生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ステロールエステル合成酵素およびその製造方法 |
| 出願番号： | 2007224936 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C12N 9/18 |
特許情報キャッシュ
杉原耿雄 前田淳史 水野貴之 文谷政憲 仲井誠一 広田益教 JP 2009055819 公開特許公報(A) 20090319 2007224936 20070831 ステロールエステル合成酵素およびその製造方法 杉原 耿雄 592151764 日本パテントエンジェル株式会社 503334644 中野 修身 100112173 杉原耿雄 前田淳史 水野貴之 文谷政憲 仲井誠一 広田益教 C12N 9/18 20060101AFI20090220BHJP JPC12N9/18 3 3 ＯＬ 11 特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集」に発表 4B050 4B050CC01 4B050DD03 4B050FF05E 4B050FF12E 4B050LL02本発明は新規なステロールエステル合成酵素に関するものであり、さらにはトリコデルマ属に属するステロールエステル合成酵素生産菌を培養し、ステロールエステル合成酵素（コレステロールエステラーゼ）を含む培養液をそのまま、あるいはその酵素を精製したものを用いてステロールエステルを製造する方法に関するものである。ステロール（動物ではコレステロール、植物ではスティグマステロール、β―シトステロール、カンペステロールなど）は生体膜の硬さや流動性に関与し、ホルモンの原料となるなど生体には重要な物質である。ステロールと脂肪酸とのエステルはコレステリック液晶や化粧品基材として広く利用されてきた。また、コレステロールを多く含む動物性食品は摂取しすぎると高脂血症、動脈硬化症などを引き起こすが、植物ステロールが共存すると、小腸からの吸収が顕著に抑制されることが明らかにされ、植物ステロールを添加したマーガリンなどが市販されるようになった。しかしながら、ステロールは水には勿論のこと、植物油脂にもせいぜい１％程度しか溶解しないため使用しにくい。そこで、これに脂肪酸を結合させてエステル化すると溶解度が１０％以上あがるため、これが利用されている。 これらのエステルは従来、有機合成法により製造されてきたが、副反応、着色、着臭、煩雑な精製工程、副生物の処理などを必要とする。一方、酵素を用いるエステル化は一般に室温、中性ｐHで進み、副反応が極めて少ない、大掛かりな設備を必要としないなどの特長がある。しかしながら、酵素法によるエステル化反応はエステル加水分解反応の逆反応であるため、エステル化反応過程で生成してくる水分を絶えず除去しながら反応させなければ、ある程度エステルができると逆に分解反応が優勢となり、合成収率が上がらないという欠点があった。 微生物起源のコレステロールエステラーゼは現在までにシュードモナス属、カンディダ属、ストレプトミセス属ほかいくつかの微生物由来のものが開示されている。また、これらの酵素を用いたステロールエステル製造技術も開示されている（特許文献１参照）。また、これらの合成系では各種の有機溶媒の添加が合成速度や収率の向上にしばしば有効であることが示されているが、植物ステロールエステルの合成においては特許で提案されているほとんどの有機溶媒が食品添加物として許可されていないため、実際には利用できない。また、本発明者は既に、糸状菌トリコデルマはその好気的液体培養液の中に脂肪酸特異性を示さない特異なコレステロールエステラーゼを分泌生産することを明らかにしている（特許文献２）。しかし、本発明により、当該糸状菌トリコデルマが、これとはまったく異なるステロールエステラーゼ（ステロールエステル合成酵素）を分泌生産することを明らかにした。特開平０５−３３７１２号公報特開２００４−２３６５８５号公報本発明者は、この新しいステロールエステラーゼ（ステロールエステル合成酵素）について、鋭意研究を続けた結果、広範囲の脂肪酸ステロールエステルに対して高い分解活性を示し、かつ各種ステロールエステルを効率よく合成する能力を有するコレステロールエステラーゼ（ステロールエステル合成酵素）を提供するとともに、その製造方法を提供するものである。すなわち、本発明は以下の理化学的性質を有するコレステロールエステラーゼ（ステロールエステル合成酵素）に関する。（１）作用：補酵素を必要とせず、ステロールと遊離脂肪酸またはその誘導体に直接作用して、ステロールエステル生成反応を触媒する。