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| タイトル： | 公開特許公報(A)_殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）タンパク質産物を含む、改良された治療用組成物 |
| 出願番号： | 2006222809 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | A61K 38/00,A61K 47/34,A61P 31/04,A61P 31/10,C07K 14/47 |
特許情報キャッシュ
ルイス エイチ． ランバート ジュニア JP 2006321816 公開特許公報(A) 20061130 2006222809 20060817 殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）タンパク質産物を含む、改良された治療用組成物 ゾーマ・コーポレイション 594075802 ＸＯＭＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ 山本 秀策 100078282 ルイス エイチ． ランバート ジュニア US 08/372,104 19950113 US 08/530,599 19950919 A61K 38/00 20060101AFI20061102BHJP A61K 47/34 20060101ALI20061102BHJP A61P 31/04 20060101ALI20061102BHJP A61P 31/10 20060101ALI20061102BHJP C07K 14/47 20060101ALN20061102BHJP JPA61K37/02A61K47/34A61P31/04A61P31/10C07K14/47 1 1996521883 19960116 ＯＬ 60 4C076 4C084 4H045 4C076AA12 4C076BB11 4C076BB13 4C076CC31 4C076DD23D 4C076DD43Z 4C076DD51 4C076EE23 4C076EE23F 4C076FF11 4C076FF14 4C076FF16 4C076FF70 4C076GG41 4C076GG46 4C084AA01 4C084AA02 4C084BA01 4C084BA08 4C084BA22 4C084BA23 4C084CA18 4C084CA26 4C084CA36 4C084DC50 4C084MA01 4C084MA05 4C084MA17 4C084MA66 4C084NA05 4C084NA14 4C084ZB35 4H045AA30 4H045BA09 4H045CA40 4H045EA29 4H045FA74 殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）タンパク質産物を含む、改良された治療用組成物 本出願は、１９９５年１月１３日に出願せる米国出願第０８／３７２，１０４号の一部継続出願である、１９９５年９月１９日に出願せる米国出願第０８／５３０，５９９号の一部継続出願であり、双方とも引用することによりその内容を本明細書に組み入れる。 発明の背景 本発明は、概して、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）タンパク質産物の活性を増強するためのポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体）界面活性剤を利用した、改良された治療用組成物及び処置方法に関する。 ＢＰＩは、侵入してくる微生物に対する防御において必須の血液細胞である、哺乳動物の多形核白血球（ＰＭＮまたは好中球）の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトＢＰＩタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［Ｅｌｓｂａｃｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４巻、１１０００頁（１９７９）］または大腸菌アフィニティークロマトグラフィー［Ｗｅｉｓｓら、Ｂｌｏｏｄ、６９巻、６５２頁（１９８７）］のいずれかと、酸抽出とを併用して、ＰＭＮから単離されている。このようにして得られたＢＰＩは、本明細書中で天然ＢＰＩとして言及され、広範囲にわたるグラム陰性細菌に対して強力な殺菌活性を有することが示されている。ヒトＢＰＩの分子量はおよそ５５，０００ダルトン（５５ｋＤ）である。ヒトＢＰＩタンパク質全体のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列は、Ｇｌａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻、９５０５頁（１９８９）の図１に報告されており、かかる文献を引用することにより、本明細書に組み入れることとする。Ｇｒａｙらのアミノ酸配列は、本明細書中、配列番号：１で示される。米国特許第５，１９８，５４１号には、ＢＰＩホロタンパク質及びＢＰＩの断片を包含するＢＰＩタンパク質をコードする組換え遺伝子及びそれらの発現のための方法を開示している。 ＢＰＩは、強い陽イオン性を有するタンパク質である。ＢＰＩのＮ末端半分は、高い実効電荷の原因となり、一方、分子のＣ末端半分は、−３の実効電荷を有する。［Ｅｌｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓ（１９８１）、前出］。約２５ ｋＤの分子量を有する、ＢＰＩのタンパク質分解によるＮ末端断片は、疎水性領域と親水性領域とを交互に含み、両親媒性の特徴を有する。ヒトＢＰＩのこのＮ末端断片は、天然に由来する５５ ｋＤのヒトＢＰＩホロタンパク質の抗細菌的効力を保有している。［Ｏｏｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻、１４８９１〜１４８９４頁（１９８７）］。Ｎ末端部分とは対照的に、単離されたヒトＢＰＩタンパク質のＣ末端領域は、グラム陰性生物に対してほんのわずかに検出可能な抗細菌活性を呈するに過ぎない。［Ｏｏｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４巻、６４９頁（１９９１）］。「ｒＢＰＩ２３」と称される、およそ２３ ｋＤのＮ末端ＢＰＩ断片が、組換え法によって製造されており、これもまたグラム陰性生物に対して抗細菌活性を保持するものである。Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．ＩｍＥｕｎ．、６０巻、４７５４〜４７６１頁（１９９２）。 ＢＰＩの殺菌効果は、例えばＥｌｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓ、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ、Ｇａｌｌｉｎら編、３０章、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．（１９９２）におけるごとく、グラム陰性の種に特異性が高いとの報告がなされている。ＢＰＩは、酵母を包含する他の微生物や、さらに高等な真核細胞に対して、通常非毒性であると考えられている。Ｅｌｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓ、（１９９２）、前出は、１０−８から１０−９Ｍ程度の低濃度で、ＢＰＩが広範囲のグラム陰性細菌に対して抗細菌活性を呈するものの、それより１００から１，０００倍高い濃度のＢＰＩが、同時に調べたグラム陽性細菌種、酵母、及びさらに高等な真核細胞のすべてに対して、非毒性であったことを報告している。グラム陽性生物である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、４つの株）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ミクロコッカス・リソデイクチカス（Ｍｊｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、及びリステリア・モノサイトゲンス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対して、ｐＨ７．０または５．５のいずれかで調べた場合、１０−６Ｍまたは１６０μｇ／ｍｌの濃度で、ＢＰＩは毒性効果を有しないことが報告された。報告によれば、ｐＨ７．０または５．５において、ＢＰＩは１０−６Ｍにて真菌であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）及びカンジダ・パラシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｓｉｌｏｓｉｓ）に対する毒性効果を有さず、ヒト、ウサギ及びヒツジ赤血球細胞ならびに種々のヒト腫瘍細胞系に対して非毒性であった。やはりＥｌｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓの、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｇ．Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ編、２巻、９５〜１１３頁、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８１）を参照されたい。このように報告された標的細胞の特異性は、リポ多糖（ＬＰＳ）に対するＢＰＩの強い誘引力の結果であると考えられていた。ＬＰＳは、グラム陰性生物の外膜（あるいはエンベロープ）に独特のものである。 ＢＰＩのグラム陰性細菌殺傷における正確な機構はいまだ完全には解明されていないが、まず、陽イオン性ＢＰＩタンパク質とＬＰＳ上の陰性に荷電した部位との間の静電気的相互作用及び疎水性相互作用を通して、細菌の表面にＢＰＩが結合しなければならないと考えられている。ＬＰＳは、それが刺激する強い炎症応答（すなわち、回復不能の内毒性ショックを最終的には惹起こしうる宿主炎症細胞によるメディエータの放出）のゆえに、「内毒素」と称されている。ＢＰＩはリピドＡに結合するのであるが、これはＬＰＳの最も毒性が強く、且つ最も生物学的活性を有する成分であると報告されている。 感受性のグラム陰性細菌において、ＢＰＩの結合はＬＰＳ構造を崩壊させ、リン脂質及びペプチドグリカンを分解する細菌酵素の活性化を惹起こし、細胞外膜の透過性を変化せしめ、最終的には細胞死へと導く事象を開始させると考えられる。［Ｅｌｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓ（１９９２）、前出］。ＢＰＩは２段階にて作用すると考えられる。第一は、即時的生育停止、外膜の透過性亢進（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）ならびにリン脂質及びペプチドグリカンを加水分解する細菌酵素の選択的な活性化によって特徴付けられる亜致死的段階である。この段階での細菌は、血清アルブミンを追加した培地中で生育させることにより救助できる［Ｍａｎｎｉｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８５巻、８５３〜８６０頁（１９９０）］。第二段階は、血清アルブミンで回復しえない生長阻害により規定されるものであるが、細菌をさらに長い間ＢＰＩに曝した後に起こるものであり、細胞質内膜への明白な損傷を含む、広範囲の生理学的及び構造的変化により特徴付けられる。 ＢＰＩがＬＰＳにまず結合して、正常時においてＭｇ＋＋及びＣａ＋＋の結合を通して外膜を安定化させる、ＬＰＳのＫＤＯ領域中の陰イオン性基への結合におそらくは起因した、組織的な変化が惹起こされる。グラム陰性細菌の外膜へのＢＰＩの付着により、アクチノマシンＤなどの疎水性剤への外膜の迅速な透過性亢進がなされる。ＢＰＩの結合及びそれに続くグラム陰性細菌殺傷は、少なくとも部分的にＬＰＳ多糖の鎖長に依存するものであり、長いＯ−鎖を持っている「スムーズ」生物は、短いＯ−鎖を持っている「ラフ」生物よりもＢＰＩの殺菌効果に対して耐性である［Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、６５巻、６１９〜６２８頁（１９８０）］。このＢＰＩの作用の第一段階であるグラム陰性外側エンベロープの透過性亢進は、ＢＰＩの解離に際しては可逆性であり、これは、二価陽イオンの存在及び新規ＬＰＳの合成を必要とするプロセスである［Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３２巻、３１０９〜３１１５頁（１９８４）］。しかしながら、グラム陰性細菌の生育力喪失は、エンベロープの完全性を修復するプロセスによっては回復せず、従って殺菌作用は標的生物に誘導される付加的な障害により媒介されるのであり、それは細胞質膜に位置するかもしれないことが示唆される（Ｍａｎｎｉｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８６巻、６３１〜６４１貞（１９９０））。この可能性を特に精査して、モルベースで、ＢＰＩは少なくともポリミキシンＢと同等に細胞質膜小胞機能を阻害することが示されている（Ｉｎ’ｔＶｅｌｄら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５６巻、１２０３〜１２０８貞（１９８８））ものの、正確な機構ならびに、このような小胞と無傷の生物の研究との関連は、いまだ解明されていない。 ＢＰＩは、その結合対象であるＬＰＳの内毒素特性を中和することもできる。グラム陰性生物に対する殺菌特性及びＬＰＳを中和する能力のゆえに、ＢＰＩは、菌血症または敗血症などの、グラム陰性細菌によって惹き起こされる疾患に罹患した哺乳類の処置のために利用することができる。 ポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体）界面活性剤は、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の単一ブロックに隣接する親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の２つのブロックまたは鎖で構成される構造を有している、非イオン性のブロック共重合体である。 本発明にとって興味深いのは、ＢＰＩタンパク質産物と、ポロキサマー界面活性剤単独、またはポリソルベート界面活性剤と組み合わせたいずれかとを含有する医薬組成物の、可溶化または安定性の改良を記載した、共有で係属中の、許可された米国特許出願第０８／１９０，８６９号（ＰＣＴ 出願公開 Ｎｏ．ＷＯ ９４／１７８１９）であり、これは参照することによって本明細書に組み入れることとする。 また、さらに本発明にとって興味深いのは、ウイルス、マイコバクテリウム及びコクシジオイデス感染症の処置において、「旧来の」抗生物質と共に、及び抗生物質なしでポロキサマー界面活性剤を使用することを記している、ＰＣＴ 出願公開 Ｎｏ．ＷＯ８８／０６０３８ 及び米国特許第５，１８３，６８７号である。 当該技術分野において、ＢＰＩタンパク質産物などの殺菌剤の治療上の有効性を改良することができる方法及び組成物への要望がある。かかる方法及び組成物は、所望の治療効果を成し遂げるために必要とされる薬剤の投与量を理想的に低減することができよう。 本発明によって以下が提供される：（１）ＢＰＩタンパク質産物及び安定化ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤を含む治療用組成物において、殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含む、改良された治療用組成物。（２）さらにＥＤＴＡを含む項目１に記載の治療用組成物。