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服部 久美子 JP 5031592 特許公報(B2) 20120706 2008003317 20080110 Ｂ／Ｆ分離の洗浄方法及びＢ／Ｆ分離の洗浄装置 株式会社日立ハイテクノロジーズ 501387839 特許業務法人第一国際特許事務所 110000062 服部 久美子 20120919 G01N 35/02 20060101AFI20120830BHJP G01N 1/34 20060101ALI20120830BHJP G01N 33/543 20060101ALI20120830BHJP JPG01N35/02 EG01N1/34G01N33/543 501F Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３５／１０ Ｇ０１Ｎ １／００− １／４４ Ｂ０８Ｂ ３／００− ３／１４ Ｂ０８Ｂ ９／００− ９／４６ ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ） ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） 特開２００１−２０８７５９（ＪＰ，Ａ） 特開平４−３３５１５７（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−２８９８６４（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−２９６２３３（ＪＰ，Ａ） 特開平２−４２３６２（ＪＰ，Ａ） 国際公開第２００６／０８３０４０（ＷＯ，Ａ１） 特開２００１−４１９６４（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−４９４７７（ＪＰ，Ａ） 特開平１０−９９８０１（ＪＰ，Ａ） 特許第３９４６７０１（ＪＰ，Ｂ２） 再公表特許第２００４／０９０１２９（ＪＰ，Ａ１） 特開２００６−３０８４２８（ＪＰ，Ａ） 特開２００７−３２５５６８（ＪＰ，Ａ） 特開平８−６２２１５（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−２４６２８９（ＪＰ，Ａ） 特許第３６４４６４１（ＪＰ，Ｂ２） 8 2009162733 20090723 9 20100215 遠藤 孝徳 本発明は、Ｂ／Ｆ分離の洗浄方法及びＢ／Ｆ分離の洗浄装置に関し、特に、全体としては洗浄液量を減らして効率よく洗浄を行ない、かつ、洗浄液残存の影響を低減するＢ／Ｆ分離の洗浄方法及びＢ／Ｆ分離の洗浄装置に関する。抗原または抗体の検出測定方法として、競合法あるいはサンドイッチ法等が知られている。これは、抗原抗体反応を反応容器内で行い、この抗原抗体と複合体を形成するコンジュゲートに予め標識された蛍光色素や酵素を検出する方法である。この方法では、抗原抗体と複合体を形成したコンジュゲートのみを反応容器内に残し、複合体を形成していないコンジュゲートは反応容器内から除去しなければならない。 この除去操作を一般にＢ／Ｆ（バウンド／フリー）分離といい、通常はこのＢ／Ｆ分離のために、抗原抗体反応を行う抗原あるいは抗体を反応容器内の担体に予め固定しておく。担体として例えば磁性粒子を用いる場合、抗原を表面に付加した磁性粒子に、特定の抗体を含む溶液を添加し抗原抗体反応を反応容器内で行った後、反応容器に磁石を接触あるいは接近させると、反応容器内側壁に磁性粒子が捕捉される。 その状態で、反応容器の内側壁に捕捉されなかった不純物を含む非磁性成分を、吸引用ノズルで吸引除去する。磁石を十分に離して洗浄液を分注すると、反応生成物は反応容器内側壁から離れ、磁性粒子全体に洗浄液が行き渡り、前記の吸引のみでは除去しきれなかった不純物を剥離できる。再び磁石を反応容器に接触あるいは接近させると、反応容器内側壁に反応生成物が捕捉され、さらに前記と同様に吸引用ノズルにて不純物を含んだ洗浄液を吸引除去できる。 以上の操作を繰り返すことで反応生成物の洗浄効果が高まり、より高精度な分析結果が得られる。なお、洗浄液を分注した後に攪拌作業を実施すれば、さらなる洗浄効果の向上が期待できる。 このＢ／Ｆ分離を確実に行うことにより、シグナルのバックグラウンドは小さくなり、測定の感度と精度を高めることができるが、Ｂ／Ｆ分離の確実性を増すために洗浄回数を増加させることは、測定の高速化や高スループット化を妨げる。このため、最短の動作で最大の分離効率を得るための種々の発明がなされてきた。一例としては、Ｂ／Ｆ分離に用いる洗浄液の組成の改良や、洗浄液残りの低減などが挙げられる。