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| タイトル： | 公開特許公報(A)_ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡによるスキルス胃がん細胞の増殖阻害 |
| 出願番号： | 2008071510 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C12N 15/09,A61K 31/7088,A61P 35/00 |
特許情報キャッシュ
金子 勲 恩田 弘明 JP 2009225672 公開特許公報(A) 20091008 2008071510 20080319 ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡによるスキルス胃がん細胞の増殖阻害 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 598001179 独立行政法人医薬基盤研究所 505314022 田中 光雄 100081422 山崎 宏 100084146 元山 忠行 100116311 冨田 憲史 100122301 金子 勲 恩田 弘明 C12N 15/09 20060101AFI20090911BHJP A61K 31/7088 20060101ALI20090911BHJP A61P 35/00 20060101ALI20090911BHJP JPC12N15/00 AA61K31/7088A61P35/00 5 ＯＬ 9 4B024 4C086 4B024AA01 4B024BA80 4B024CA04 4B024CA11 4C086AA01 4C086AA02 4C086AA03 4C086EA16 4C086MA01 4C086MA04 4C086NA14 4C086ZB26 本発明は、スキルス胃がん細胞の増殖を阻害するＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡおよびこれらを含む医薬組成物に関する。 日本における胃がん死亡者数は年間約５万人と多いが、早期胃がんでは約９割、胃がんでも約６割と治癒率（治療後５年間生存している割合）は向上している。しかし、胃がん全体の約１０％を占めるスキルス胃がんは極めて悪性であり、ほとんど治療効果が認められない（非特許文献１）。その意味で、一刻も早くスキルスがんに有効な治療薬の開発が切望されている。そのために、これまで、インビトロ培養系で増殖可能な胃がん細胞の培養樹立細胞株を用いる研究が行われており、そのｍＲＮＡの発現解析から、ＦＧＦＲ２がスキルス胃がん細胞株であるＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株に強発現していることが報告されている（非特許文献２）。 さて、たんぱく質の機能を解析する手段の一つとして、標的のたんぱく質を特異的に発現している細胞に対し、低分子干渉性ＲＮＡ（以下、ｓｉＲＮＡという）をトランスフェクションして、ｍＲＮＡを特異的に分解することにより発現を阻害し、その機能を解析する手段がよく用いられている。実際に、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（以下、ＦＧＦＲ２という）に関しても、ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡをＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株にトランスフェクションし、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株の増殖が阻害されることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、どの配列のｓｉＲＮＡが強い阻害作用を発揮するか、および他のスキルス胃がん細胞株への阻害作用については明らかにされていない。Hansen, K.C. et al, Mol. Cell Proteomics, 2:299-314, 2003Matunobu T., Ishiwata T. et al, Int. J. Onco, 2:307-314,2006Masayuki T, et al., Clin Cancer Res, 13:3051-3057, 2007金子 勲：疾患関連たんぱく質解析研究 平成18年度 総括・分担研究報告書 p. 104-144 したがって、本発明の課題は、ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡの核酸配列を検討し、スキルス胃がん細胞の増殖に対して阻害作用の強いｓｉＲＮＡの核酸配列およびそれを有効成分として含むスキルス胃がん治療用の医薬組成物を提供することである。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして驚くべきことに、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株にＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡ、特に配列番号５および６で表される核酸配列からなるｓｉＲＮＡをトランスフェクションすると細胞の増殖を著しく阻害することを見出した。 