（３）前記殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤が、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、及びポロキサマー４０３よりなる群から選択される、項目１に記載の改良された組成物。（４）ＥＤＴＡをさらに含む請求項３記載の治療用組成物。（５）ＢＰＩタンパク質産物及び安定化ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤の組成物を投与することを含む細菌感染を処置するための方法において、ＢＰＩタンパク質産物及び殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含有する治療用組成物を投与することを含む改良された方法。（６）前記治療用組成物がさらにＥＤＴＡを含む項目５に記載の改良された方法。（７）殺菌活性を増強するポロキサマー界面活性剤が、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、及びポロキサマー４０３よりなる群から選択される、項目５に記載の改良された方法。（８）抗生物質を投与することをさらに含む項目５に記載の改良された方法。（９）ＢＰＩタンパク質産物ならびに細菌及び真菌の生育阻害増強ポロキサマー界面活性剤を含む、細菌及び真菌の生育を阻害するための組成物。（１０）さらにＥＤＴＡを含む項目９に記載の組成物。（１１）前記細菌及び真菌の生育阻害増強ポロキサマー界面活性剤が、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、及びポロキサマー４０３よりなる群から選択される、項目９に記載の組成物。（１２）ＢＰＩタンパク質産物ならびに細菌及び真菌を含有する生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤の組成物を用いて、細菌または真菌を処置することを含む、細菌及び真菌の生育を阻害するための方法。（１３）前記組成物がさらにＥＤＴＡを含む項目１２に記載の方法。（１４）前記細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤が、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、及びポロキサマー４０３よりなる群から選択される、項目１２に記載の方法。 発明の要約 本発明は、改良された抗微生物性組成物及び処置方法を提供する。本発明の一つの特徴によれば、ＢＰＩタンパク質産物と、ＢＰＩタンパク質産物の抗細菌活性を増強するポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤を含む、改良された治療用組成物が提供される。現在のところ好ましい殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤には、ポロキサマー３３３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ １０３、ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニュージャージー州）、ポロキサマー３３４（ＰＬＵＲＯＮＩＣ １０４、ＢＡＳＦ）、ポロキサマー３３５（ＰＬＵＲＯＮＩＣ １０５、ＢＡＳＦ）、またはポロキサマー４０３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３、ＢＡＳＦ）が包含される。本発明で使用されるポロキサマーは、組成物に配合する前に随意に熱処理してもよい。特に好ましいのは、ポロキサマー３３３またはポロキサマー４０３を含む組成物である。本発明のこの特徴は、ＢＰＩタンパク質産物と前掲のポロキサマー界面活性剤の一つとの組合せによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 及び ｉｎ ｖｉｖｏの双方で、ＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性が予測できないほど増強されることを知見したことに基づいている。本発明の改良された治療用組成物は、さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含んでもよい。本発明のこの特徴は、ＢＰＩタンパク質産物と殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３など）とを含有する治療用組成物にＥＤＴＡを添加すると、ＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性のさらなる増強が導かれるという発見に基づいている。 細菌感染を処置するための、前記に対応する改良された方法も提供され、その改良された方法には、感染が疑われるかまたは確認された患者に対して、ＢＰＩタンパク質産物及び殺菌活性増強ポロキサマー、そして随意にＥＤＴＡを含む治療用組成物を投与することが含まれている。本発明はさらに、細菌感染の処置のための医薬製造のために、ＢＰＩタンパク質産物と、随意にＥＤＴＡと共に、殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３など）を使用することも企図するものである。 本発明は、ＢＰＩタンパク質産物ならびに細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤、そして随意にＥＤＴＡを含む、細菌及び真菌の生育を阻害するための改良された組成物を、さらに提供するものである。本発明のこの特徴は、ＢＰＩタンパク質産物と細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤との組合せで、予測できないほどにＢＰＩタンパク質産物の生育阻害活性が増強されるという発見に基づいている。細菌または真菌を殺傷またはそれらの生育を阻害する、前記に対応する方法が提供される。その方法には、ＢＰＩタンパク質産物と、細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤、そして随意にＥＤＴＡを含む組成物を、生物に接触させることが含まれている。現在のところ好ましい細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤には、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、及びポロキサマー４０３が包含される。 前記の細菌感染を処置するための改良された方法に関しては、細菌感染を処置するために抗生物質の治療的有効性を改良する方法も提供される。この方法によれば、ＢＰＩ活性増強ポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３など）及び随意に用いられるＥＤＴＡで製剤化されたＢＰＩタンパク質産物を含む組成物と、抗生物質が同時に投与される。本発明のこの特徴は、ＢＰＩタンパク質産物を添加した場合に認められる、抗生物質の治療的有効性の改良が、様々なポロキサマー製剤によってさらに増強できるという発見、ならびに、ＢＰＩタンパク質産物／ポロキサマー製剤にＥＤＴＡを追加するとより一層抗生物質の治療的有効性が増強されるという発見に基づいている。本発明のこの特徴は、抗生物質を用いた細菌感染の共同処置用の、ＢＰＩタンパク質産物を含有する医薬の製造のための、随意にＥＤＴＡを併用するポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３など）の使用をも提供する。 以下の知見は、本発明のこの特徴を例証するものである。シュードモナス種については、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、セフチゾキシムの改良された治療的有効性が増強され；ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、セフトリアキソンに対する増強がなされ；そして、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、クロラムフェニコールに対する増強がなされた。アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種については、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、セフタチジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）に対する増強がなされ；ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、セフトリアキソンに対する増強がなされ；そしてポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、クロラムフェニコールに対する増強がなされた。 ストレプトコッカス種については、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、オキサシリンに対する増強がなされた。エンテロコッカス種については、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、リファンピシンに対する増強がなされ；そしてポロキサマー３３３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）に対する増強がなされた。 シュードモナス種については、ポロキサマー４０３を含有するＢＰＩタンパク質産物製剤によって、様々な抗生物質の治療的有効性の増強がなされ、そしてＢＰＩ／ポロキサマー４０３製剤に増加濃度のＥＤＴＡを添加することによって、より一層の増強がなされた。 本発明の現在のところ好ましい実施態様を記載した、以下の発明の詳細な説明をもとに考慮すれば、当業者には、本発明の多くの付加的な特徴及び利点が明らかになるであろう。 詳細な説明 本発明は、改良された抗微生物性組成物及び処置方法を提供する。改良された方法及び組成物は、細菌感染及びそれに関連するかそれに起因する感染症及び状態（敗血症及び菌血症など）を処置するために有用であるのみならず、例えば、腹部もしくは尿生殖器手術を行う予定の患者、または外傷の罹患者などの、細菌感染の危険性が高い状態にある患者の予防のためにも有用である。 特に、本発明は、ＢＰＩタンパク質産物及び安定化ポロキサマー界面活性剤を含む治療用組成物の改良において、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３などの殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含むという点が改良されている。本発明は、ＢＰＩタンパク質産物と、前掲のポロキサマー界面活性剤の一つとの組合せによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 及び ｉｎ ｖｉｖｏの双方において予測できないほどにＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性が増強されるという知見に基づいている。本発明の改良された治療用組成物は、さらにＥＤＴＡを含んでもよい。本発明のこの特徴は、ＢＰＩタンパク質産物及び、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３などの殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含有する、ある治療用組成物にＥＤＴＡを添加すると、ＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性のさらなる増強がなされるという発見に基づくものである。かかる組成物は、医薬的に容認しうる希釈剤、佐剤または担体を随意に含んでもよい。本発明には、天然ＢＰＩタンパク質、組換えＢＰＩタンパク質、ＢＰＩ断片、ＢＰＩ類似体、ＢＰＩ変異体、及びＢＰＩペプチドを包含する、当該技術分野において既知の、多岐にわたるＢＰＩタンパク質産物のいかようなものであっても利用される。 細菌感染を処置するための、対応する改良された方法も提供され、その改良された方法には、感染が疑われるかまたは確認された患者に対して、ＢＰＩタンパク質産物及び殺菌活性増強ポロキサマー、そして随意にＥＤＴＡを含む治療用組成物を投与することが含まれている。本発明はさらに、細菌感染の処置用の医薬の製造のために、ＢＰＩタンパク質産物と、随意にＥＤＴＡと共に、殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３など）を使用することも企図するものである。ＥＤＴＡを含むかまたは含まない、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー界面活性剤の治療用組成物は、細菌感染の疑いがあるか、または感染が確認された披験者に対して、全身または局所投与することができる。 ポロキサマー３３３は、ＢＡＳＦ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）により、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３の商品名で販売されており、４９５０の分子量、そして７〜１２の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）価を有している。ポロキサマー３３４は、ＢＡＳＦにより、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４の商品名で販売されており、５９００の分子量、そして１２〜１８のＨＬＢ価を有している。ポロキサマー３３５は、ＢＡＳＦにより、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０５の商品名で販売されており、６５００の分子量、そして１２〜１８のＨＬＢ価を有している。ポロキサマー４０３は、ＢＡＳＦにより、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３の商品名で販売されており、５７５０の分子量、そして７〜１２のＨＬＢ価を有している。現在のところ好ましい殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤には、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５またはポロキサマー４０３が包含される。特に好ましいのは、ポロキサマー３３３またはポロキサマー４０３を包含する組成物である。 本発明において使用されるポロキサマーは、組成物に配合するに先駆けて、随意に熱処理を行ってもよい。好ましい熱処理の方法は以下の通りである：（１）脱イオン水にてポロキサマーの溶液をつくり、（２）沸騰するまでその溶液を加熱し、（３）熱源から溶液を離し、（４）室温にまで冷却させ、（５）ポロキサマーが完全に可溶化するまで攪拌する。あるいは、加熱工程（２）において、溶液を３０分以上まで煮沸してもよい。 本発明は、ＢＰＩタンパク質産物ならびに細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤、そして随意にＥＤＴＡを含む、細菌及び真菌の生育を阻害するための改良された組成物を、さらに提供するものである。本発明のこの特徴は、細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤が、予測できないほどにＢＰＩタンパク質産物の生育阻害活性を増強するという発見、そして、かかるポロキサマー界面活性剤及びＢＰＩタンパク質産物を含む改良された組成物が、優れた生育阻害、保存効果を呈するという発見に基づいている。細菌または真菌を殺傷またはそれらの生育を阻害する、前記組成物に対応する方法が提供される。