特許文献１は、洗浄液残りの低減に関するＢ／Ｆ分離時の吸引装置が記載されている。特開平８−６２２１５号公報 Ｂ／Ｆ分離の洗浄効率を向上させる手段として、上述の手段の他、洗浄液の濃度を上げることも考えられる。しかしこの場合、高濃度の洗浄液がわずかとはいえ反応容器中に残存し、次の抗原抗体反応もしくは基質による発光反応に持ち越されることになる。多くの場合、洗浄液の混入はこれらの反応を阻害するため、感度低下につながり好ましくない。 本発明は、全体としては洗浄液量を減らして効率よく洗浄を行ない、かつ、洗浄液残存の影響を低減するＢ／Ｆ分離の洗浄方法及びＢ／Ｆ分離の洗浄装置を提供することを目的とする。 上記目的を達成するため、本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄方法は、担体表面に固定された分子と試料中の分子を結合させる抗原抗体反応において、容器内に保持された試料に対して洗浄液の吐出と排出の繰返しによって前記試料中から未結合の分子を除去するＢ／Ｆ分離の洗浄方法であって、洗浄液の濃度は、所定の濃度の洗浄液及び希釈水の吐出の割合により調整され、１回目の洗浄は所定の濃度の洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に洗浄液を排出し、２回目以降の洗浄は前の回よりも薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出し、最終回の洗浄は、初回の濃度より薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出するようにしたことを特徴とする。 さらに本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄方法は、前記洗浄液の濃度は、所定の濃度の洗浄液及び希釈水の吐出の割合により調整されることを特徴とする。さらに本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄方法は、２回目以降の吐出は希釈水のみにより行うことを特徴とする。さらに本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄方法は、前記希釈水は、免疫装置内のシステム水を使用することを特徴とする。 また、本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄装置は、制御部と、洗浄液を有する第１のボトルと、希釈水を有する第２のボトルと、反応容器と、制御部からの制御により洗浄液又は希釈水を前記反応容器に吐出可能な第１のノズルと、制御部からの制御により前記反応容器内の液体を排出可能な第２のノズルとを有し、前記反応容器中による、担体表面に固定された分子と試料中の分子を結合させる抗原抗体反応における容器内に保持された試料に対して洗浄液の吐出と排出の繰返しによって前記試料中から未結合の分子を除去するＢ／Ｆ分離の洗浄において、前記第１のノズルからの洗浄液及び希釈水の吐出の割合と、前記第２のノズルからの排出とを制御することにより、１回目の洗浄は所定の濃度の洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に洗浄液を排出し、２回目以降の洗浄は前の回よりも薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出し、最終回の洗浄は、初回の濃度より薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出するようにしたことを特徴とする。 さらに本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄装置は、１回目の排出量は吐出量より少ない量とすることで液を残し、２回目以降も洗浄液を残すように吐出量と排出量を調整し、最終回において残液をすべて排出することを特徴とする。さらに本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄装置は、２回目以降の吐出は希釈水のみにより行うことを特徴とする。さらに本発明のＢ／Ｆ分離の洗浄装置は、前記希釈水は、免疫装置内のシステム水を使用することを特徴とする。 本発明によれば、Ｂ／Ｆ分離の洗浄方法及びＢ／Ｆ分離の洗浄装置において、全体としては洗浄液量を減らして効率よく洗浄を行ない、かつ、洗浄液残存の影響を低減することができる。 本発明を実施するための最良の形態を説明する。 