すなわち、本発明は： （１）ＦＧＦＲ２たんぱく質の発現を阻害することによりスキルス胃がん細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡであって、配列番号１および２、３および４、５および６、または７および８で表されるいずれかのＲＮＡ配列の組からなる二本鎖で構成されるｓｉＲＮＡ、 （２）ＦＧＦＲ２たんぱく質の発現を阻害することによりスキルス胃がん細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡであって、配列番号９および１０、１１および１２、１３および１４、または１５および１６で表されるいずれかのＲＮＡ配列の組からなる二本鎖で構成されるｓｉＲＮＡ、 （３）配列番号５および６で表されるＲＮＡ配列の組からなるｓｉＲＮＡであって、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株およびＮＵＧＣ−４細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡ、 （４）有効成分として（１）〜（３）のいずれか１つに記載の１種またはそれ以上のｓｉＲＮＡを含む、スキルス胃がんの治療のための医薬組成物、 （５）有効成分として（３）に記載のｓｉＲＮＡを含む、スキルス胃がんの治療のための医薬組成物を提供するものである。 本発明によれば、スキルス胃がん細胞に由来する細胞株、特にＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株の細胞増殖を特異的に阻害することができる。これによりスキルス胃がんの細胞増殖に有効な成分を包含する医薬組成物を提供することも可能となり、スキルス胃がんを効果的に治療することができる。 本発明は、スキルス胃がん細胞の増殖を阻害するｓｉＲＮＡに関するものである。本発明では、ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡを提供する。ここで、ＦＧＦＲ２はＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２の略称であり、線維芽増殖因子の膜受容体たんぱく質の一種であることを意味する。このたんぱく質はＦＧＦシグナルを介在して線維芽細胞をはじめとするさまざまな細胞に対して増殖活性や分化誘導など多彩な作用を示すことが知られているため、スキルス胃がんの細胞増殖にも関連することが示唆される。 本発明のｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖とセンス鎖の１組からなる二本鎖で構成される。一般に、ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒと呼ばれる酵素によって分解された２１〜２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、複数のタンパク質で構成される複合体ＲＮＡ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に取り込まれて活性型ＲＩＳＣを形成する。この活性型ＲＩＳＣは、取り込まれたｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列を利用して標的ｍＲＮＡを特異的に認識・分解することにより遺伝子の発現を抑制し、たんぱく質の合成を阻害すること（この現象をＲＮＡｉという）が示されている。また、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡと相補的である。本発明のｓｉＲＮＡは、Target siRNA-17、Target siRNA-18、Target siRNA-19およびTarget siRNA-20と名付けた以下の新規ＲＮＡ配列を含む。Target siRNA-17のアンチセンス鎖（配列番号１）：５’−ＧＡＵＵＧＡＵＧＧＡＣＣＣＧＵＡＵＵＣＵＵ−３’Target siRNA-17のセンス鎖（配列番号２）：５’−ＧＡＡＵＡＣＧＧＧＵＣＣＡＵＣＡＡＵＣＵＵ−３’Target siRNA-18のアンチセンス鎖（配列番号３）：５’−ＵＣＡＧＡＵＧＧＧＡＣＣＡＣＡＣＵＵＵＵＵ−３’Target siRNA-18のセンス鎖（配列番号４）：５’−ＡＡＡＧＵＧＵＧＧＵＣＣＣＡＵＣＵＧＡＵＵ−３’Target siRNA-19のアンチセンス鎖（配列番号５）：５’−ＵＧＵＵＧＧＵＣＣＡＧＵＡＵＧＧＵＧＣＵＵ−３’Target siRNA-19のセンス鎖（配列番号６）：５’−ＧＣＡＣＣＡＵＡＣＵＧＧＡＣＣＡＡＣＡＵＵ−３’Target siRNA-20のアンチセンス鎖（配列番号７）：５’−ＵＵＵＣＧＵＡＣＣＵＵＧＵＡＧＣＣＵＣＵＵ−３’Target siRNA-20のセンス鎖（配列番号８）：５’−ＧＡＧＧＣＵＡＣＡＡＧＧＵＡＣＧＡＡＡＵＵ−３’ 本発明のｓｉＲＮＡの構成ヌクレオチド配列は上記配列番号１〜８に示す配列であるが、これらの配列において、１個、２個、または３個の塩基が付加、欠失、置換されていてもよい。さらに本発明のｓｉＲＮＡには、安定性を高めるために、例えば、３’末端に２塩基、例えばＵＵなどのオーバーハングを付加しているが、それ以外の配列を付加してもよく、あるいは３’末端のＵＵを除いた配列であってもよい。従って、本発明のスキルス胃がん細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡは、下記に示す配列番号９および１０、１１および１２、１３および１４、または１５および１６で表されるいずれかのＲＮＡ配列の組からなる二本鎖で構成されるｓｉＲＮＡであってもよい。