その方法には、ＢＰＩタンパク質産物と、細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤、そして随意にＥＤＴＡを含む組成物を、生物に接触させることが含まれている。現在のところ好ましい細菌及び真菌の生育阻害を増強するポロキサマー界面活性剤には、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、及びポロキサマー４０３が包含される。 これらの方法は、保存薬としての使用、流体及び表面の汚染除去のための使用、または手術用及び他の医療機器ならびに人工関節を包含する移植可能な器具等を滅菌するための使用など、ｉｎ ｖｉｖｏまたは様々なｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用において実施することができる。これらの方法は、しばしば感染の病巣である、静脈内ライン及びカテーテルなどの内在させる侵入器具のｉｎ ｓｉｔｕ滅菌のため、ならびに細胞用生育培地の調製においても用いることができる。細菌及び真菌の生育を阻害するための改良された組成物の有効性は、後記の実施例８におけるアッセイ、または共有で係属中の特許出願（Ｃｏｈｅｎら）である、１９９３年９月２２日に出願された米国特許出願第０８／１２５，６５１号、そしてその一部継続出願である、１９９４年７月１１日に出願された米国特許出願第０８／２７３，４０１号、そしてその一部継続出願である、１９９４年９月２２日に出願された来国特許出願第０８／３１１，６１１号、そして対応のＰＣＴ 出願 第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１２２５、そして共有で係属中の特許出願（Ｌｉｔｔｌｅら）である、１９９４年１月１４日に出願された米国特許出願第０８／１８３，２２２号、そしてその一部継続出願である、１９９４年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／２０９，７６２号、そしてその一部継続出願である（Ｈｏｒｗｉｔｚら）１９９４年７月１１日に出願された米国特許出願第０８／２７４，２９９号、そしてその一部継続出願である、１９９５年１月１３日に出願された米国特許出願第０８／３７２，７８３号、そして対応の ＰＣＴ 出願 第ＰＣＴ／ＵＳ９５／００６５６、そして共有で係属中の特許出願（Ｌｉｔｔｌｅら）である、１９９４年１月１４日に出願された米国特許出願第０８／１８３，２２２号、そしてその一部継続出願である、１９９４年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／２０９，７６２号、そしてその一部継続出願である、１９９４年７月１１日に出願された米国特許出願第０８／２７３，５４０号、そしてその一部継続出願である、１９９５年１月１３日に出願された米国特許出願第０８／３７２，１０５号、そして対応の ＰＣＴ 出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／００４９８（これらはすべて、引用することによりその内容を本明細書の一部とする）に記載される種々のアッセイによっても評価することができる。 ＢＰＩタンパク質産物は、補体、ｐ１５及びＬＢＰ、ならびに他の細胞及び免疫系の成分を包含する、全血または血清中に存在する様々な宿主防御要素と相互作用すると考えられる。かかる相互作用に起因して、ＢＰＩタンパク質産物の活性が強化されるのかもしれない。これらの相互作用のゆえに、ＢＰＩタンパク質産物はｉｎ ｖｉｔｒｏよりもｉｎ ｖｉｖｏで一層強い活性を発揮することが予測できる。しかして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ の試験はｉｎ ｖｉｖｏでの有用性を予見させるものであるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性がないことが必ずしもｉｎ ｖｉｖｏで活性がないことを示唆するとは限らない。例えば、ＢＰＩは、旧来の培地を用いたアッセイにおけるよりも、全血または血漿アッセイで、グラム陰性細菌に対してより大きな殺菌効果を呈することが観察されている。［Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０巻、１１２２〜１１３０頁（１９９２）］。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏでの動物実験にも示される（例えば、共有で係属中の、１９９４年９月２２日に出願された米国出願（Ｃｏｈｅｎら）である、米国特許出願第０８／３１１，６１１号、そして対応の ＰＣＴ 出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１２２５（これらはすべて、引用することにより本明細書の一部とする）を参照されたい）。これは、旧来のｉｎ ｖｉｔｒｏ系が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢＰＩの機能を助長するかもしくは強化する血液成分を欠くためか、または、旧来の培地がＢＰＩタンパク質産物の抗細菌活性の典型的に阻害剤たるマグネシウム及びカルシウムを生理学的濃度よりも多量に含有しているからかもしれない。さらに、宿主において、ＢＰＩタンパク質産物は、ストレスで誘導されるグラム陰性細菌の転位から、あるいはグラム陰性細菌の抗生物質を用いた処置から、等を包含する宿主感染の際に放出される内毒素を中和するために使用可能であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において認められない、またはこれによって予測されない、さらなる臨床上の利益を提供する。 ＢＰＩタンパク質産物が、ＢＰＩタンパク質産物の活性を強化する他の産物と共に投与されることも企図される。例えば、血清補体は、ＢＰＩタンパク質産物の殺グラム陰性細菌活性を強化し、ＢＰＩタンパク質産物と血清補体との組合せによって、相乗的な殺細菌／生育阻害効果が提供される。例えば、ＢＰＩ抗細菌活性を強化する、天然に存在する１５ ｋＤタンパク質について述べられている、Ｏｏｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻、１５９５６頁（１９９０）、及びＬｅｖｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、６０３８〜６０８３頁（１９９３）を参照されたい。また、１９９３年７月１４日に出願された米国特許出願第０８／０９３，２０１号の一部継続出願として１９９４年７月１１日に出願された米国特許出願第０８／２７４，３０３号に対応する、共有で係属中である、１９９４年７月１３日に出願されたＰＣＴ出願Ｎｏ．ＵＳ９４／０７８３４も参照されたい。これらの出願は、参照することによって本明細書に含まれるものとするが、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）及びＬＢＰタンパク質産物を投与することによって、ＢＰＩタンパク質産物の殺グラム陰性細菌活性を強化するための方法が記載されている。ＣＤ−１４免疫刺激特性を欠くＬＢＰタンパク質誘導体及び誘導体ハイブリッドが、１９９３年６月１７日に出願された米国特許出願第０８／０７９，５１０号の一部継続出願として１９９４年６月１７日に出願された、共有で係属中である米国特許出願第０８／２６１，６６０号に対応する、１９９４年６月１７日に出願されたＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＵＳ９４／０６９３１に記載されており、これらの出願は、すべて引用することによってその開示が本明細書に含まれるものである。 本発明によって提供される利点は、ＢＰＩタンパク質産物の、より有効な細菌及び真菌の殺傷または生育阻害、ならびに増強された抗細菌または抗真菌活性を提供できることにある。 ＢＰＩタンパク質産物及びＢＰＩの抗微生物活性を増強するポロキサマー界面活性剤を含み、そして随意にＥＤＴＡを含有する治療用組成物は、全身に、あるいは局所に投与することができる。全身投与の経路には、経口、静脈内、筋肉もしくは皮下注射（長時間放出用のデポ剤に含有せしめられる）、眼内または眼球後部、鞘内、腹膜組織内（例えば腹腔組織内灌流による）、エアロゾル化もしくは霧状にした薬物を用いた経肺、または経皮経路が包含される。例えば、非経口的に与えられる場合、ＢＰＩタンパク質産物組成物は、通例、１日当たり１μｇ／ｋｇから１００ ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で、そして好ましくは、１日当たり０．１ ｍｇ／ｋｇから２０ ｍｇ／ｋｇの投与量で注射される。処置する医師の裁量によって、例えば１日から３日間、またはさらに長期間、１日当たりの投与量を同じか、または増減して、処置を継続してもよい。局所経路には、軟膏、眼用滴剤、耳用滴剤、潅注液（例えば傷の潅注用）または薬用シャンプーの剤形での投与が包含される。例えば、滴剤の剤形で局所投与するためには、約１０から２００ μＬのＢＰＩタンパク質産物組成物が処置に当たる医師の裁量に基づき、１日当たり１回以上適用すればよい。当業者であれば、良好な医薬実務及び個々の患者の臨床状態によって決定される通り、ＢＰＩタンパク質産物及びＢＰＩの殺菌活性を増強するポロキサマー界面活性剤を含み、そして適宜にＥＤＴＡを含有する治療用組成物のための、有効投与量及び投与に際した規制をたやすく至適化することができる。 前記の細菌感染を処置するための改良された方法に関して、細菌感染の処置用の抗生物質の治療的有効性を改良する方法もまた提供される。この方法によれば、ＢＰＩ活性増強ポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３など）を用いて、そして随意にＥＤＴＡを配合した、製剤化されたＢＰＩタンパク質産物を含む組成物と共に、抗生物質が同時に投与される。本発明のこの特徴により、ＢＰＩタンパク質産物の添加に伴って認められる抗生物質の治療的有効性の改良を、様々なポロキサマー製剤によって増強することができるという発見、そしてＢＰＩタンパク質産物／ポロキサマー製剤にＥＤＴＡを添加すると、抗生物質の治療的有効性がさらに一層増強されるという発見に基づいている。本発明のこの特徴は、抗生物質を用いた細菌感染の共同処置用の、ＢＰＩタンパク質産物を含有する医薬の製造のための、ポロキサマー界面活性剤（ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、またはポロキサマー４０３など）と随意にＥＤＴＡとの使用も提供されるものである。 本発明のこの特徴のために、ＢＰＩタンパク質産物との同時投与に際して認められる抗生物質の改良された治療的有効性を、数多くの方法で観察することができる。例えば、ＢＰＩタンパク質産物は、臨床上抗生物質に対して耐性を有する生物を臨床上抗生物質に対して感受性の生物に変換するか、あるいは場合によっては、かかる生物の抗生物質への感受性を改良するかもしれない。ＢＰＩタンパク質産物及び抗生物質は、単一の治療的有効性のために充分な量を下回る投与量で双方を与えた場合に、治療的効果を有するかもしれない。ＢＰＩタンパク質産物製剤に、ＢＰＩ活性増強ポロキサマー界面活性剤を配合すると、これらの活性がさらに増強される。１９９３年９月２２日に出願された、共有で係属中の特許出願（Ｃｏｈｅｎら）である米国特許出願第０８／１２５，６５１号、そしてその一部継続出願である、１９９４年７月１１日に出願された米国特許出願第０８／２７３，４０１号、そしてその一部継続出願である、１９９４年９月２２日に出願された米国特許出願第０８／３１１，６１１号、そして対応の ＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１２２５、そして共有で係属中の特許出願（Ｌｉｔｔｌｅら）である、１９９４年１月１４日に出願された米国特許出願第０８／１８３，２２２号、そしてその一部継続出願である、１９９４年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／２０９，７６２号、そしてその一部継続出願（Ｈｏｒｗｉｔｚら）である、１９９４年７月１１日に出願された米国特許出願第０８／２７４，２９９号、そしてその一部継続出願である、１９９５年１月１３日に出願された米国特許出願第０８／３７２，７８３号、そして対応のＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／００６５６（これらはすべて、引用することにより本明細書に含まれるものとする）は、抗微生物剤としてのＢＰＩの使用を評価するための方法、及び抗生物質の有効性を増強するための方法を開示している。 抗生物質の改良された治療的有効性は、ｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルで実証してもよいし、あるいは、以下の試験を包含する様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を基礎として予測してもよい。かかる試験は、（１）２４時間でグラム陰性生物の成育を阻害するのに必要な抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）の測定、（２）グラム陰性生物の動的生育曲線に対する抗生物質の効果の測定、（３）抗生物質の連続希釈液単独で、またはＢＰＩタンパク質産物の連続希釈液と組み合わせての、ＭＩＣのチェッカー板アッセイを包含するものである。上記の改良された有効性は、（ａ）生物の数の減少、（ｂ）ＭＩＣの低減、及び／または（ｃ）抗生物質に対する生物の耐性の逆転によって実証されるかもしれない。例示的なモデルまたは試験は、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３版（Ｌｏｒｉａｎ，Ｖ．編）、４３２〜４９２頁、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ（１９９１）の「Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ」に記載されている。 本明細書中で使用される「同時投与」あるいは「共同処置」には、薬剤を併用すなわち組み合わせて、一緒にまたは相前後して投与することが包含される。ＢＰＩタンパク質産物（活性増強ポロキサマーを用いて製剤化されたもの）及び抗生物質は、異なる経路によって投与されてもよい。例えば、製剤化したＢＰＩタンパク質産物を静脈内投与し、一方抗生物質を筋肉、静脈内、皮下、経口または腹膜組織内に投与してもよい。あるいは、製剤化したＢＰＩタンパク質産物を腹腔組織内に投与し、一方抗生物質を腹腔組織内もしくは静脈内に投与したり、または製剤化したＢＰＩタンパク質産物をエアロゾルもしくは霧状の剤形にて投与し、一方抗生物質を例えば静脈内投与してもよい。製剤化したＢＰＩタンパク質産物及び抗生物質は、好ましくは双方とも静脈内投与される。製剤化したＢＰＩタンパク質産物及び抗生物質は、同じ静脈内ラインを介して（間に水洗をした後）引き続き与えるか、または異なる静脈内ラインを介して与えてもよい。製剤化したＢＰＩタンパク質産物及び抗生物質は、双方の薬剤とも感染の部位において有効濃度に達することを許容するに充分なように与えられる限りにおいて、同時にまたは引き続き投与することができる。 製剤化したＢＰＩタンパク質産物及び抗生物質の同時投与によって、細菌感染のさらに効果的な処置が提供されると予測される。２つの薬剤の同時投与で、どちらかの薬剤を単独で投与した場合よりも、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて一層大きな治療効果が提供されるかもしれない。それによって、同等の治療効果を達成しつつ、一方または双方の薬剤の投与量を低減させることが可能となるかもしれない。あるいは、同時投与によって、いずれかの薬剤を単独で用いた場合に達成可能な効果よりもさらに迅速または完全な殺菌／静菌効果が生み出されるかもしれない。 