（２）基質特異性：遊離脂肪酸とステロールまたはその誘導体を基質として作用する。（３）分子量：ゲルろ過法およびSDS-PAGE法による分子量が５３kDa〜５８kDaである。（４）作用ｐHおよび最適ｐH：作用ｐHは２．５〜９．５、最適ｐHは６．０〜７．５に認められる。（５）ｐH安定性：各ｐHの緩衝液中に本酵素を溶解して３０℃で１８時間静置した場合、ｐH３．５〜７．５では約７５％の酵素活性を維持している。（６）作用温度および最適温度：５〜６０oCの範囲で作用するが、最適温度は３５〜４０oCである。（７）熱安定性：燐酸緩衝液（ｐH７．０）中で１８時間熱処理した場合、２０℃以上では部分的な失活が認められ、６０℃以上ではほぼ完全に失活する。（８）阻害剤：PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）により活性が阻害される。また、本発明のコレステロールエステラーゼ（ステロールエステル合成酵素）はトリコデルマ属に属するコレステロールエステラーゼ生産菌を１５℃〜３５℃、ｐＨは４．０−９．５で１〜２０日間、培養した培養液から本酵素を採取することにより製造できる。本発明において、培養は、小麦衾などの培養基を用いる固体培養、望ましくは、振とう、または通気攪拌を伴う液体培養とすることができる。なお、ここでいう液体培養は「炭素源、窒素源および無機塩類などを水に溶解した栄養源をフラスコ、ジャーファーメンターなどの発酵容器にいれ、加熱滅菌したものに微生物を接種して適切な温度に保ちながら、発酵容器を振とうするか、あるいは通気攪拌を行って、好気的に培養する方法」を指す。また、固体培養は「小麦衾などの固体培養基に水、無機塩などを加えた後、加熱殺菌したものに微生物を接種して適当な温度に保ちながら、時折、培養物を切り返して、好気的に培養する方法」を指す。本発明によるステロールエステル合成酵素（コレステロールエステラーゼ）は、室温（２０℃）で１日以内の反応時間で、中鎖および長鎖脂肪酸のコレステロールエステルおよび植物ステロールエステルを大量かつ安価に製造することができる。本酵素を用いたステロールエステル、特にオレイン酸などの不飽和脂肪酸の植物ステロールエステルは結晶化温度が低く、市販食用油脂に添加することによって、食用油脂製品にしばしば見られる白濁、結晶化などの防止に役立つ。また、植物ステロールエステルは植物ステロール自体に比べ、油脂に対する溶解度が１桁高いため、動植物油脂に添加しやすく、これによりコレステロールの小腸からの吸収を抑制し、結果として血中コレステロール値を低下させる効果があり、人類の健康の向上に資するものである。本発明はまた、ビタミンＥ製造時の副産物としてその一部しか利用されておらず、大部分が廃棄処分されているステロールケーキの有効利用への道を拓くものである。なお、本酵素を用いる植物ステロールのエステル化ではコレステロールのエステル化に比べて収率が低いため、ヘキサンの添加を必要とするが、ヘキサンは食品添加物として製造時の使用が認められている有機溶媒であり、製品化までに減圧処理などによって除去すれば問題はない。本発明によるトリコデルマ属に属するステロールエステル合成酵素生産菌を培養するには、通常の栄養培地を使用することができ、炭素源、窒素源、無機塩類などを適当に含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、澱粉、糖蜜、アルコール、オリーブ油、大豆油などの油脂、およびこれらの組み合わせを用いることができる。窒素源としてはコーンスティープリカー、大豆粉、小麦衾、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの有機窒素化合物、硫安、硝安、尿素などの無機窒素化合物を用いることができる。無機塩類としては食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、第一燐酸カリウム、第二燐酸カリウムなどを使用できる。これらの炭素源、窒素源および無機塩類は使用する微生物にあわせて適宜選択することができる。さらに、コレステロールエステラーゼ生産を促す各種コレステロールエステルを培地に添加してもよい。培養は液体培養では、このような成分を含む液体培地をフラスコに入れ、加熱殺菌後、本菌を接種し、振とうする。また、ジャーファーメンターを用いる場合は、菌を接種後、通気しながら攪拌を行って好気的に培養することができる。培養温度は１５−５０℃が好ましく、２０−４０℃がより好ましい。培養のｐＨは４−９．５が好ましく、５−８がより好ましい。