Target siRNA-17のアンチセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号９）：５’−ＧＡＵＵＧＡＵＧＧＡＣＣＣＧＵＡＵＵＣ−３’Target siRNA-17のセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１０）：５’−ＧＡＡＵＡＣＧＧＧＵＣＣＡＵＣＡＡＵＣ−３’Target siRNA-18のアンチセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１１）：５’−ＵＣＡＧＡＵＧＧＧＡＣＣＡＣＡＣＵＵＵ−３’Target siRNA-18のセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１２）：５’−ＡＡＡＧＵＧＵＧＧＵＣＣＣＡＵＣＵＧＡ−３’Target siRNA-19のアンチセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１３）：５’−ＵＧＵＵＧＧＵＣＣＡＧＵＡＵＧＧＵＧＣ−３’Target siRNA-19のセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１４）：５’−ＧＣＡＣＣＡＵＡＣＵＧＧＡＣＣＡＡＣＡ−３’Target siRNA-20のアンチセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１５）：５’−ＵＵＵＣＧＵＡＣＣＵＵＧＵＡＧＣＣＵＣ−３’Target siRNA-20のセンス鎖から３’末端のＵＵを除いた配列（配列番号１６）：５’−ＧＡＧＧＣＵＡＣＡＡＧＧＵＡＣＧＡＡＡ−３’ 本発明の上記ｓｉＲＮＡは当業者間で一般的な方法により作成することができる。本発明のｓｉＲＮＡを作成するのに最適な方法はｓｉＲＮＡを化学的に合成することであり、これ以外にも、ｓｉＲＮＡ発現ベクターに目的のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列をクローン化して増幅すること、ｓｉＲＮＡを酵素を使用してインビトロ転写すること、ならびにｓｉＲＮＡ発現カセットをＰＣＲで合成することなどにより作成してもよいが、これらだけに限らない。 本発明では、本発明のｓｉＲＮＡを有効成分とする医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物には、配列番号１〜１６で表される８種類のｓｉＲＮＡのうち１種以上を含んでよく、好ましくは配列番号５および６で表される組のｓｉＲＮＡを含むことである。さらに本発明の医薬組成物は、公知の抗がん剤を含んでいてもよい。 本発明の医薬組成物ではまた、有効成分としてのｓｉＲＮＡが製造業者から市販されているｓｉＲＮＡ発現ベクターなどの公知のｓｉＲＮＡ発現ベクターまたは使用の態様に合わせて適宜組み換えた公知のｓｉＲＮＡ発現ベクターにクローン化されていてもよい。 本発明の医薬組成物は、医薬上許容されるキャリアを含んでもよい。本発明で用いることができる医薬上許容されるキャリアは、生理食塩水、蒸留水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、ブドウ糖溶液、マルトブドウ糖溶液、グリセロール、エタノールおよびリポソームからなる群から選択される１種またはそれ以上の成分であってよいが、これらだけに限らない。さらに本発明の医薬組成物に抗酸化剤、緩衝水溶液、静菌剤などのごとき他の一般的な添加物を添加してもよい。また、注射用溶液、ピル、カプセル、顆粒もしくはタブレット錠剤を製造するために、希釈剤、噴霧剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加してもよい。 本発明の医薬組成物を投与する形態は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内、皮下内、局所または腹膜の注射）であってもよく、患部である胃またはその近傍に効率的に有効成分を送達できればそれら以外の投与形態であってもよい。また、本発明の医薬組成物として投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効な量を、患者の状態、例えば患者の重量、年齢、性別、および健康状態など、ならびに食事量、投与の頻度、投与の方法、排泄量および病気の重症度などによって決定することができる。本発明の医薬組成物として投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効な量は、通常、１日あたり０．０１−１ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１日あたり０．０２−０．１ｍｇ／ｋｇである。 以下の実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。 ｓｉＲＮＡによるヒト胃がん培養細胞株の増殖阻害 各種ヒト胃がん細胞株（スキルス胃がん株ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、低分化充実型腺癌株のＭＫＮ−４５および中分化型腺癌株のＭＫＮ−７４）を用いて、それらの発現たんぱく質をcleavable ＩＣＡＴ（ｃＩＣＡＴ）法で解析した結果、スキルス胃がん細胞株のＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株はＦＧＦＲ２を選択的に強発現していることを確認した（非特許文献４）。このことは、ＫＡＴＯ−ＩＩＩでのＦＧＦＲ２ ｍＲＮＡの選択的強発現を、たんぱく質レベルでも確認したことを示す。そこで、ＦＧＦＲ２のｍＲＮＡレベルでその発現を阻害するｓｉＲＮＡを作成し、そのｓｉＲＮＡのＫＡＴＯ−ＩＩＩ以外のスキルス胃がん細胞株を含めた各種胃がん細胞の増殖に及ぼす効果を調べた。すなわち、ＦＧＦＲ２のｓｉＲＮＡ（DHARMACON）を、各胃がん細胞株（ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７５、ＮＵＧＣ−４およびＯＣＵＭ−１）に、トランスフェクション試薬DharmaFECT 1（DHARMACON）を用いてトランスフェクションを行い、トランスフェクション後１−７日目の細胞増殖阻害効果（１０％牛胎児血清存在下）を、ＭＴＳ法（Promega）を用いて測定した。