治療的有効性は、首尾良い臨床上の成果に相関するものであり、感染に関わる生物の１００％が抗微生物剤または複数の薬剤により死滅せしめられることが必要なわけではない。成功は、宿主にとって利となるようにバランスを傾けるよう、細菌を阻害するに充分な、感染部位における抗細菌活性のレベルを達成することに依存している。宿主の防御が最高度に有効である場合には、必要な抗細菌効果は、低くてもよい。１の対数（底（ｆａｃｔｏｒ）１０）にまで生物への負荷量を減じてでさえも、感染を制御するための宿主自身の防御が許容されるかもしれない。加えて、初期の殺菌／静菌効果を増大させることが、長期間の殺菌／静菌効果よりも重要でありうる。これらの初期の成果によって、宿主の防御機構を活性化する時間が与えられるので、このような初期成果は重要であり、治療の成功に決定的な部分である。殺菌の速度を増大させることは、髄膜炎、骨または関節の感染などの感染症に［Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３版（Ｌｏｒｉａｎ，Ｖ．編）、８４９〜８７９頁、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＭＤ（１９９１）］、あるいは、抗生物質に対する感受性が低下しているのかもしれない、生育の遅い生物に関わる感染症にも特に重要であるかもしれない。 本明細書において用いられる「ＢＰＩタンパク質産物」には、天然にて及び組換えにより製造されるＢＰＩタンパク質；天然、合成、及び組換えの、ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド断片；ハイブリッド融合タンパク質及びダイマーを含む、ＢＰＩタンパク質またはその断片の生物学的に活性を有するポリペプチド変異体；システインで置換された類似体を含む、ＢＰＩタンパク質またはその断片または変異体の、生物学的に活性を有するポリペプチド類似体；ならびにＢＰＩ由来ペプチドが包含される。本発明に従って投与されるＢＰＩタンパク質産物は、当該技術分野において知られているいかなる手段によって生産及び／または単離してもよい。引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである、米国特許第５，１９８，５４１号にｒＢＰＩ５０と称される組換えＢＰＩホロタンパク質及びＢＰＩの組換え断片を包含するＢＰＩタンパク質をコードする組換え遺伝子、及びその発現のための方法が開示されている。共有であり係属中の米国特許出願第０７／８８５，５０１号及びその一部継続出願である１９９３年５月１９日に出願された米国特許出願第０８／０７２，０６３号そして１９９３年５月１９日に出願された、対応のＰＣＴ 出願 Ｎｏ．９３／０４７５２は、すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものであるが、遺伝的に形質転換した培養中の哺乳動物宿主細胞において発現し、且つその細胞から分泌される組換えＢＰＩタンパク質産物の精製のための新規な方法を開示しており、また、安定で均質な医薬調剤に配合するのに好適な、大量の組換えＢＰＩ産物をどのように製造するかを開示している。 ＢＰＩの生物学的に活性を有する断片（ＢＰＩ断片）には、その断片分子が、ホロタンパク質のアミノ末端アミノ酸、内部アミノ酸、及び／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠くことを除いては、天然のヒトＢＰＩホロタンパク質と同じかまたは類似のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性を有する分子が包含される。このような断片の例に、Ｏｏｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４巻、６４９頁（１９９１）に記載されるおよそ２５ ｋＤの天然ヒトＢＰＩのＮ−末端断片、及び Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０巻、４７５４〜４７６１頁（１９９２）に記載され、ｒＢＰＩ２３と称されている天然ヒトＢＰＩの第１位よりおよそ第１９３または１９９位までのＮ−末端アミノ酸をコードするＤＮＡの組換え発現産物が包含されるが、これらに限定されるものではない。かかる出版物において、Ｇｒａｙら、前出の図１に示されるごとき、３１残基のシグナル配列及び成熟ヒトＢＰＩのＮ−末端の最初の１９９アミノ酸を有する組換え発現産物（ｒＢＰＩ２３）をコードするＤＮＡ（第１５１位のバリンがＧＴＣでなくＧＴＧで特定され、第１８５位の残基がリジン（ＡＡＧで特定される）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで特定される）であるという例外を含む）の供給源として、発現ベクターが用いられた。Ｇｒａｙら、前出の図１に示される配列（配列番号：１及び２、ｒＢＰＩ２３について注解した例外及び第４１７位の残基がバリン（ＧＴＴで特定される）でなくアラニン（ＧＣＴで特定される）であるという点は異なる）を有する組換えホロタンパク質（ｒＢＰＩ）も製造されている。他の例には、共有であり係属中の、１９９４年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／２１２，１３２号及び対応するＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５号（引用することによりそれらの開示が本明細書に含まれるものである）に記載されるごとき、ＢＰＩ断片のダイマー型が包含される。好ましいダイマー産物には、モノマーが、ＢＰＩホロタンパク質のおよそ第１〜１７５から、およそ第１〜１９９までのＮ−末端残基を有するアミノ末端ＢＰＩ断片である、ダイマーＢＰＩタンパク質産物が包含される。特に好ましいダイマー産物は、ｒＢＰＩ４２ダイマーと名付けられた、Ｎ−末端残基第１から１９３までを有するＢＰＩ断片のダイマー型である。 ＢＰＩの生物学的に活性を有する変異体（ＢＰＩ変異体）には、ＢＰＩホロタンパク質またはその生物学的に活性を有する断片及び少なくとも一つの他のポリペプチドの少なくとも一部を含む組換えハイブリッド融合タンパク質、ならびにＢＰＩ変異体のダイマー型が包含されるが、これらに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質及びダイマー型の例は、共有であり係属中の米国特許出願第０７／８８５，９１１号（Ｔｈｅｏｆａｎらによる）及びその一部継続出願である１９９３年５月１９日に出願された米国特許出願第０８／０６４，６９３号及び対応する１９９３年５月１９日に出願されたＰＣＴ出願第 Ｎｏ．ＵＳ９３／０４７５４号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されておりアミノ末端端部でＢＰＩタンパク質またはその生物学的活性を有する断片、及びカルボキシ末端端部で少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖の定常ドメインまたはその対立変異体を含む、ハイブリッド融合タンパク質を包含する。同様に形成した、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）の一部またはすべてを包含するハイブリッド融合タンパク質もまた、本発明における使用に企図されている。 ＢＰＩの生物学的に活性を有する類似体（ＢＰＩ類似体）には、１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸に置換されているＢＰＩタンパク質産物が包含されるが、これらに限定されない。例えば、共有であり係属中の１９９３年２月２日に出願された米国特許出願第０８／０１３，８０１号及び対応する１９９４年２月２日に出願されたＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＵＳ９４／０１２３５号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に、システイン残基が異なるアミノ酸で置換されたＢＰＩ及びＢＰＩ断片のポリペプチド類似体が開示されている。この出願に記載された好ましいＢＰＩタンパク質産物は、ＢＰＩホロタンパク質のＮ−末端アミノ酸の第１アミノ酸からおよそ第１９３または１９９までのアミノ酸をコードするＤＮＡの発現産物（但し、第１３２番目の残基のシステインがアラニンで置換されており、ｒＢＰＩ２１ΔｃｙｓまたはｒＢＰＩ２１と名付けられている）である。他の例としては、ＢＰＩ類似体のダイマー型が包含される。例えば、共有であり係属中の１９９４年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／２１２，１３２号及び対応するＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５（引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）。 本発明の方法に有用な他のＢＰＩタンパク質産物は、共有で係属中の、１９９５年７月２０日に出願された米国特許出願第０８／５０４，８４１号、及び１９９４年９月１５日に出願された米国特許出願第０８／３０６，４７３号に対応する、共有であり係属中の１９９４年９月１５日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ９４／０１０４２７号、及び、１９９３年３月１２日に出願された米国特許出願第０８／０３０，６４４号の一部継続出願である、１９９３年７月１５日に出願された米国特許出願第０８／０９３，２０２号（これに対応する国際出願は、１９９４年３月１１日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ９４／０２４０１号である）の一部継続出願である、１９９４年１月１４日に出願された米国特許出願第０８／１８３，２２２号の一部継続出願である、１９９４年３月１１日に出願された米国特許出願第０８／２０９，７６２号に対応する、１９９４年３月１１日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ９４／０２４６５号（これらはすべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されるものなどの、組換えまたは合成手段により生産されるＢＰＩ由来のまたはそれらＢＰＩに基づくペプチド（ＢＰＩ由来ペプチド）である。 現在のところ好ましいＢＰＩタンパク質産物には、組換えによって生産されたＢＰＩのＮ−末端断片、特にｒＢＰＩ２３またはｒＢＰＩ２１などの、およそ２１から２５ ｋＤのあいだの分子量を有するもの、もしくは、これらＮ−末端断片のダイマー型（例えばｒＢＰＩ４２ダイマー）が包含される。加うるに、好ましいＢＰＩタンパク質産物には、ｒＢＰＩ５０及びＢＰＩ由来ペプチドが包含される。 ＢＰＩタンパク質産物の投与は、好ましくはＢＰＩタンパク質産物及び医薬的に容認されうる希釈剤、佐剤または担体を含む、医薬組成物を用いて成し遂げられる。ＢＰＩタンパク質産物は、既知の界面活性剤、他の化学療法剤または付加的な既知の抗微生物剤と併用してまたは併用せずに投与することができる。ＢＰＩタンパク質産物（例えば、ｒＢＰＩ５０、ｒＢＰＩ２３）を含有する医薬組成物の一つは、０．１重量％のポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニュージャージー州）及び０．００２重量％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）を含むクエン酸緩衝性生理食塩水（５または２０ ｍＭクエン酸塩、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ５．０）中に、１ ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＰＩタンパク質産物を含むものである。ＢＰＩタンパク質産物（例えばｒＢＰＩ２１）を含有する他の医薬組成物は、５ ｍＭクエン酸塩、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８及び０．００２％ポリソルベート８０中に２ ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＰＩタンパク質産物を含むものである。このような組合せが、１９９４年２月２日に出願された米国特許出願第０８／１９０，８９６号及び１９９３年２月２日に出願された米国特許出願第０８／０１２，３６０号に対応する、共有で係属中の、１９９４年２月２日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ９４／０１２３９号に記載されており、これらはすべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである。 本発明の他の特徴及び利点は、以下の例示的な実施例を考慮すれば明らかになるであろう。実施例１には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカス・アウレウス）またはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター・バウマニー、旧称はＡ．ａｎｉｔｒａｔｕｓ（エー・アニトラタス））に対する、水中でのＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性へのポロキサマー４０３またはポロキサマー３３４の効果を述べる。実施例２には、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ（ナイセリア・メニンギディティス）または Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・アエルギノーサ）に対する、血清、ブロスまたは水中での非製剤化または製剤化ＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性へのポロキサマー３３３またはポロキサマー４０３の効果を表す。実施例３は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ストレプトコッカス・ニューモニエ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（イー・ファエシウム）またはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する水中でのＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性へのポロキサマー３３３またはポロキサマー４０３の効果を表す。実施例４は、他のポロキサマーの使用に関する。実施例５には、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、またはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対する、血清、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス、トリプシン・ダイズ・ブロス、または水の中におけるＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性へのポロキサマー１８８、３３３、３３４、３３５、または４０３（ＥＤＴＡを添加または添加せず）の効果を表す。実施例６には、抗生物質に対する様々な生物の感受性への、ＥＤＴＡの存在下または非存在下におけるＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー１８８、３３３、３３４、３３５、または４０３を含有する組成物の効果を表す。実施例７には、ＢＰＩタンパク質産物及び抗細菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含有する組成物の、角膜損傷及び潰瘍形成のウサギモデルにおける効果を表す。