培養期間は温度によっても異なるが、１−２０日であり、好ましくは２−６日間、より好ましくは３−５日間がより好ましい。また、固体培養を採用することも可能であり、その場合は小麦衾などの固体栄養基に少量の水を加えたものを加熱殺菌後、本菌を接種し、適切な温度で静置して培養する。培養温度は１５−５０℃が好ましく、２０−４０℃がより好ましい。培養のｐＨは４−９．５が好ましく、５−８がより好ましい。培養期間は温度によっても異なるが、１−２０日であり、好ましくは２−６日間である。液体培養物から本酵素を採取するには、ろ過または遠心分離により菌体を除去し、ろ液または上清液から硫安塩析、限外ろ過による濃縮などの公知の方法で酵素標品を得ることができる。また、固体培養物から本酵素を採取するには、水を加えて、菌体表面に分泌された本酵素を水抽出し、ろ過または遠心分離により菌体および小麦衾などの固体培養基を除去して得られるろ液、または上清液から硫安塩析、限外ろ過による濃縮などの公知の方法で酵素標品を得ることができる。さらに、高度に精製された酵素標品を得るには、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの従来から用いられている精製法を用いればよい。本発明のコレステロールエステラーゼは、以下の性質を有する。（１）加水分解反応における脂肪酸特異性：酢酸コレステロール、プロピオン酸コレステロール、酪酸コレステロール、カプロン酸コレステロール、カプリル酸コレステロール、カプリン酸コレステロール、ラウリン酸コレステロール、ミリスチン酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、オレイン酸コレステロール、リノール酸コレステロールに対して高い加水分解活性を示すが、安息香酸コレステロールにはほとんど加水分解活性を示さない。（２）最適ｐＨおよびｐＨ安定性：リノール酸コレステロールを基質としたときの加水分解の最適ｐＨは６．０〜７．５、ブリットン−ロビンソン広域緩衝液を用いた場合、３０℃、１８時間後の残存活性はｐＨ３．５〜７．５で約７５％。（３）最適温度および温度安定性：リノール酸コレステロールを基質としたときの加水分解の最適温度は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３５〜４０℃、同緩衝液中、２０℃で１８時間後の残存活性は約８５％。（４）等電点：蔗糖密度勾配等電点電気泳動でｐＨ４．３付近。（５）分子量：５３〜５８ｋＤａ。これらの理化学的性質は、たとえば下記の方法により測定することができる。＜コレステロールエステラーゼ活性測定法＞コレステロールエステラーゼ活性の測定は、コレステロールエステルを基質とするコレステロールエステラーゼ反応により遊離させたコレステロールをコレステロールオキシダーゼで酸化したのち、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼにより４−アミノアンチピリンと反応させ、生成したキノン色素を分光光度計により定量する方法を用いた。たとえば、コレステロールエステラーゼ活性はリノール酸コレステロール（シグマーアルドリッチ社製）を基質として用い、０．０３Ｍの同基質溶液（イソプロパノールに溶解したもの）２ｍｌを７２〜７４℃の１％トリトンＸ−１００水溶液１００ｍｌと混和して３０分間この温度に保ったのち、室温まで冷却する。これに０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液１５０ｍｌ、１．７６％の４−アミノアンチピリン水溶液５ｍｌ、６％のフェノール水溶液１０ｍｌ、および西洋わさび由来のペルオキシダーゼ水溶液（１５０プルプロガリン単位を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの）１０ｍｌを混和する。この反応混合液２．７５ｍｌを試験管にとり３７℃で５分間加温し、コレステロールオキシダーゼ水溶液（３００単位／ｍｌ）０．１ｍｌを加えてさらに２分間加温する。ついで、コレステロールエステラーゼを含む試料液０．１ｍｌを加えて混和したのち、水を対照として、３７℃に温度制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を１分間記録し、その初期勾配から１分間あたりの吸光度変化（ΔＡｔ）を求める。盲検値として試料液の代わりに５分間煮沸して完全失活させた酵素を０．１ｍｌ加え、前記と同様の操作を行ない１分間あたりの吸光度変化（ΔＡｂ）を求める。両吸光度の差を（ΔＡｔ−ΔＡｂ）とすると、試料液のコレステロールエステラーゼ活性は次式で求められる。