆するのでもよい。また、電鋳法により作製することも可能であり、例えば金、ニッケル、銅、鉄、銀、コバルト、亜鉛などの単一金属やそれらの組み合わせでもよい。また被覆の方法としては他に、真空蒸着法または浸漬法なども挙げられる。 本実施例では、金電極を使用した。作製には、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成した。 この作用極１に、（化３）を滴下し固定させる。固定化手法は特に限定されず、公知の方法が利用できる。例えば、電極上で乾燥させる手法や、電極上に導電性のある樹脂をコーティングし、その樹脂と物理吸着させる手法、カチオン若しくはアニオン性の樹脂を電極に塗布し、静電的に吸着させる手法、電極に正若しくは負電荷を帯びさせて、電気的に吸引させる手法等が挙げられる。さらに、固相が金電極である場合には、（化３）にチオール基を導入すると、金とイオウとの共有結合を介して、（化３）が該金電極に固定される。この（化３）にチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されているものを利用すれば良い。前記方法によって得られたチオール基を有する（化３）を、金電極に滴下し、低温下で数時間放置することにより、（化３）が電極に固定される。 作用極１に（化３）を５μＬ滴下（最終濃度：１Ｅ−７ Ｍ）し、６０度中で５分静置させ、乾燥させた。さらに、電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で1分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。作用極に電解液をそれぞれ７５μＬ滴下した。その後、電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧掃印中における最大発光量を測定した。電解液の組成はリン酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ７．４）に０．１Ｍのトリエチルアミンを溶解させたものを使用した。 また、電気化学活性物質由来の電気化学的な信号は、添加する種類により異なるが、酸化還元電流を生じる電気化学活性物質を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる電気化学活性物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。 以上、説明した金電極を持つ測定プレートを用いて、次の物質の蛍光強度（Ａ．Ｕ．）を測定した。Ｒｕ錯体の発光波長である６２０ｎｍを除去するために、６６０ｎｍの光学フィルターを用いて蛍光測定を行った。 （１）電気化学発光物質（Ｒｕ錯体単体） （２）本発明（化３）である電気化学発光物質と蛍光物質の化合物 （３）蛍光化合物 （４）電気化学発光物質と蛍光物質の混合物 結果を図２に示す。（１）のＲｕ錯体単体（最終濃度：１Ｅ−７ Ｍ）と（３）蛍光化合物のみでは、蛍光は測定されていない。（１）のＲｕ錯体単体では、電気化学発光が起こり、６２０ｎｍの最大発光波長を生じるが、光学フィルターにより６５０ｎｍ以下の波長が除去されているため、蛍光が測定されない。また、（３）蛍光化合物のみでは、励起波長が無いため、蛍光が測定されていない。（２）の本発明の（化３）では、６５０ｎｍ以降蛍光が得られた。また、電気化学発光物質と蛍光物質を共有結合していないフリーな物質の混合物では、（２）の蛍光強度に比べ約１００分の１程度であった。本発明である（化３）は、外部の励起光を必要とせず、電気化学発光の波長のみで、受容体を励起させ、蛍光を得ることが可能である。これは、従来のＦＲＥＴによる蛍光測定と同等の蛍光が得られた。従って、外部励起光によるノイズの影響が無く、蛍光測定が可能となる。 本発明の化合物は、電気化学発光の波長を利用して蛍光物質を励起するため、外部励起光のノイズが少なく高感度に蛍光測定する装置として有用である。測定に利用した電極の構造を示す図各物質の蛍光強度図符号の説明 １ 作用極 ２ 対極 ３ 参照極電気化学発光物質と蛍光物質が化１を満足する電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。前記蛍光物質の励起波長は、前記電気化学発光物質の発光波長と重なり蛍光を発する物質である請求項１に記載の電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。前記電気化学発光物質と前記蛍光物質との距離に応じて蛍光量が異なる請求項１に記載の電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。前記電気化学発光物質と前記蛍光物質との距離が近い時、好ましくは５ｎｍ以下の場合、蛍光物質の蛍光量が増加する請求項１に記載の電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。前記電気化学発光物質と前記蛍光物質との距離が遠い時、好ましくは５０ｎｍ以上の場合、蛍光物質の蛍光量が低下する請求項１に記載の電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。前記電気化学発光物質がルテニウムを含む請求項１に記載の電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。前記電気化学発光標識がオスミウムを含む請求項１に記載の電気化学発光物質の発光で蛍光物質を励起する化合物。 【課題】供与体の蛍光波長で受容体を励起させるための外部光源装置を必要とせずＦＲＥＴ測定が可能となる化合物を提供する。【解決手段】互いの距離によって各々の蛍光量が異なる電気化学発光物質と蛍光物質とから成る化合物で、電気化学発光物質と蛍光物質の距離が近い時、好ましくは５ｎｍ以下の場合には蛍光量が増加し、且つ電気化学発光物質と蛍光物質の距離が遠い時、好ましくは５０ｎｍ以上の場合には蛍光量が低下する蛍光物質とからなる化合物。【選択図】なし