実施例８には、ＥＤＴＡの存在下または非存在下での、様々な細菌及び真菌の生育に対する、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー１８８または４０３を含有する組成物の効果を表す。 実施例１ Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する、水中でのＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー４０３またはポロキサマー３３４を含有する組成物の殺菌活性 ＢＰＩタンパク質産物と、ポロキサマー４０３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニュージャージー州）、熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ １２３、または熱処理したポロキサマー３３４（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．）のうちのいずれかとを含む治療用組成物の殺菌活性を、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ライブラリー（Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）からの細菌の臨床分離株に対して評価した。１ ｍｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１及び０．１％（重量／容量）のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３を含む治療用組成物を、「非製剤化」ｒＢＰＩ２１の２ ｍｇ／ｍＬ溶液（５ ｍＭクエン酸ナトリウム及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含み、全く界面活性剤を含まないの緩衝液中）を、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３の０．２％溶液と１：２の割合で希釈することにより製剤化した。２ ｍｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１及び０．１％（重量／容量）の熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４を含む治療用組成物を調製した。０．１％のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３または０．１％の熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３のみを含有し、ｒＢＰＩ２１を含まないポロキサマー対照溶液も調製した。 １．０％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３の滅菌保存溶液は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３を脱イオン水中で溶解するまで攪拌し、その溶液を０．２２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｃｏ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク州）を通して濾過することにより調製した。熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３の滅菌保存溶液は、以下の方法を使用して調製した。すなわち、（１）脱イオン水で、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３の１．０％（重量／容量）溶液をつくり、（２）沸騰するまでその溶液を加熱し、（３）溶液を熱源から離し、（４）室温にまで冷却させ、（５）ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３が完全に可溶化するまで攪拌し、そして（６）滅菌のために、溶液を０．２２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅフィルターユニットに通して濾過した。あるいは、保存溶液を滅菌するためにオートクレーブにかけてもよい。熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４は、同様に調製した。 アッセイにおいて使用されるべき細菌、すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）、ＩＤ番号０５２−１０６）及びＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）、ＩＤ番号１２２９１）は、トリプシン・ダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０１−９２０、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）で２４時間生育した。約４から７ ｘ １０４細胞／ｍＬの細菌保存懸濁液は、注射用滅菌水（Ｋｅｎｄａｌｌ ＭｃＧａｗＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｒｖｉｎｅ、カリフォルニア州）中の細菌コロニーを、０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ 標準液に懸濁して、さらに水で１：１０に希釈することにより調製した。アッセイは、９４４μＬの注射用滅菌水を４．５ ｍＬのポリプロピレンチューブ（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｃｒｙｏｖｉａｌ、Ｎａｌｇｅ Ｃｏ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク州）に添加し、次いで ４０μＬの細菌懸濁液、続いて１６μＬの１ ｍｇ／ｍＬ ｒＢＰＩ２１／０．１％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３治療用組成物またはポロキサマー対照溶液（または８μＬの２ ｍｇ／ｍＬ ｒＢＰＩ２１／０．１％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４治療用組成物）を添加することによって行った。チューブを反転させて混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、各々のチューブからの１０μＬをＴＳＡプレートに播種して１０−２の希釈率にて、及び各々のチューブからの１０μＬをＴＳＡプレートに１：１００の希釈率で播種することにより１０−４の希釈率にて残存するコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。ＴＳＡプレートは、３７℃にて１８時間インキュベートし、細菌コロニーの数を目視下に計数した。結果を以下の表１及び２に示す。 実施例２ Ｓ．ＡＵＲＥＵＳ 及び Ａ．ＢＡＵＭＡＮＮＩＩに対する血清、ブロス及び水中における、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー３３３を含有する組成物の殺菌活性 ＢＰＩタンパク質産物と、ポロキサマー３３３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．）または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３のいずれかとを含む治療用組成物の殺菌活性を、実施例１の臨床分離株に対して評価した。１６０μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１と、様々な濃度のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３のいずれかを含む治療用組成物は、「非製剤化」ｒＢＰＩ２１の２ ｍｇ／ｍＬ溶液（５ ｍＭ クエン酸ナトリウム及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含み、界面活性剤を全く含まない緩衝液中）を、適量のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３溶液で共に希釈することによって製剤化した。２ ｍｇ／ｍＬの ｒＢＰＩ２１、０．２％ポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．）、０．００２％ ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート ８０、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）、５ ｍＭ クエン酸ナトリウム及び １５０ ｍＭ ＮａＣｌを含有する「製剤化した」ｒＢＰＩ２１溶液も、比較用に試験した。０．１％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または０．１％の熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３を含有し、ｒＢＰＩ２１を含まないポロキサマー対照溶液も調製した。 ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３の０．１％（重量／容量）溶液は、脱イオン水中でＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３が溶解するまで攪拌し、そして、その溶液を０．２２μｍ セルロースアセテートポリスチレンフィルターユニット（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）を通して濾過することにより調製した。熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３の滅菌保存溶液は、以下の方法を使用して調製した。すなわち、（１）脱イオン水で、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３の０．１％（重量／容量）溶液をつくり、（２）その溶液を３０分間沸騰させ、（３）室温にまで冷却させ、（４）ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３が完全に可溶化するまで攪拌し、そして（５）滅菌のために溶液を０．２２μｍ Ａｃｒｏｄｉｓｃフィルターユニット（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）に通して濾過した。 アッセイにおいて使用されるべき細菌は、トリプシン・ダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０１−９２０、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）で２４時間生育した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｆｉｌｄｅｓ富化培地中でさらに２時間生育した。細菌の保存懸濁液は、滅菌脱イオン水中に、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｍｅｔｅｒ（Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）によって測定して、およそ２．２から３．８ ｘ １０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬになるように懸濁させ、さらに水で１：１０に希釈することにより調製した。アッセイは、９６ウエル平底ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃ ２５８６０−９６）にて、各ウエルに１７０μＬの血清（Ｓｉｇｍａ ＃Ｓ１７６４、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、トリプシン・ダイズ・ブロス（ＴＳＢ、 Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０８−９４２、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）または注射用滅菌水（Ｋｅｎｄａｌｌ ＭｃＧａｗ）；１０μＬの細菌懸濁液（または対照として水）；２０μＬの示された通りの１６０μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１／ポロキサマー治療用組成物（または対照としてポロキサマー対照溶液または水単独）を添加することによって行った。各ウエル中の細菌の最終濃度は、約４から７ ｘ １０５ ＣＦＵ／ｍＬであった。ウェルの中身を混合し、プレートを３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、各ウェルに残存するコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、各々のウェルからの１０μＬをＴＳＡプレートに播種して１０−２の希釈率にて計数した。ＴＳＡプレートは、３７℃にて２４時間インキュベートし、細菌コロニーの数を目視下に計数した。結果を以下の表３に示す。対照ウェルについてのコロニー計数は、以下の表４及び５に示す。 追加の実験を行って、熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４溶液を用いた様々な製剤化されたＢＰＩタンパク質産物を希釈することにより調製し、そして血清で連続的に２倍に希釈したＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する試験をした治療用組成物を調べた。これらの実験において、低血清濃度にてある程度の殺菌活性が観察されることが認められた（血清濃度を連続的に２倍に低減することに呼応した、ＣＦＵの連続的な５０％の減少で実証される）。ｒＢＰＩ２３については、血清濃度１２．５％以下で殺菌活性が観察された。ｒＢＰＩ２１については、血清濃度６．２５％以下で殺菌活性が観察された。ｒＢＰＩ４２ダイマー及びｒＢＰＩ５０については、１．６％以下の希釈率にて殺菌活性が観察された。 Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｗａｔｅｒ（Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）を用いて同様に行った別の実験では、この産物は殺菌活性を増強する効果を呈した。ポロキサマー３３５（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０５、ＢＡＳＦ Ｗｙｅｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．）を用いて同様に実施した予備実験において、このポロキサマーもまた、ある程度の殺菌活性増強効果を有することが観察された。 さらなる実験で、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー界面活性剤を含む治療用組成物の殺菌活性を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ（Ｃ型）（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ＩＤ番号４１０−００１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（１２．４．４株、Ｓ．Ｍ．