なお、ＦＧＦＲ２のｓｉＲＮＡとしては４種類（Target siRNA-17、Target siRNA-18、Target siRNA-19およびTarget siRNA-20（表１））を混合したもの（ON-TARGET plus SMART pool FGR2, DHARMACON）およびそれぞれ単独のTarget siRNAを、また、陰性コントロールとしてはNon-Target siRNAを使用し、各細胞株への最適濃度条件下でトランスフェクションを行った。（表１）ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡの種類と配列 その結果、ｓｉＲＮＡ４種類の混合物（ON-TARGET plus SMART pool FGFR2, DHARMACON）をトランスフェクションさせた場合、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株が最も強い阻害効果を受け、また、ＮＵＧＣ−４株も弱いながら阻害効果を受けた。一方、低分化非充実型腺がん細胞株のＭＫＮ−４５と中分化型腺がん細胞株のＭＫＮ−７４は、ほとんど阻害効果を受けなかった（図１）。また、スキルス胃がん細胞株のＯＣＵＭ−１は、ＦＧＦＲ２をＫＡＴＯ−ＩＩＩ株の５％程度発現しているにも関わらず、ほとんど阻害効果を受けなかった。なお、増殖阻害実験において、ＭＴＳ法の代わりに、ＢｒｄＵ法（Roche）で行ってもほぼ同様な結果が得られた（データ省略）。 次に、４種のｓｉＲＮＡのうち、どの配列を持つｓｉＲＮＡが最も阻害効果が強いかを、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＮＵＧＣ−４細胞株を用いて調べた。表１に各ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のＲＮＡ配列とセンス鎖のＲＮＡ配列を示す。その結果、ＫＡＴＯ−ＩＩＩの場合、いずれのｓｉＲＮＡも陰性コントロールのNon-target siRNAより阻害効果は示したが、最も阻害効果の強いｓｉＲＮＡはTarget siRNA-19であり、ついでTarget siRNA-20、Target siRNA-18の順であった（図２）。また、ＮＵＧＣ−４の場合では、Target siRNA-19のみが阻害効果を示した。従って、Target siRNA-19が本発明のうち最も阻害効果の強いｓｉＲＮＡであると考えられる。 以上のことより、ＦＧＦＲ２のｓｉＲＮＡは少なくともスキルス胃がん細胞株のある種のものに対しては増殖阻害効果を示し、その中でも最も強い阻害作用を示し、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株およびＮＵＧＣ−４細胞株の両方に効果のあるｓｉＲＮＡはTarget siRNA-19であることが判明した。 本発明は、がんの医薬分野およびがんの研究分野等において利用可能である。詳細には、スキルスがんの治療薬の製造分野およびスキルスがんの研究分野などにおいて利用可能である。ＦＧＦＲ２のTarget siRNA４種混合物（ON-TARGET plus SMART pool FGFR2）による細胞増殖抑制実験の結果を示す。各種ＦＧＦＲ２ｓｉＲＮＡ（Target siRNA-17、-18、-19および-20）による増殖阻害効果を示す。SEQ ID NO:1:FGFR2 siRNASEQ ID NO:2:FGFR2 siRNASEQ ID NO:3:FGFR2 siRNASEQ ID NO:4:FGFR2 siRNASEQ ID NO:5:FGFR2 siRNASEQ ID NO:6:FGFR2 siRNASEQ ID NO:7:FGFR2 siRNASEQ ID NO:8:FGFR2 siRNASEQ ID NO:9:FGFR2 siRNASEQ ID NO:10:FGFR2 siRNASEQ ID NO:11:FGFR2 siRNASEQ ID NO:12:FGFR2 siRNASEQ ID NO:13:FGFR2 siRNASEQ ID NO:14:FGFR2 siRNASEQ ID NO:15:FGFR2 siRNASEQ ID NO:16:FGFR2 siRNA ＦＧＦＲ２たんぱく質の発現を阻害することによりスキルス胃がん細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡであって、配列番号１および２、３および４、５および６、または７および８で表されるいずれかのＲＮＡ配列の組からなる二本鎖で構成されるｓｉＲＮＡ。 ＦＧＦＲ２たんぱく質の発現を阻害することによりスキルス胃がん細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡであって、配列番号９および１０、１１および１２、１３および１４、または１５および１６で表されるいずれかのＲＮＡ配列の組からなる二本鎖で構成されるｓｉＲＮＡ。 配列番号５および６で表されるＲＮＡ配列の組からなるｓｉＲＮＡであって、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞株およびＮＵＧＣ−４細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡ。 有効成分として請求項１〜３のいずれか１項に記載の１種またはそれ以上のｓｉＲＮＡを含む、スキルス胃がんの治療のための医薬組成物。 有効成分として請求項３に記載のｓｉＲＮＡを含む、スキルス胃がんの治療のための医薬組成物。 【課題】ＦＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡの核酸配列を検討し、スキルス胃がん細胞の増殖に対して阻害作用の強いｓｉＲＮＡの核酸配列およびそれを有効成分として含む医薬組成物を提供する。【解決手段】ＦＧＦＲ２たんぱく質の発現を阻害することによりスキルス胃がん細胞株の増殖を阻害するｓｉＲＮＡであって、特定の配列で表されるいずれかのＲＮＡ配列の組からなる二本鎖で構成されるｓｉＲＮＡ、ならびにそれらを含むスキルス胃がん治療用医薬組成物。【選択図】なし配列表