ただし、コレステロールエステラーゼ活性は前記条件で、１分間に１μモルのコレステロールを生成する酵素量を１単位と定義する。活性（単位／ｍｌ）＝（ΔＡｔ−ΔＡｂ）×４．２８１＜最適ｐＨ測定法＞本酵素の各ｐＨにおける活性を、基質としてリノール酸コレステロールを用いて測定する。０．２Ｍブリットン−ロビンソンの広域緩衝液を用いて、０．２ｍＭの基質溶液を調製する。各ｐＨの基質溶液（コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを含まない）２．７５ｍｌに、本発明により採取精製したコレステロールエステラーゼ溶液（以下、精製酵素液と称する）５０μｌを加え、３０℃で１０分間保温したのち、０．２Ｍフェニルメタンスルフォニルフルオライド水溶液を５０μｌ加えて、酵素を失活させる。これに、コレステロールオキシダーゼ（３００単位／ｍｌ）、ペルオキシダーゼ（１５０単位／ｍｌ）、および０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１：１．２：８．２５の割合で混合したものを１．０４５ｍｌ加えて、５００ｎｍの吸光度を測定し、生成コレステロールを定量する。盲検値として、精製コレステロールエステラーゼの代わりに、水を用いて同様の操作を行なって求める。＜最適温度測定法＞０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いる以外は前記最適ｐＨ測定法と同様の操作を１０〜６０℃で行ない、最適温度を求める。＜安定ｐＨ域測定法＞ブリットン−ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ２．０〜１０．０）５０μｌと精製酵素液５０μｌを混和し、３０℃で１８時間保温した。その後、その溶液のｐＨを測定するとともに、前記コレステロールエステラーゼ活性測定法と同様にして残存活性を測定する。残存活性７５％以上を安定とし、安定ｐＨ域を求める。＜安定温度測定法＞０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０μｌと精製酵素液５０μｌを混和し、１０〜６０℃で１８時間保温する。ついで、その混和液を氷冷し、前記コレステロールエステラーゼ活性測定法と同様にして残存活性を測定する。＜等電点測定法＞蔗糖密度勾配等電点電気泳動装置（日本泳動（株）製）と両性電解質としてファルマライト（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）を用いて、４００Ｖで２日間泳動した後、１．２ｍｌずつ分画し、ｐＨと活性を測定する。＜脂肪酸特異性測定法＞表１の各種酸のコレステロールエステル（リノール酸コレステロールのみシグマーアルドリッチ社製で、その他は東京化成（株）製）に対する加水分解活性を前記コレステロールエステラーゼ活性測定法と同様にして測定し、脂肪酸特異性を決定する。＜ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動＞９％の分離用アクリルアミドゲルの上に３％の濃縮用アクリルアミドゲルを乗せ、ｐＨ８．３の泳動用緩衝液を用いて１００Ｖの電圧で泳動させる。泳動後、和光純薬工業株式会社製のクイックＣＢＢ液で染色する。分子量マーカーとして、バイオラド社の標準たんぱく質混合キットを用いる。＜ゲルろ過法＞ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製のスーパデックス２００のカラム（１ｘ３０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行った。すなわち、０．１５Ｍ食塩水で平衡化した本カラムに本発明の精製酵素標品を０．１ｍｌ加え、０．４ｍｌ/分の流速で溶出した。本酵素の溶出位置は酵素活性で検出した。まったく同じ方法で、バイオラド社の販売する分子量既知のたんぱく質混合物のゲルろ過を行い、その結果をもとに検量線を作成して本発明酵素の分子量を測定した。つぎに、実施例により本発明によるコレステロールエステル合成酵素を採取する方法をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。（実施例１）＜コレステロールエステル合成酵素の採取法＞ペプトン２％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）、食塩０．１％（Ｗ／Ｖ）、第一リン酸カリウム０．１％（Ｗ／Ｖ）および水道水からなる培地（ｐＨ５．