Ｏｐａｌ、 Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄより提供；Ａｍｍｏｎｓ ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１７０：１４７３〜８２頁（１９９４）に参照されている）、及び Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ＩＤ番号１２３００）の臨床分離株に対して評価した。以下の治療用組成物を調製した。すなわち、２ ｍｇ／ｍＬ ｒＢＰＩ２１；（ａ）ポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８）、（ｂ）ポロキサマー３３３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３）、（ｃ）ポロキサマー３３４（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４）、（ｄ）ポロキサマー３３５（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０５）または（ｅ）ポロキサマー４０３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３）のいずれか ０．２％；０．００２％ ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ ８０）；５ｍＭ クエン酸ナトリウム；及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む治療用組成物を調製した。０．２％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３、Ｐ１０３またはＦ６８のみを含有し、ｒＢＰＩ２１を含まないポロキサマーの対照溶液も調製した。 これらのさらなるアッセイにおいて使用すべき細菌は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ または Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉについてはトリプシン・ダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０１−９２０、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）そして、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓついてはチョコレート寒天プレート（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０１−３０１、Ｌｅｎｅｘａ、 ＫＮ）でおよそ２４時間生育した。細菌保存懸濁液は、滅菌生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム潅注水、Ｋｅｎｄａｌｌ ＭｃＧａｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｒｖｉｎｅ、カリフォルニア州）中に、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｍｅｔｅｒ（Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）によって測定して、０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ 標準液と同等にまで細菌コロニーを懸濁させ、さらに生理食塩水で１：１０に希釈することによって調製した。アッセイは、４．５ ｍＬのポリプロピレンチューブ（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｃｒｙｏｖｉａｌ、 Ｎａｌｇｅ Ｃｏ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク）に、最終容量１ ｍＬにて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓについては２％ Ｆｉｌｄｅｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０６−１４９６、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）を含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ、または、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについてはＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ プラス Ｃａｔｉｏｎｓ（ＣＳＭＨＢ、Ｒｅｍｅｌ）の９８２μＬまたは９７４μＬ、次いで、１０μＬの細菌懸濁液（または対照としてブロス培地）；そして８または１６μＬの、２ ｍｇ／ｍＬ ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー治療用組成物を添加して行った。チューブを渦流形成（ボルテックス）によって混合し、３７℃にて８時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、残存するコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、適切な希釈液の１０μＬまたは１００μＬをチョコレート寒天またはＴＳＡプレートに播種して、様々な希釈率（１０−２から１０−７）にて計数した。チョコレート寒天またはＴＳＡプレートは、３７℃にておよそ２４時間インキュベート（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのプレートについては、５％ＣＯ２で）し、そして細菌コロニーの数を目視下に計数した。結果を以下の表６及び７に示す。 実施例３ 水中における、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー３３３またはポロキサマー３３４を含有する組成物の様々な細菌に対する殺菌活性 ＢＰＩタンパク質産物及び熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４ を含む治療用組成物の殺菌活性を、実施例１の Ｓ．ａｕｒｅｕｓ 及び Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ 臨床分離株ならびにさらなる生物である Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ＩＤ番号１４５）及び Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ＩＤ番号 １５７７３）に対して評価した。０．０７５％（重量／容量）濃度の熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４のいずれかの中に、５００μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１を含む治療用組成物は、適量の０．１％熱処理ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または熱処理ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４溶液を用いて「非製剤化」ｒＢＰＩ２１または「製剤化」ｒＢＰＩ２１の２ ｍｇ／ｍＬ 溶液を希釈することによって製剤化した。水のみ（ポロキサマーをまったく含まない）での５００μｇ／ｍＬの非製剤化ｒＢＰＩ２１を含む組成物、及び０．１％の熱処理Ｐ１０３または熱処理Ｐ１０４のみを含有する（且つｒＢＰＩ２１を含まない）ポロキサマー対照溶液も調製した。１ ｍｇ／ｍＬ ｒＢＰＩ２３、０．１％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８ 及び ０．００２％ ＴＷＥＥＮ ８０ を含有する「製剤化した」ｒＢＰＩ２３の治療用組成物も、比較のために試験した。 熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３または熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４の滅菌保存溶液は、以下の方法を用いて調製した。すなわち、（１）脱イオン水で、ポロキサマーの０．１％（重量／容量）溶液をつくり、（２）その溶液を沸騰するまで加熱し、（３）室温にまで冷却させ、（４）ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３が完全に可溶化するまで攪拌し、そして（５）滅菌のために、溶液を０．２２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅフィルターに通して濾過する。 Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ 及び Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ 細菌は、ＴＳＡプレート（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０１−９２０、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）で、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、５％ヒツジ血液寒天プレート（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０１−２００、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）で、２４時間生育した。細菌保存懸濁液は、滅菌脱イオン水にて、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｍｅｔｅｒによって測定して、およそ２．２から３．８ ｘ １０８ ＣＦＵ／ｍＬになるように懸濁させ、さらに水で１：１０に希釈することにより調製した。ｒＢＰＩ２１治療用組成物に対するアッセイは、９６ウェル平底ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ ＃２５８６０−９６）にて、各ウェルに１８５μＬのＴＳＢ（Ｒｅｍｅｌ、カタログ ＃０８−９４２、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）または注射用滅菌水（Ｋｅｎｄａｌｌ ＭｃＧａｗ）；８μＬの細菌懸濁液；６．３μＬの示された通りの５００μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１／ポロキサマー治療用組成物（またはポロキサマー対照溶液または水単独）を添加して行った。各ウェル中の細菌の最終濃度は、約４から７ ｘ １０５ ＣＦＵ／ｍＬであった。ｒＢＰＩ２３治療用組成物に対するアッセイは、１７８μＬのブロスまたは水及び１３μＬの５００μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２３組成物を添加したことを除いて、同様に行った。ウェルの中身を混合し、プレートを３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後３０分及び３時間に、各ウエル中のＣＦＵを、１０−２及び１０−４の希釈率にて計数した。３０分及び３時間における結果を、それぞれ表８及び９に示す。 ｒＢＰＩ２１及び熱処理したＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４を含有する医療用組成物を使用した予備実験において、細菌を添加する前、希釈（例えば水で）直後に治療用組成物を添加すると、細菌を添加した後に同じ治療用組成物を添加した場合に比較してより一層、ｒＢＰＩ２１の殺菌活性の増強がなされることが認められた。同じグラム陽性及びグラム陰性生物を使用して、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３ 及びＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４ 溶液で非製剤化ｒＢＰＩ２１を希釈することにより調製した治療用組成物で実施した別の予備実験において、ブロス中でｒＢＰＩ２１治療用組成物が６４μｇ／ｍＬの濃度までで、グラム陽性生物に対する殺菌活性は観察されなかった。 実施例４ ＢＰＩタンパク質産物及び他のポロキサマー界面活性剤を含有する組成物の殺菌活性 ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、またはポロキサマー４０７［例えば、ＣＴＦＡ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９９１）を参照されたい］、特に、４４７〜４５１頁］を包含する他のポロキサマー界面活性剤とＢＰＩタンパク質産物とを含む治療用組成物を調製し、実施例１、２及び３に前記した通りにＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性を増強する能力について試験する。 実施例５ 血清、ＭＵＥＬＬＥＲ−ＨＩＮＴＯＮブロス、トリプシン・ダイズ・ブロス または水中での、ＥＤＴＡを含むかまたは含まない、ポロキサマーで製剤化したＢＰＩタンパク質産物を含有する組成物の殺菌活性 ＢＰＩタンパク質産物及びＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５ または Ｐ１２３を含む治療用組成物の殺菌活性を、実施例１のＳ．ａｕｒｅｕｓ 及び Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ 生物、実施例３のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 生物、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ 生物（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ＩＤ番号 １６８６６）、及び Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ の株（ＡＴＣＣ受託番号１９６６０）に対して評価した。治療用組成物は、所望の０．２％（重量／容量）ポロキサマー濃度となるように、２．２ ｍｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１保存溶液（ポロキサマーを含まない、５ ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）に、適量のポロキサマーを添加し、次いで濾過滅菌することによって調製した。製剤化した産物は、６カ月を上限として、２〜８℃にて保存した。ポロキサマーの滅菌保存溶液は、ポロキサマーペーストを、室温にて１〜５％の濃度（重量／容量）に混合して注射用滅菌水（ＷＦＩ、Ｋｅｎｄａｌｌ−ＭｃＧａｗ）に溶解させ、次いで濾過滅菌することにより作製した。アッセイは、生育培地としてＷＦＩ、トリプシン・ダイズ・ブロス（ＴＳＢ、Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＫ）、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ プラス Ｃａｔｉｏｎｓ（ＣＳＭＨＢ、Ｒｅｍｅｌ）、または ＣＳＭＨＢにプールした４０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を用い、９６ウェルのミクロタイタープレートで、実施例２及び３に前記した一般的な方法に従って行った。