図１は本発明を実施するにあたり用いたＢ／Ｆ分離装置の構成図である。洗浄液ボトル１１には洗浄液が充填されており、この洗浄液はシリンジ１３によりチューブ１０を通って吐出ノズル１５より反応容器１８中に吐出される。洗浄液は遊離状態の抗原（抗体）や反応容器や磁性ビーズ非特異的に吸着した余剰の試薬や検体の包含成分などを洗い流すための溶液であり、界面活性剤やｐＨ調整剤などが含まれる。 純水ボトル２１中の純水は、洗浄液と同じ流路を通って反応容器中に吐出される。２液の切り替えは電磁弁２２によって行われる。 反応液の入った反応容器１８が、反応容器設置台を兼ねる攪拌装置１７に設置されると、磁石１９が反応容器外側側面に接触し、反応液中の磁性粒子を反応容器内壁に捕捉する。この状態で吸引ノズル１６が磁性粒子以外の成分を吸引し、廃液ボトル１２に排出する。この送液操作はシリンジ１４により行われる。 その後、吐出ノズル１５より洗浄液が反応容器中に吐出され、この反応容器を攪拌装置１７にて攪拌した後、磁石１９により磁性粒子を捕捉し、吸引ノズル１６より反応容器中の洗浄液を吸引し、廃液ボトル１２に排出する。攪拌装置は吐出された洗浄液と磁気ビーズは混和され、洗浄効率が向上する。 この、洗浄液の吐出と攪拌、吸引という操作を複数回行うＢ／Ｆ分離において、洗浄液の濃度を変えて行えるよう、洗浄液と水の吐出量を図２のように調整した。 洗浄液吐出１回目においては洗浄液のみ１．０ｍＬ吐出する。２回目では、洗浄液を０．８ｍＬと純水０．２ｍＬを吐出、３回目では洗浄液０．６ｍＬと純水０．４ｍＬを吐出、４回目では洗浄液０．４ｍＬと純水０．６ｍＬを吐出することとした。これにより、反応液に吐出される洗浄液濃度は徐々に小さくなる。なお、吸引量の設定値は、１．５ｍＬとして、洗浄液と純水を十分に吸引できるように、洗浄液と純水の合計の吐出量より多く設定してある。 この方法によれば、除去すべき対象が高濃度に含まれる初期洗浄時に高濃度の洗浄液が確保され、高い洗浄効果が期待できる。また、吐出と吸引を繰り返すことで、徐々に除去対象と共に洗浄液濃度も減少していき、最終的には反応容器内に残存する洗浄液量も小さくなる。このことは、洗浄液が次の反応や測定系に及ぼす悪影響を減少させることからも望ましい洗浄方法といえる。 また、徐々に洗浄液濃度を減少させる方法は確実に上記効果を発揮するが、これ以外にも、初めに高濃度の洗浄液により吐出と吸引をして、２回目以降は前の回よりも濃くない洗浄液の吐出と排出を行い、最終回においては、初回の濃度より薄い洗浄液により吐出と排出を行うことも可能である。つまり、前の回と同じ濃度の洗浄液による吐出と排出がある場合も含むことも可能である。最終的に、洗浄液の濃度を初回よりも薄くすれば、上記効果は期待できる。 また、本実施例では純水用のボトルを用意したが、多くの免疫測定装置においてはシステム水やノズル等の洗浄水として純水が装置内を循環している。洗浄用にこれらの純水を使用することも可能である。なお、洗浄液の濃度を調整する観点から、純水でなくても希釈水で適用可能である（実施例２でも同様）。 これらの洗浄は、例えば、図示しない制御部により、シリンジ１３、１４や、電磁弁２２を制御すれば、ノズル１５からの純水と洗浄液の吐出と、ノズル１６による反応容器１８内の液の排出の制御が可能となる。ことによりＢ／Ｆ分離装置において上記洗浄を自動で行うことが可能となる。 このＢ／Ｆ分離方法を、実際の免疫測定系に適用した。 図３に示す測定プロトコルに従い、ＨＢｓ−Ａｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）を測定した。洗浄液ボトルには、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）を充填した。 検体としてヒト血清を用い、担体にはマウス由来の抗ＨＢｓモノクローナル抗体を結合させた磁気ビーズ（１００ μｇ／ｍＬ）を用いた。反応容器に分注した検体５０μＬに磁気ビーズ２００μＬを加え混合し（Ｓ１０１）、３７℃にて１０分間インキュベーションした（Ｓ１０２）後、第１Ｂ／Ｆ分離（Ｓ１０３）を行った。この時のＢ／Ｆ分離方法については後述する。 反応容器として、ここでは半透明のＰＰ（ポリプロピレン）製の円柱状容器を用いたが、より透明度の高いＰＳ（ポリスチレン）やＴＰＸ（テトラメチルペンテン）、その他の高分子を用いることもできる。また、樹脂表面にシリコンなどの撥水処理が為されていると、非特異的な吸着を抑えることができてより好ましい。また、形状としては円柱の底面が丸くなっているものや尖っているものなどを用いることもできる。この場合は、最終的な洗浄液の残液を減少させることが容易になり、より望ましいものといえる。 