生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_タラコタンパク質由来アンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
| 出願番号： | 2008074852 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | A61K 38/00,C12N 9/99,A23L 1/305,A61K 38/55,A61P 43/00,A61P 9/12 |
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畑中 晃昌 宮原 裕子 JP 2009227608 公開特許公報(A) 20091008 2008074852 20080324 タラコタンパク質由来アンジオテンシン変換酵素阻害剤 日本水産株式会社 000004189 畑中 晃昌 宮原 裕子 A61K 38/00 20060101AFI20090911BHJP C12N 9/99 20060101ALI20090911BHJP A23L 1/305 20060101ALI20090911BHJP A61K 38/55 20060101ALI20090911BHJP A61P 43/00 20060101ALI20090911BHJP A61P 9/12 20060101ALI20090911BHJP JPA61K37/18C12N9/99A23L1/305A61K37/64A61P43/00 111A61P9/12 7 3 ＯＬ 8 4B018 4C084 4B018MD20 4B018ME04 4C084AA02 4C084AA03 4C084AA07 4C084BA03 4C084BA43 4C084CA45 4C084MA52 4C084NA14 4C084ZA42 4C084ZC20 本発明はアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、血圧低下作用を有するペプチドを含有する組成物、その組成物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤、およびその組成物を有効成分とする血圧低下剤および血圧低下用食品に関する。 生体内の血圧調節はレニンーアンギオテンシン−アルドステロン（RAA）系、カリクレイン−キニン系、及びプロスタグランジン合成系等が相補的に関与していることが知られている。中でもRAA系は体液系での昇圧調節の中心的役割を担っているとされている。すなわち、肝臓で産生されたアンギオテンシノーゲンは腎由来の酵素レニンによって血中内で10アミノ酸残基のアンギオテンシン−Iに分解され、次いで主に肺に存在するアンギオテンシン−II変換酵素（ACE）の作用により8アミノ酸残基のアンギオテンシン−IIに変換される。アンギオテンシン−IIは生体内において最も強力な昇圧物質であり、血管平滑筋を収縮させる直接的昇圧作用を有しているだけでなく、副腎でのアルドステロン分泌を刺激し、ナトリウムや水の貯留量増大を引き起こし間接的な血圧上昇にも関与する。従って、RAA系の亢進阻害が血圧上昇抑制に有効であることが臨床的に知られており、薬物療法的にはカプトプリル等のACE阻害剤、あるいはロサルタン等のアンギオテンシン−IIレセプターアンタゴニストの使用が有効である。 近年、食品成分をターゲットとしたACE阻害性物質の研究が進み、種々のタンパク質由来ペプチドが有効なACE阻害活性、更には血圧降下作用を示すことが知られている（特許文献１−３等）。特開平５−２７１２９７号特開２００５−１４５８２７号特開２００８−３７７６６号 本発明は、副作用がなく安全で、血圧低下作用を有し、医薬品や食品として摂取することができる血圧低下成分を提供することを目的とする。 各種タンパク質由来のペプチドにアンジオテンシン変換酵素阻害活性があることが知られている。本発明者は、これまで知見がないタラコのタンパク質にもアンジオテンシン変換酵素阻害活性があることを見出し、本願発明を完成させた。 本発明は、（１）〜（４）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を要旨とする。（１）タラコタンパク質の酵素分解物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。（２）タラコタンパク質の酵素分解物がタラコの蛋白質を蛋白質分解酵素で分解して得られるものである（１）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。（３）蛋白質分解酵素が食品に使用することができる酵素である（２）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。（４）蛋白質分解酵素がAspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus melleus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Rhizopus oryzae属菌株由来ペプチダーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来ペプチダーゼのいずれか1種又は２種以上の酵素である（２）又は（３）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 本発明は、（５）〜（７）の血圧降下剤、食品を要旨とする。（５）（１）〜（４）いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤。（６）（１）〜（４）いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する食品。（７）高血圧症の予防・改善に有効であることを記載した食品である（６）の食品。 本発明のペプチドはアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、経口投与により血圧低下作用を有するので、経口投与で高血圧の予防、治療に有効である。 本発明においてタラコとはスケソウダラ、マダラ、ミナミダラなどタラ類の魚の卵巣（魚卵）である。本発明の活性成分は、これらタラコのタンパク質をタンパク質分解酵素で分解したペプチドである。 本発明のタラコタンパク質の酵素分解物は、タラコを酵素処理に適するように前処理したうえで、蛋白質分解酵素処理しペプチドを生成させ、これを必要に応じて、分離、濾過、濃縮、殺菌処理することによって得ることができる。 本発明の組成物はタラコを原料として製造するものであるが、先ず、酵素処理に適するように前処理する。主な処理は、卵巣膜を除去してバラ子とし、卵粒の膜（卵膜）が酵素処理の邪魔になるので物理的あるいは化学的に破壊する。すなわち、ホモジナイザー、エマルダーというような均質化する装置で卵膜を壊して液状にしたり、化学的に卵膜を壊したりする。