結果（２４時間のインキュベーション後のコロニー形成単位で示す）を、以下の表１０に表すが、ポロキサマーがＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性を増強できることが確認される。 追加の実験で、ＢＰＩタンパク質産物とポロキサマー界面活性剤を含み、さらに様々な濃度のＥＤＴＡを含む治療用組成物の殺菌活性を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ １９６６０）に対して評価した。前記のごとく治療用組成物を製剤化して、５ ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ 及び ０．００２％ ポリソルベート ８０の緩衝液中、所望の濃度のポロキサマー及びｒＢＰＩ２１とした。アッセイは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 及び Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ について実施例２に前記したと概して同様に実施した。およそ２４時間インキュベートした後のコロニー形成単位の結果を、以下の表１１に表すが、ＥＤＴＡの添加によって、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３で製剤化したＢＰＩタンパク質産物の殺菌活性がさらに増強できることが示されている。 実施例６ ＥＤＴＡの存在下または非存在下での、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマーを含有する組成物による、様々な生物の抗生物質に対する感受性への効果 ＥＤＴＡを含むかまたは含まない、ポロキサマーで製剤化したｒＢＰＩ２１の治療用組成物を、複数の薬剤に耐性な、実施例５のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ、 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ 及び Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ の生物の抗生物質への感受性について評価した。治療用組成物は、０．２％（重量／容量）の濃度のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５ または Ｐ１２３ と共に ２ ｍｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１（５ ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）を含有するものを調製した。抗生物質への生物の感受性に対する効果は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ プラス Ｃａｔｉｏｎｓ（ＣＳＭＨＢ、Ｒｅｍｅｌ）、または ＣＳＭＨＢにプールした４０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）において、以下の通りに判定した。 一晩の培養物から単離した生物のコロニーを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）濁度計を使用して測定して０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ 標準液（およそ １ ｘ １０８ ＣＦＵ／ｍｌ）と同等の濃度にまで、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｗａｔｅｒ中に懸濁した。アリコートを、ＣＳＭＨＢ または ＣＳＭＨＢにプールした４０％ヒト血清のいずれかに移した。各チューブには、最終濃度１６μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１または等容量の対照緩衝液のいずれかが含まれていた。試験した各抗生物質に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）、すなわち、目視可能な生育を阻害する抗生物質の最低濃度は、グラム陰性（ＭＢ 及び ＭＣ）ならびにグラム陽性（ＭＡ）Ｓｅｎｓｉｔｉｔｒｅ Ｔｒａｙｓ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｗｅｓｔｌａｋｅ、オハイオ州）を使用して測定した。これによって、広範囲にわたる標準抗生物質の迅速な、そして同時の調査が許容される。Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）（Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）、Ｐａｓｃｏ（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、 ミシガン州）及び Ａｌａｍａｒ（Ａｌａｍａｒ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）システムなどの、当該技術分野において知られた他のいかなる抗微生物パネルシステムを、抗生物質感受性についてアッセイするために選択的に使用してもよい。 以下の表１２〜１５に、示されたとおりのｒＢＰＩ２１治療用組成物の存在下に調べた抗生物質のＭＩＣとして、各株の検査について報告した、抗生物質スクリーニングパネルの結果の要約を表す。試験した生物に適用可能な抗生物質感受性の基準（ＮＣＣＬＳの基準に従って、臨床的に耐性（Ｒ）、中間（Ｉ）または感受性（Ｓ）としてＭＩＣが解釈される）を、ＭＩＣの次の肩付き文字で表す。これらの結果、ＢＰＩタンパク質産物の添加によって認められる抗生物質の治療的有効性の改良が、様々なポロキサマー製剤によってさらに一層増強されうることが示唆される。 さらなる実験で、ＢＰＩタンパク質産物であるｒＢＰＩ２１を、抗微生物活性を増強するポロキサマー、特にＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３を用いて、様々な濃度のＥＤＴＡと共に製剤化し、そして Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ １９６６０）の抗生物質感受性に対する効果について評価した。抗生物質感受性は、数多くの異なる抗生物質について最小阻害濃度の同時測定が可能である、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）パネルプレート（Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）を使用して測定した。 Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）パネルプレートで実施した抗微生物感受性試験は、ブロス希釈感受性試験を小型簡略化したものである。抗微生物薬剤は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（カルシウム及びマグネシウムを、またはオキサシリン用には塩化ナトリウムを、またはトリメトプリム、スルファメトキサゾール及びトリメトプリム／スルファメトキサゾール用にはチミジンホスフォリラーゼを補充）にて、その濃度を臨床的に興味ある範囲になるように、連続的に希釈する。９６ウェルのＭｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）プレートの１つのウェルは、脱水したブロスのみを含む生育対照のウェルである。残りのウェルは、脱水したブロス及び抗生物質（またはブロス及び生化学試薬の指示薬）を含み、これは、試験生物の標準化した懸濁液を接種することにより所望の濃度にまで再水和される。色素生産性である生化学試薬の指示薬は、ｐＨ変化及び基質利用の検出に基づいて細菌の種を同定及び特徴付けするために使用される。一晩インキュベートした後、試験生物に対する抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）が、生育の阻害を示すウェルで抗生物質の最低濃度を有するものを観察することによって決定される。グラム陰性及びグラム陽性生物を、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）パネルプレート（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）、Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）のいずれのものを使用して試験してもよい。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについてのこれらの実験では、ＭＩＣ Ｐｌｕｓ Ｔｙｐｅ ２ パネルプレートを使用した。このパネルプレートにて調べた抗生物質の濃度を、以下の表１６に示す。各パネルプレートにて試験されうるグラム陰性生物に適用可能な抗生物質感受性の基準（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）の ＮＣＣＬＳに由来する基準に従う、耐性、中間または感受性としてのＭＩＣの解釈）を、以下の表１６Ａに表す。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに用いたこれらの実験のために、以下の方法を実施した。生物をＴＳＡ プレート（Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＮ）に塗布し、そして一晩、１８〜２４時間インキュベートした。プレートから、よく単離されたコロニーを、最終濁度が ０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄ硫酸バリウム標準液と同等になるように、３ ｍｌの滅菌Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｗａｔｅｒ（カタログ番号Ｂ１０１５−２、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ（登録商標）システム、Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、ｗｅｓｔ ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）に懸濁した。この細胞懸濁液は、２から３秒間渦流形成し、その１００μＬを、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｄ を含む ２５ ｍｌの Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｗａｔｅｒ（カタログ番号Ｂ０１５−７、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ（登録商標）システム、Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）（以下、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｗａｔｅｒ」と称する）、または、０．２％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３、０．００２％ ＴＷＥＥＮ ８０、５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ中のｒＢＰＩ２１（「ｒＢＰＩ２１／Ｐ１２３」）が６４μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１に希釈されていた２５ ｍｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｉｎｏｃｕｌｕｍ Ｗａｔｅｒを含有するガラスチューブに移した。 ｒＢＰＩ２１を含有するこの接種物２５ ｍｌを反転することによって混合し、トレーに注加した。接種物は、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）パネルプレートシステムでの使用のために設計された手動式９６ウェルピペッティングシステム（ＲＥＮＯＫ（登録商標）再水和−接種システム、Ｄａｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ、Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、カリフォルニア州）に吸い上げ、そして接種物のうち１１０μｌを、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）ＭＩＣ Ｐｌｕｓ Ｔｙｐｅ ２パネルプレートの各々のウエルに入れた。ウェルに添加すると、この接種物によって ４ ｘ １０５から ７ ｘ １０５ ＣＦＵ／ｍｌ の最終細菌濃度が得られた。パネルプレートを、次いで３５℃にて１５〜２４時間インキュベートし、そして細胞の生育について目視的に読み取った。 ウェル内がわずかに白いか、またはブロスが透明である場合、生育なしと規定した。生育は、ウェル全体の白濁、ウェル中央の白い粒、またはウェル全体の微細顆粒の生育の形状をとりうる、濁りとして現れた。すべてのウェルを、黒色の間接的に照明した背景を背にして読み取った。生化学的反応の目視下の結果を、細菌同定用データベースに読み取らせた。試験した各抗生物質に対するＭＩＣは、目視可能な生育を阻害する抗生物質の最低濃度を同定することによって決定した。 以下の表１７に、抗生物質スクリーニングパネルの結果を要約する。Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）の ＮＣＣＬＳに由来する基準に従う、耐性、中間または感受性としてのＭＩＣの解釈である、抗生物質感受性基準は、表１６において、肩付き文字のＲ、Ｉ及びＳでそれぞれ示されている。これらのデータから、試験したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株のセフォニシド、セフォテタン、セファマンドール、クロラムフェニコール、アンピシリン／スルバクタム、及びアモキシシリン／ｋクラブラネートへの耐性を反転させることことによって、また、試験したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株のセフチゾキシム、セフォタキシム、セフトリアキソン、及びアズトレオナムへの感受性を高めることによって、ｒＢＰＩ２１／Ｐ１２３製剤の抗細菌活性をＥＤＴＡがさらに増強させることが示される。 実施例７ ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー１８８またはポロキサマー４０３を含有する組成物の、ウサギ角膜潰瘍形成モデルにおけるＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ感染に対する抗細菌活性 ポロキサマー界面活性剤と共にＢＰＩタンパク質産物を含む治療用組成物の抗細菌活性を、角膜感染／潰瘍形成ウサギモデルにおけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染の感染前及び感染後の双方での投与情況において評価した。 これらの実験用には、感染性生物に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から入手したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ １９６６０の株を用いた。凍結乾燥した生物を、普通（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）に再懸濁し、そして１８時間振盪しながら３７℃にて生育した。