上述されたようにＢ／Ｆ分離（Ｓ１０３）を行った後、酵素標識抗体３５０μＬを反応容器に添加する（Ｓ１０４）。この酵素標識抗体にはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）により標識されたマウス由来の抗ＨＢｓモノクローナル抗体０．８μｇ／ｍＬが含まれている。反応容器内で担体とよく混合し、３７℃にて１０分間インキュベーションした（Ｓ１０５）後、第２Ｂ／Ｆ分離（Ｓ１０６）を行った。このＢ／Ｆ分離も第１Ｂ／Ｆ分離と同様の洗浄方法にて行った。 最後に、ＡＭＰＰＤ （３−（２’−ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ／ ３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４− （３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）０．２ｍｇ／ｍＬを含む基質液２００μＬを加え、３７℃にて５分間インキュベーションし、波長４７７ｎｍにて発光量を測定した（Ｓ１０７、Ｓ１０８）。この時の発光量はアルカリホスファターゼにより分解されたＡＭＰＰＤ量に依存するため、発光量を血清中のＨＢｓ−Ａｇ量に換算することが可能である。 比較対照として、洗浄液を０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）として、全てのＢ／Ｆ分離操作中この洗浄液のみを用いた免疫分析も行った。Ｂ／Ｆ分離において洗浄液の初期濃度を高くし徐々に濃度を小さくする方法は、同一濃度の洗浄液のみにてＢ／Ｆ分離を行った場合より、シグナルのバックグラウンドが小さくなり、シグナルとの比（Ｓ／Ｂ比）が大きくなり、結果として感度が向上した。 実施例１と同じ装置を用いて免疫分析測定を行った。この時のＢ／Ｆ分離条件を図４に示すように変更した。 図４では、洗浄液の吸引量を反応容器内に存在する洗浄液量以下とすることで、Ｂ／Ｆ分離実施中は常に反応容器内に洗浄液が残存するようになっている。 洗浄液としてここでは０．１％Ｔｗｅｅｎを含むりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）を洗浄液ボトルに充填した。洗浄液吐出１回目においては洗浄液のみ１．０ｍＬ吐出する。攪拌後、吸引ノズルで洗浄液を吸引するが、この時の液量は０．８ｍＬに設定しておく。これにより、反応容器１８内には０．１％Ｔｗｅｅｎを含むりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）が０．２ｍＬ残存していることになる。ここに、純水を０．８ｍＬを吐出、し、攪拌後０．８ｍＬを吸引する。この操作により、反応容器１８および磁性粒子は５倍に希釈された洗浄液で洗浄されることになる。同様に３回目と４回目の洗浄操作を行うが、４回目の洗浄では残液を減らすために、洗浄液吸引量を１．５ｍＬに設定する。 この方法によって、実施例１と同じく洗浄液の濃度を徐々に小さくしていくことが可能になる上に、液の吐出回数を減少させることができるため、Ｂ／Ｆ分離の時間を短縮することが可能となる。更に、Ｂ／Ｆ分離操作を行う間、洗浄液を吸引した場合でも液体の液量が少し残っていれば残っている液体の表面張力により、反応容器内壁に捕捉された担体が常に洗浄液中に浸漬された状態にあることから、空気への曝露されることなく、除去すべき遊離の抗原や抗体が担体に固着することを防ぐことができる。また、洗浄液との接触時間が相対的に長くなることから、より高い洗浄効果が期待できる。 なお、上記のように１回目に洗浄液のみの吐出で、２回目以降は純水のみの吐出をした方が、より簡単な制御となるが、実施例１で示したように、所定の濃度の洗浄液を得たい場合等には、純水と洗浄液の吐出の割合を調整することも可能である。この場合、液が残存するように、排出量を調整することが上記の効果を得る上で重要である。 以上のように、本発明では、従来のＢ／Ｆ分離装置において、洗浄液の吸引量と吐出量の設定を変更することにより、より高感度でノイズの少ない免疫測定反応が可能になる。そして、初めに高濃度の洗浄液を吐出してその後低濃度の洗浄液または純水を吐出する場合、高濃度の洗浄液によって高い洗浄効果が期待できる他、洗浄液量を減少させることができる。このことは流通や保存のコストを低減させることに繋がる。特に洗浄に純水を用いる場合はその効果が顕著であり、ノズルの外面を洗浄したりシステム水として使用したりする純水と共通化させることができる。