卵膜を破壊したタラコ原料を好ましくは脱脂してから、酵素処理に付す。 酵素処理は、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましくは等量〜１０倍量の加水を行った後、アンモニア水、水酸化ナトリウム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、２０〜６５℃、室温でも十分に反応する）に加温し、蛋白分解酵素を加えて３０分〜３０時間（好ましくは１〜１０時間）処理する。 蛋白分解酵素としては、中性又はアルカリ性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植物のほかに微生物に求めることができ、ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメレインのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用することができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％程度でよい。 好ましい蛋白分解酵素としては、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus melleus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Rhizopus oryzae属菌株由来ペプチダーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来ペプチダーゼなどが例示される。特に好ましいのは、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼであるサーモライシンである。 酵素処理後、必要あれば中和処理を行った後、７０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるとともに後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、ハイブロスクリーン等による濾過によって粗分離し、必要によりジェクター処理した後、遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物を除去する。そのままでもアンジオテンシン転換酵素阻害活性を有するのでそのまま用いてもよいが、原料由来の独特の味や臭いがあるので、使用目的によってはさらに濾過、活性炭処理などにより、脱臭、脱色、精製する。殺菌、噴霧乾燥、凍結乾燥なども必要に応じて行う。 本発明のタラコタンパク質の蛋白質酵素分解物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤は実施例に示すようにすぐれたＡＣＥ阻害活性を有することが確認されたので、ＡＣＥ阻害剤、あるいは、血圧降下を目的とした医薬品、健康食品、特に特定保健用食品としても使用することができる。食品として使用する場合には、酵素分解物をそのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤とすることができる。 本発明のアンジオテンシン転換酵素阻害剤であるタラコタンパク質酵素分解物の使用のめやすは、約０．１〜６０００ｍｇ／日であり、１日に１〜２回経口投与するのが好ましい。また必要ある場合には、他の薬剤との併用も可能である。本発明のタラコタンパク質の蛋白質酵素分解物は食品として長い食経験のあるタラコの酵素分解物であり、安全性が高く、安心して使用できる。 以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。スケソウダラ・タラコタンパク質由来ペプチド粉末の製造 スケソウダラ・タラコを凍結乾燥した後に乳鉢及びフードプロセッサーを用いて粉末乾燥物を得た。次いで粉末乾燥物の約2倍量のヘキサンを加え十分に攪拌して脱脂を行った。濾紙で濾過した後に更に約2倍量のヘキサンで計3度洗浄を行った。濾紙を用いて濾過した後に残渣を室温で風乾しヘキサンを除去したもの(10g)をサーモライシン（ナカライテスク社製、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ）を用いた酵素分解に供した。酵素分解はタラコタンパク質（約20 mg/mL）に対し約1/100量になるようにサーモライシンを添加し70℃で24時間の条件下で反応させ、沸騰水中30分の加熱で酵素を失活させた。次いで、5,000 rpm/10分の遠心分離を行った後に清澄濾過液を凍結乾燥を行い、スケソウダラ・タラコタンパク質由来ペプチド粉末を得た(6.7g)（本発明品）。ゲル電気泳動分析 タンパク質のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は4-20％濃度勾配ゲル（第一化学社製）を用いLaemmliの方法に従って還元状態下で行った。タンパク質バンドの染色にはクマシーブリリアントブルーR-250を用いた。 本発明品のスケソウダラ・タラコタンパク質由来ペプチド粉末をSDS-PAGEにて解析した結果、図1に示すようにタンパク質バンドの分子量からリポビテリン重鎖及びリポビテリン軽鎖と考えられるタンパク質を主成分とすることが分かった。アンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害活性の測定 ウサギ肺由来ACE、ACEの基質であるN-[3-(Furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly（FAPGG）、及び陽性対照として用いたバリルチロシンはSigma社製を用いた。ACE阻害活性の測定はPetersonらの方法（Anal. Biochem. 125; 420-426 (1982)）を改変して行った。すなわち、18 μLの250 mM HEPES pH 8.3、1.5 M NaCl、10 μLの90 μg/mLに調製したACE、及び適宜希釈した被験物質を混合し90 μLとし室温で15分間、室温でプレインキュベーションを行った。次いで、上記反応液に10 μLの50mM HEPES pH 8.3、300 mM NaCl及び1.5 mM FAPGGを加え室温で2-3時間、インキュベーションを行った。阻害活性の測定は320 nmの吸光度を測定することで行い、ACEを50％阻害する被験物質量をIC50として阻害活性を表した。 本発明品のスケソウダラ・タラコタンパク質由来ペプチド粉末のIC50を測定した結果、133.68μg/mLであった（図2A）。一方、陽性対照として用いたバリルチロシンのIC50は27.42 μg/mLであった（図2B）。単回経口投与によるスケソウダラ・タラコ由来ペプチドの降圧作用 本試験には7週齢雌性ラット（SHR/Izm、SPF）（日本エスエルシー）を用いた。