培養物は、ペレットを採集し洗浄するために、インキュベーション後に遠心した。洗浄した生物を、培養物の純度を確認するためにグラム染色した。前記と同様の技術を用いて、第２世代を培養した。第２世代の細胞懸濁液は、普通ブロスにて希釈し、６００ ｎｍでの吸光度が１．５２４となるよう（およそ ６．５５ Ｘ １０９ ＣＦＵ／ｍｌの濃度）に調整した。最終的に普通ブロスで １．３ Ｘ １０６倍希釈すると、５０００ ＣＦＵ／ｍＬ すなわち １．０ Ｘ １０２ ＣＦＵ／０．０２ ｍＬとなった。ＣＦＵ測定のためのプレート計数は、普通寒天プレートに１００μＬの希釈細胞懸濁液を付し、そしてそれらを３７℃にて２４〜４８時間インキュベートすることによって行った。 使用した動物は、ニュージーランド白色ウサギであり、ＳＥＲＩ指針及び研究における動物の使用上のＡＲＶＯ決議の双方に厳密に従って飼育した。眼の健康を確かめるために、すべての眼の基礎実験を注射に先駆けて行った。すべての眼が、正常のウサギの眼に特徴的に認められる、穏やかな拡散性の蛍光染色を呈した。すべての眼の健康状態は、正常の限度内にあった。２．５から３．０ ｋｇの間の体重のウサギに、０．５〜０．７ ｍＬ／ｋｇ の齧歯類カクテル（ｒｏｄｅｎｔ ｃｏｃｋｔａｉｌ：１００ ｍｇ／ｍＬ ケタミン、２０ ｍｇ／ｍＬ キシラジン、及び １０ ｍｇ／ｍＬ アセプロマジン）を筋肉内注射することによって麻酔をかけた。注射の前に、１滴のプロパラカイン塩酸塩（０．５％ Ｏｐｈｔｈａｉｎｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）を眼に適用した。前記のごとくに調製した２０μＬの細菌懸濁液（１ Ｘ １０２ ＣＦＵ）を、無作為に指定した眼の中央角膜基質に注射し、一方、別の眼は末処置のままにした。注射、角膜上皮の模擬穿孔は、３０ゲージ、１／２インチの針及び１００μＬシリンジを使用して実施した。 最初の実験系列については、ＢＰＩタンパク質産物（試験薬物）の５日間の投与規制は以下の通りであった。すなわち、検査第０日には、基質内への細菌注射（０時）の２時間前（−２）及び１時間前（−１）に、４０μＬの試験薬物または媒体対照を試験する眼に入れ、次いで、注射後それぞれ１０時間ごとに（０から＋９時間）合計１２回投与（４０μＬ／投与）すなわち、試験の１〜４日の各日に、試験する眼にそれぞれ１０時間ごとに４０μＬの試験薬物または媒体を入れた（例えば、午前８時から午後５時までというように、毎日同じ時間に与えた）。これらの実験について、ポロキサマー１８８含有治療用組成物を試験するために、５羽の動物を、ｒＢＰＩ２１（５ ｍＭ クエン酸塩、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ ポロキサマー１８８、０．００２％ ポリソルベート８０中、２ ｍｇ／ｍＬ）を用いて処置し、そして５羽を緩衝性媒体で処置し、またポロキサマー１０３含有治療用組成物を試験するために、５羽の動物を、ｒＢＰＩ２１（５ ｍＭクエン酸塩、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ ポロキサマー４０３、０．００２％ ポリソルベート８０中、２ ｍｇ／ｍＬ）を用いて処置し、そして５羽を偽薬（５ ｍＭクエン酸塩、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、 ０．２％ポロキサマー４０３、０．００２％ ポリソルベート８０）で処置した。 臨床的徴候を認知すべく、各々５日の試験期間中、毎日２回スリットランプ生物顕微鏡を介して眼の実験を行った。結膜充血、結膜水腫及び催涙、粘液分泌を採点した。充血に対する採点の尺度は、０（なし）；１（軽度）；２（中度）；及び３（重度）であった。結膜水腫を採点するための尺度は、０（なし）；１（スリットランプで目視可能）；２（軽度の分離）；及び３（重度の膨張）であった。粘液分泌を採点するための尺度は、０（なし）；１（わずかな蓄積）；２（肥厚分泌）；及び３（離散したストランド）であった。羞明は、その有無にて記録した。催涙は、その有無にて記録した。角膜の潰瘍が存在する場合、高さ（ｍｍ）、幅（ｍｍ）、及び深さ（角膜の厚みの％）について評価した。新血管新生は、冒された角膜経線について図示した。フォトドキュメンテーションは、実験手順全体にわたって進行する症候として毎日実施した。 ５日間の検査期間終了時に、すべてのウサギを致死量のフェノバルビタールナトリウム（６グラム／ｍＬ）を用いて屠殺した。角膜を採集し、２分の１強度のＫａｒｎｏｖｓｋｙの固定液中で固定した。角膜は、微生物の存在をアッセイするためにグラム染色を用いて、また細胞浸潤についてアッセイするためにヘマトキシリン及びエオシンを使用して、光学顕微鏡用に処理した。 実験は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ を注射した後、４、２４、２８、４８、５２、７２、７６、及び９６時間に行った。これらの実験の結果を、最も強力な効果が提供されたポロキサマー４０３と共にｒＢＰＩ２１を含む治療用組成物について、表１８に示す。表１８に示される結果から、眼に穿孔による損傷を与え、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ の注射を行う前後に処置を行うことによって、充血、結膜浮腫、及び粘液形成の減少、さらには角膜潰瘍の発生率及び重症度の軽減に伴う新血管新生の発生の減少における、実質的な利点が提供されることが明らかである。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ を注射して４時間後に、処置及び対照の双方の動物に角膜の蛍光染色を行うと、注射（穿孔）による損傷に一致して小さな領域で染色されることが明らかになった。注射後２８時間で、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３で処置した眼は、清澄な眼球表面を呈し、そして典型的に、充血、結膜浮腫及び粘液分泌の証明となるものはなく、一方媒体で処置した眼は、角膜水腫及び白血球の浸潤に起因する眼球表面の曇りを示した。注射後２８時間で、媒体で処置した眼に虹彩炎が顕著に認められ、そして蛍光染色剤を適用すると、活力喪失した上皮の領域が典型的に明示され、重度の充血及び中度から重度の結膜浮腫及び粘液分泌がさらに認められた。注射後４８時間で、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３処置した眼で時折軽度の充血が認められたが、粘液分泌及び結膜浮腫はなかった。ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３処置した角膜は、他の点では典型的に清澄で健常な様子であり、これは蛍光染色剤の適用によって立証されるものであった。媒体で処置した眼は注射後４８時間で、重度の充血、結膜浮腫及び粘液分泌を呈し、角膜のあるものは、水腫、細胞浸潤及びフィブリン沈積の結果曇りが生じた潰瘍形成領域と共に、角膜の溶解及び細薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）を呈した。注射後５２時間で、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３処置した眼は、蛍光を用いた染色に耐性を有する、清澄で健常な角膜を呈しており、製剤が安全で角膜上皮に対して無毒であることを示唆していた。媒体で処置した眼は注射後５２時間で、角膜上皮の痂皮形成が顕著であり、一方結膜浮腫は減少して充血が重篤であった。これらの実験において、媒体で処置したいくつかの眼は、新血管新生を呈しており、血管が角膜中心に向かって内側に成長していた。かかる明示は、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３で処置した眼のいずれにも認められなかった。 ヘマトキシリン及びエオシンで染色した、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３で処置した角膜の病理組織学的評価によって、健常な、無傷の上皮及び基質であることが明らかになり、組織に白血球の浸潤はなかった。これと対照的に、媒体で処置した角膜の評価によって、上皮の欠如及び角膜基質内への白血球の広範囲にわたる浸潤が明らかになった。 トルイジンブルーで染色した、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３で処置した角膜のさらなる病理組織学的評価によって、やはり、健常で無傷の上皮及び基質であることが明らかになり、さらに、角膜組織にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 生物が存在しないことも明らかになった。対照的に、媒体で処置した角膜の評価によって、この組織に桿状のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 生物が認められ、当該組織内の生物に向かって進んでいる白血球細胞の存在が明らかになった。これらの結果から、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３の有効な角膜透過、及び新血管新生を伴わずに組織の有効な滅菌がなされることが示唆される。 これらの実験において試験されたｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３治療用組成物は、この重度のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ による損傷／感染のウサギモデルにて試験したｒＢＰＩ２１／ポロキサマー１８８治療用組成物の効果に比較して、最も劇的で有益な抗微生物及び抗血管形成効果を達成した。ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー１８８組成物を用いた処置については、新血管新生の抑制という点での利点は認められたものの、充血、結膜浮腫、粘液形成及び催涙の低減においては、有意な効果が認められなかった。これらの実験で、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３組成物の有効性と、それより劣るｒＢＰＩ２１／ポロキサマー１８８組成物の有効性との対比によって、製剤の成分、投与量及び投与規則のすべてが、本発明の方法にかかる有益な効果を至適化するうえで重要な役割を果たすかもしれないことが示唆された。 実施例８ ＥＤＴＡの存在下または非存在下での、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー１８８または４０３を含有する組成物の細菌及び真菌生育阻害活性 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌、ＡＴＣＣ受託番号８７３９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ受託番号９０２７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ受託番号６５３８）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダ・アルビカンス、ＡＴＣＣ受託番号１０２３１）及び Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（アスペルギルス・ニガー、ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）の、標準細菌及び真菌の試験微生物に対して、Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）微生物試験プロトコル（ＵＳＰ ２３、［５１］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ−Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ、１６８１頁）に従って、ＢＰＩタンパク質産物及びポロキサマー界面活性剤を含む治療用組成物の抗微生物保存的効果を評価した。 これらの実験のために、ＵＳＰプロトコルに従って調製した５種の試験微生物の各々からの少量の培養液を、２ ｍｇ／ｍｌ ｒＢＰＩ２１、０．２％ ポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８）またはポロキサマー４０３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３）、０．００２％ ＴＷＥＥＮ ８０、５ｍＭ クエン酸ナトリウム及び １５０ ｍＭ 塩化ナトリウムの溶液を入れた滅菌容器に添加した。ある実験では、これらの溶液にさらに様々な濃度のＥＤＴＡを含有させた。微生物を接種した後様々な時点で（すなわち、７、１４、２１及び２８日）、試験溶液のアリコートを容器から取り出し、５種の各微生物のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定するために播種した。ＵＳＰの標準に従うと、（ａ）１４日目までに初期濃度の０．１％以下まで、生存能力のある細菌の濃度が低下している；（ｂ）最初の１４日の間に、生存能力のある真菌の濃度が初期濃度以下になっている；ならびに（ｃ）残り２８日の試験期間の間に各試験微生物の濃度が、これらの指示値以下のままになっているのであれば、産物の有効性が示される。 ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー１８８及びｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３組成物の最初の試験の結果を、以下の表１９Ａ〜１９Ｂに示す。 前記のように、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３のさらなる組成物を０．０１％、０．０５％ 及び ０．１％の濃度のＥＤＴＡを配合して調製し、そして前記表１９Ｂに示す実験におけると同様に試験すると、得られた結果はすべての生物について、表１９Ｂに示される結果に匹敵するものであった。 さらなる実験において、０．０５％ ＥＤＴＡを含むかまたは含まない、２ｍｇ／ｍＬ ｒＢＰＩ２１、０．２％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３、０．００２％ ＴＷＥＥＮ ８０、５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する他の組成物を、前記のごとき有効性について評価した。結果を以下の表２０に示す。これらの実験で、０．０５％のＥＤＴＡにより、ｒＢＰＩ２１／ポロキサマー４０３組成物の抗微生物の有効性がさらに増強されていた。 前記発明の数多くの修飾及び変更が、当業者に想起されることが予想される。従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。（配列表）ＢＰＩタンパク質産物及び安定化ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤を含む治療用組成物において、殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含む、改良された治療用組成物。 【課題】改良された抗微生物性組成物及び処置方法を提供することであって、より具体的には、ＢＰＩタンパク質産物と、ＢＰＩタンパク質産物の抗細菌活性を増強するポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤を含む、治療用組成物の改良すること。【解決手段】ＢＰＩタンパク質産物及び安定化ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体（ポロキサマー）界面活性剤を含む治療用組成物において、殺菌活性増強ポロキサマー界面活性剤を含む、改良された治療用組成物。【選択図】なし