本発明のＢ／Ｆ分離装置の一実施形態を示す構成図である。実施例１におけるＢ／Ｆ分離操作における洗浄液の吐出量と吸引量を示した図表である。免疫測定方法のプロトコルの一例を示した説明図である。実施例２におけるＢ／Ｆ分離操作における洗浄液の吐出量と吸引量を示した図表である。符号の説明１１ 洗浄液ボトル１２ 廃液ボトル１３，１４ シリンジ１５、１６ ノズル１７ 攪拌装置１８ 反応容器１９ 磁石２１ 純水ボトルまたはシステム水用純水ボトル２２ 電磁弁 担体表面に固定された分子と試料中の分子を結合させる抗原抗体反応において、容器内に保持された試料に対して洗浄液の吐出と排出の繰返しによって前記試料中から未結合の分子を除去するＢ／Ｆ分離の洗浄方法であって、 洗浄液の濃度は、所定の濃度の洗浄液及び希釈水の吐出の割合により調整され、 １回目の洗浄は所定の濃度の洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に洗浄液を排出し、 ２回目以降の洗浄は前の回よりも薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出し、 最終回の洗浄は、初回の濃度より薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出するようにしたことを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄方法。 請求項１に記載のＢ／Ｆ分離の洗浄方法において、 １回目の排出量は吐出量より少ない量とすることで液を残し、２回目以降も液を残すように吐出量と排出量を調整し、最終回において残液をすべて排出することを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄方法。 請求項２に記載のＢ／Ｆ分離の洗浄方法において、 ２回目以降の吐出は希釈水のみにより行うことを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄方法。 請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のＢ／Ｆ分離の洗浄方法において、 前記希釈水は、免疫装置内のシステム水を使用することを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄方法。 制御部と、洗浄液を有する第１のボトルと、希釈水を有する第２のボトルと、反応容器と、制御部からの制御により洗浄液又は希釈水を前記反応容器に吐出可能な第１のノズルと、制御部からの制御により前記反応容器内の液体を排出可能な第２のノズルとを有し、 前記反応容器中による、担体表面に固定された分子と試料中の分子を結合させる抗原抗体反応における容器内に保持された試料に対して洗浄液の吐出と排出の繰返しによって前記試料中から未結合の分子を除去するＢ／Ｆ分離の洗浄において、 前記第１のノズルからの洗浄液及び希釈水の吐出の割合と、前記第２のノズルからの排出とを制御することにより、 １回目の洗浄は所定の濃度の洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に洗浄液を排出し、 ２回目以降の洗浄は前の回よりも薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出し、 最終回の洗浄は、初回の濃度より薄い濃度となるように前記所定の濃度の洗浄液を希釈した洗浄液を用い、前記容器に吐出した後に当該調整した洗浄液を排出するようにしたことを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄装置。 請求項５に記載のＢ／Ｆ分離の洗浄装置において、 １回目の排出量は吐出量より少ない量とすることで液を残し、２回目以降も洗浄液を残すように吐出量と排出量を調整し、最終回において残液をすべて排出することを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄装置。 請求項６に記載のＢ／Ｆ分離の洗浄装置において、 ２回目以降の吐出は希釈水のみにより行うことを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄装置。 請求項５から請求項７のいずれか一項に記載のＢ／Ｆ分離の洗浄装置において、 前記希釈水は、免疫装置内のシステム水を使用することを特徴とするＢ／Ｆ分離の洗浄装置。

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