ラットは室温22±3℃、相対湿度50±20％、照明時間12時間/日、換気回数13-17回/時間の条件下で固型飼料（ラボMRストック（日本農産工業製））を与えて飼育し飲料水は自由に接種させた。 7週齢のラットを上記の環境で1週間予備飼育し馴化して収縮期血圧がほぼ同一になるように群分けを行った（各群６尾）。群分けの後に一晩絶食させたラットに被験物質を強制的に単回経口投与を行い（スケソウダラ・タラコタンパク質由来ペプチド粉末は10 mg/kg、100 mg/kg及び1000 mg/kg投与群、陽性対照のバリルチロシンは10 mg/kg投与群で行った）、投与2、4、6、8及び24時間後に小動物無加温型非観血圧計MK-2000（室町機械製）で血圧及び心拍数の測定を行った。 本発明品のスケソウダラ・タラコタンパク質由来ペプチド粉末10 mg/kg投与群、100 mg/kg投与群及び1,000 mg/kgはほぼ投与量依存的な傾向で血圧の低下を示し、それぞれ投与前174±4.53mmHg、173±5.51 mmHg及び174±4.66 mmHgから投与4時間後に、それぞれ146±2.27 mmHg及び154±4.64 mmHgに有意に血圧が降下した（それぞれ、p<0.01及びp<0.05; Dunnet検定）。また、100 mg/kg投与群及び1,000 mg/kg投与群における降圧値は、それぞれ-28 mmHg及び-17 mmHgであった。また、100 mg/kg投与群では有意な降圧は6時間後まで持続した（p<0.05; Dunnet検定）（図３）。 なお、スケソウダラ・すり身由来ペプチド及びバリルチロシンの単回投与試験において心拍数は全ての投与群で対照群と比べて有意な差はなかった（図４）。 実施例１のアンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害活性の測定方法と同じ方法で、各種酵素で分解したタラコタンパク質酵素分解物の活性を測定した。使用した酵素（いずれも天野エンザイム株式会社製）プロテアーゼM「アマノ」G（Aspergillusoryzae属菌株由来プロテアーゼ剤）プロテアーゼN「アマノ」G（Bacillussubtilis属菌株由来プロテアーゼ剤）プロテアーゼA「アマノ」G（Aspergillusoryzae属菌株由来プロテアーゼ剤）プロテアーゼP「アマノ」3G（Aspergillusmelleus属菌株由来プロテアーゼ剤）プロテアーゼS「アマノ」G（Bacillusstearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ剤）プロレザーFG-F（Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ剤）ペプチターゼR（Rhizopusoryzae属菌株由来ペプチダーゼ剤）ウマミザイムG（Aspergillusoryzae属菌株由来ペプチダーゼ剤） 結果を図５に示す。各分解物の濃度は100μg/mLである。いずれの酵素による分解物にもＡＣＥ阻害活性が認められた。特にBacillus stearothermophilus属属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属株由来ペプチダーゼに優れた効果が認められた。 本発明のタラコタンパク質の酵素分解物はアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有し、血圧降下作用を有するので高血圧症の治療・予防薬を提供することができる。スケソウダラ・タラコタンパク質の酵素分解物の電気泳動図を示した写真である。スケソウダラ・タラコタンパク質の酵素分解物のACE阻害活性を示す図である（Ａはスケソウダラ・タラコ由来ペプチド、Ｂはバリルチロシン）。スケソウダラ・タラコタンパク質の酵素分解物の血圧降下作用を示す図である。スケソウダラ・タラコタンパク質の酵素分解物の心拍数に対する影響を示す図である。各種酵素により分解したスケソウダラ・タラコタンパク質の酵素分解物のACE阻害活性を示す図である。（図中、M：プロテアーM「アマノ」G、N：プロテアーゼN「アマノ」G、A：プロテアーゼA「アマノ」G、P：プロテアーゼP「アマノ」3G、S：プロテアーゼS「アマノ」G、F：プロレザーFG-F、R：ペプチターゼR、G：ウマミザイムG） タラコタンパク質の酵素分解物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 タラコタンパク質の酵素分解物がタラコの蛋白質を蛋白質分解酵素で分解して得られるものである請求項１のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 蛋白質分解酵素が食品に使用することができる酵素である請求項２のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 蛋白質分解酵素がAspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus melleus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Rhizopus oryzae属菌株由来ペプチダーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来ペプチダーゼのいずれか1種又は２種以上の酵素である請求項２又は３のアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 請求項１ないし４いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を有効成分とする血圧降下剤。 請求項１ないし４いずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する食品。 高血圧症の予防・改善に有効であることを記載した食品である請求項６の食品。 【課題】副作用がなく安全で、血圧低下作用を有し、医薬品や食品として摂取することができる血圧低下成分を提供すること【解決手段】 タラコタンパク質の酵素分解物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。好ましくは、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来プロテアーゼ、Aspergillus melleus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus stearothermophilus属菌株由来プロテアーゼ、Bacillus subtilis属菌株由来プロテアーゼ、Rhizopus oryzae属菌株由来ペプチダーゼ、Aspergillus oryzae属菌株由来ペプチダーゼのいずれか1種又は２種以上の酵素で分解した酵素分解物である。【選択図】 図３