０）１５０ｍｌを５００ｍｌ用の振とうフラスコに入れて、１２０℃で１５分間殺菌した。この培地にトリコデルマ属スギハラ菌株（Trichodermasugihara；受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８２７３）を接種し、これを２６℃で約３日間振とう培養した。培養終了後、培養液をろ過して菌体を除去し、ろ液に粉末硫安を終濃度７０％飽和になるまで加え、１５℃で１日放置した。これを遠心分離して生じた沈殿を集め、１５ｍｌの水に溶解し、２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下緩衝液Ａという）に対して透析した。つぎに、硫安を終濃度２０％飽和になるように加え、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製のスーパーデックス２００（２．６ｘ６０ｃｍ）カラムを用いてゲルろ過を行った。溶出液は試験管１本あたり３ｍｌずつ分画し、酵素活性を測定した。活性画分を集め、最終濃度２０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加えた。これを２０％飽和の硫酸アンモニウムで平衡化したバイオーラド社製のマクロープレップ メチル充填カラムに添加した後、硫酸アンモニウム濃度を徐々に０％まで下げ、吸着蛋白を溶出した。活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて濃縮した後、この濃縮酵素を蔗糖密度勾配等電点電気泳動装置（日本泳動（株）製）にファルマライト（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）と共に入れ、４００Ｖの電圧を４０時間かけて電気泳動を行った。電気泳動終了後、試験管１本当たり１ｍｌずつ分画し、酵素活性とｐＨを測定した。活性のある画分はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを与えたので精製酵素標品と判定した。＜加水分解反応における脂肪酸特異性＞前記加水分解反応における脂肪酸特異性測定法と同様の方法で、下記の表１記載の酸のうち、酢酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸および安息香酸のコレステロールエステルについて相対加水分解活性を測定した。得られた結果を下記の表２に示す。表２において、基質であるコレステロールエステルは、該エステルを構成する酸で示し、該酸が脂肪酸である場合は、炭素数および不飽和度で示す。本酵素は脂肪酸の結合したすべてのコレステロールエステルに対して加水分解活性を示したが、芳香族の酸である安息香酸のコレステロールエステルにはほとんど加水分解活性を示さなかった。＜最適ｐＨ＞前記最適測定法と同様にして測定を行なった結果を図１に示す。最適ｐＨは６．０〜７．５であった。＜ｐＨ安定性＞前記安定ｐＨ域測定法と同様にして測定を行なった結果を図１に示す。本酵素はｐＨ３．５〜７．５の間では１８時間後も約７５％の活性を維持していた。＜最適温度＞前記最適温度測定法と同様にして測定を行なった結果を図２に示す。本酵素の最適温度は３５℃〜４０℃であった。＜温度安定性＞前記温度安定性測定法と同様にして測定を行なった結果を図２に示す。本酵素はｐＨ７．０、２０℃では１８時間後も約８５％の活性を維持していたが、６０℃では活性が消失した。＜等電点＞前記等電点測定法と同様にして測定を行なった結果、等電点は４．３であった。＜分子量＞前記ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と同様にして測定を行なった結果を図３（Ａ）に示す。これより本酵素のサブユニットは約５４、０００の分子量を有することが判明した。また、ゲルろ過法の結果を図３（Ｂ）に示す。これより、本酵素の分子量は約５０，０００である。これら２つの結果より、本酵素は単量体酵素であることが判明した。これら本酵素の理化学的性質を従来知られているコレステロールエステラーゼの理化学的性質と比較したものを表１に示す。本酵素は既知のコレステロールエステラーゼと異なるものであることが明らかである。＜実施例１で得られたコレステロールエステル合成酵素（精製酵素標品）を用いるステロールエステル製造＞ (オレイン酸コレステロールエステルの製造)コレステロール２０mg（５２μｌ）、オレイン酸３０〜１２０mg、脱イオン水２０μｌ、実施例１で得られた酵素２０μｌ（コレステロールリノレート加水分解活性１１Ｕ）を入れ、手でかき混ぜたものとそこにヘキサンを２５０μｌ加えたものを作り、それぞれ２０℃で1日反応させた。その結果を表２に示す。 （オレイン酸スティグマステロールエステルの製造）スティグマステロール２０mg(４８μmol)、各種脂肪酸３０mg、実施例１で得られた（精製酵素標品）酵素２０μｌ（リノレート加水分解活性１１Ｕ）を入れてよく混合したもの、ならびにそれらの混合物にヘキサン２５０μｌを加えたものを作り、それぞれ２０℃で1日静置して反応させた。その結果を表３に示す。本願発明のステロールエステル合成酵素（コレステロールエステラーゼ）を用いるオレイン酸スティグマステロールエステル合成において、ヘキサン添加が有効であることがわかる。本発明によるステロールエステル合成酵素（コレステロールエステラーゼ）を用いると、中鎖および長鎖脂肪酸のコレステロールエステルおよび植物ステロールエステルを大量かつ安価に製造することができる。特に、植物ステロールのオレイン酸エステルは結晶化温度が低く、市販食用油に添加すると白濁、結晶化を抑制する。さらに、このエステルは油脂に対する溶解度が植物ステロール自体よりも桁違いに高いため動物油脂に添加しやすく、これによりコレステロールの小腸からの吸収を抑制し、結果として血中コレステロール値を低下させる効果があり、食品添加剤として有望で、産業上の利用価値が高いものである。本発明によるコレステロールエステラーゼのｐＨ−加水分解活性曲線(●)、およびｐＨ−安定性曲線（○）を示すグラフである。本発明によるコレステロールエステラーゼの温度−加水分解活性曲線（●）、および温度−安定性曲線（○）を示すグラフである。本発明によるコレステロールエステラーゼのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果（Ａ）およびゲルろ過の結果（Ｂ）である。Ａ図において、レーン１は分子量既知の標準蛋白質を、レーン２は本発明によるコレステロールエステラーゼを示す。Ｂ図において、○は分子量既知の標準蛋白質を、●は本特許記載のコレステロールエステル合成酵素を示す。次の性質を有するステロールエステル合成酵素（コレステロールエステラーゼ）（１）作用補酵素を必要とせず、ステロールと遊離脂肪酸またはその誘導体に直接作用して、ステロールエステル生成反応を触媒する。（２）基質特異性遊離脂肪酸とステロールまたはその誘導体を基質として作用する。（３）分子量ゲルろ過法およびSDS-PAGE法による分子量が５３kDa〜５８kDaである。（４）作用ｐHおよび最適ｐH作用ｐHは２．５〜９．５、最適ｐHは６．０〜７．５に認められる。（５）ｐH安定性各ｐHの緩衝液中に本酵素を溶解して３０℃で１８時間静置した場合、ｐH３．５〜７．５では７５％以上の酵素活性を維持している。（６）作用温度および最適温度５〜６０℃の範囲で作用するが、最適温度は３５〜４０℃である。（７）熱安定性燐酸緩衝液（ｐH７．０）中で１8時間熱処理した場合、２０℃以上では部分的な失活が認められ、６０℃以上ではほぼ完全に失活する。（８）阻害剤PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）により活性が阻害される。糸状菌トリコデルマ属スギハラ菌株（Trichoderma sugihara; 受託番号FERM BP-8273）を１０℃〜５０℃、ｐＨは４．０−９．５で１〜２０日間、培養により得られる培養液からステロールエステル合成酵素を採取することを特徴とするステロールエステル合成酵素の製造方法。培養が、固体培養、望ましくは振とう、または通気攪拌を伴う液体培養である請求項２に記載したステロールエステル合成酵素の製造方法。 【課題】広範囲の脂肪酸ステロールエステルに対して高い分解活性を示し、かつ各種ステロールエステルを効率よく合成する能力を有するコレステロールエステラーゼ、及びその製造方法の提供。【解決手段】次の性質を有するステロールエステル合成酵素（コレステロールエステラーゼ）。（１）作用：補酵素を必要とせず、ステロールと遊離脂肪酸またはその誘導体に直接作用して、ステロールエステル生成反応を触媒する。（２）基質特異性：遊離脂肪酸とステロールまたはその誘導体を基質として作用する。（３）分子量：ゲルろ過法およびSDS-PAGE法による分子量が５３kDa〜５８kDaである。（４）作用ｐHおよび最適ｐH：作用ｐHは２．５〜９．５、最適ｐHは６〜７．５に認められる。（５）ｐH安定性：各ｐHの緩衝液中に本酵素を溶解して３０℃で１８時間静置した場合、ｐH３．５〜７．５では７５％以上の酵素活性を維持している。【選択図】図３