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| タイトル： | 公開特許公報(A)_マンガンペルオキシダーゼの製造方法及び失活抑制方法 |
| 出願番号： | 2006154552 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | C12N 9/04 |
特許情報キャッシュ
割石 博之 野中 大輔 江原 岳 唐崎 由子 JP 2007319115 公開特許公報(A) 20071213 2006154552 20060602 マンガンペルオキシダーゼの製造方法及び失活抑制方法 国立大学法人九州大学 504145342 大日本インキ化学工業株式会社 000002886 志賀 正武 100064908 高橋 詔男 100108578 渡邊 隆 100089037 青山 正和 100101465 鈴木 三義 100094400 西 和哉 100107836 村山 靖彦 100108453 割石 博之 野中 大輔 江原 岳 唐崎 由子 C12N 9/04 20060101AFI20071116BHJP JPC12N9/04 Z 6 ＯＬ 9 4B050 4B050CC10 4B050DD05 4B050EE04 4B050EE10 4B050HH02 4B050LL05 4B050LL10 本発明は、担子菌を培養してマンガンペルオキシダーゼを製造する方法、及び製造中にマンガンペルオキシダーゼの失活を抑制する方法に関する。 マンガンペルオキシダーゼは酸化還元酵素の一種であり、ビフェノールの合成に有用であるだけでなく、パルプ漂白やダイオキシンなど有害物質の分解除去への利用が考えられている。マンガンペルオキシダーゼは、白色腐朽菌などの担子菌を培養することによって、その産生物として得ることができるが、培養途中でその生産量（活性）が一旦最大となった後、急激に減少（失活）することが知られており、回収率が低下し易いという問題点があった。 そこで、マンガンペルオキシダーゼの失活原因に関する種々の考察がなされている。例えば、担子菌の一種であるファネロケーテ クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＢＫＭ株の培養中に生じるマンガンペルオキシダーゼの失活は、混在するプロテアーゼが原因であるとする報告（非特許文献１参照）がある。また、ウスヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ）の培養中に生じるマンガンペルオキシダーゼの失活は、副生する過酸化水素が原因であるとする報告（非特許文献２参照）がある。Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５６， Ｐ．３９５−４００（１９９０）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．６５， Ｐ．９２３−９２８（１９９９） しかし、非特許文献１および２には、マンガンペルオキシダーゼの回収率を向上させるのに有効な方法は記載されておらず、生産性が不充分であるため、マンガンペルオキシダーゼの製造コストが高くなるという問題点があった。 本発明は、上記事情に鑑みて為されたものであり、担子菌の培養途中におけるマンガンペルオキシダーゼの失活を抑制できるマンガンペルオキシダーゼの製造方法及び失活抑制方法を提供することを課題とする。 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、空気より酸素分圧の高い気体を培地に供給しながら担子菌の培養を行い、マンガンペルオキシダーゼの活性が略最大となった時点で、供給する気体を速やかに空気に切り替えること、すなわち、培地へ供給する前記気体の分圧を速やかに低減することで、マンガンペルオキシダーゼの失活を効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は、空気中の酸素分圧よりも高い分圧の酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えた後、マンガンペルオキシダーゼを回収することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。 また、本発明は、培地に酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで培地に供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの失活抑制方法を提供するものである。 本発明によれば、培養途中におけるマンガンペルオキシダーゼの失活を抑制できるので、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができ、製造コストを低減することができる。 以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。◎マンガンペルオキシダーゼの製造方法[使用する微生物] 本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）属、レンティヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、フェルリナス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ）属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ファネロケーテ フラヴィド−アルバ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｆｌａｖｉｄｏ−ａｌｂａ）、ファネロケーテ ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロケーテ マグノリエ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）、ファネロケーテ クリソスポリウムＳＣ２６（ＡＴＣＣ６４３１４）、ファネロケーテ クリソスポリウムＭＥ４４６（ＡＴＣＣ３４５４１）、ファネロケーテ クリソスポリウムＨＨＢ−６２５１−ｓｐ（ＡＴＣＣ３４５４０）、ファネロケーテ クリソスポリウムＯＧＣ１０１（ＡＴＣＣ２０１５４２）、ファネロケーテ クリソスポリウム ＩＮＡ−１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３９８）、ファネロケーテ クリソスポリウムＩ−１５１２ （ＣＮＣＭ Ｉ−１５１２）を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）が挙げられる。 また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。[培地成分]（マンガン塩） 本発明で用いるマンガン塩としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。これらマンガン塩の培地中濃度は、マンガンペルオキシダーゼの高い生産性向上効果が得られることから、好ましくは２５０μＭ以上、より好ましくは２５０〜９００μＭであり、特に好ましくは３００〜７００μＭとなるよう設定する。（炭素源） 本発明で使用する培地には炭素源が含まれるが、該炭素源としては担子菌の培地に通常用いられる炭素源が利用でき、好ましいものとしてグルコース、グリセロール及びセルロースなどが挙げられ、特に好ましいものとしてグルコースが挙げられる。培地中のグルコース濃度は、菌の増殖やマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することから、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１〜４質量％、特に好ましくは１．５〜３質量％となるよう設定する。（その他の培地成分） また本発明の培地は、前記のマンガン塩や炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。 例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。 またｐＨ調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。 さらに、担子菌の培養を良好に行うことができることから、ベラトリルアルコールを含む培地を使用することが好ましく、この時の培地中のベラトリルアルコールの濃度は、０．５〜１０ｍＭとすることが好ましい。 なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。 [培養条件] 本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は２０〜４５℃であるが、３５〜３７℃程度であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜７．５が好ましく、４．０〜７．０がより好ましい。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。 担子菌の培養は、静置培養、振とう培養及び撹拌培養のいずれでも行うことができる。ここで撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。そして撹拌培養を行う際の撹拌速度は、培地量等により適宜選択すれば良い。 [培地への気体の供給] マンガンペルオキシダーゼの製造は、前記担子菌を使用して、前記培地及び培養条件で行う。 培地へ供給する、切り替え前の気体は、空気中の酸素分圧よりも高い分圧の酸素を含む気体であればよいが、該気体中の酸素分圧は、３０％以上であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましい。そして、この時の培地への前記高酸素分圧気体の供給量は、１〜１００ｍＬ／ｍｉｎ／Ｌ培養液であることが好ましい。 そして、切り替え後の気体は、酸素分圧が気体切り替え前よりも低ければよいが、酸素分圧が低い方がマンガンペルオキシダーゼの失活抑制効果が高く、空気中の酸素分圧以下の酸素分圧であることが好ましい。切り替え後の気体を空気とすれば、簡便な操作かつ低コストで充分なマンガンペルオキシダーゼの失活抑制効果が得られる。そして、切り替え後の前記低酸素分圧気体の培地への供給量は、０〜１００ｍＬ／ｍｉｎ／Ｌ培養液であることが好ましい 培地への気体の供給は、培養槽などの培養を行う設備内の気相部分へ気体を供給することで行えばよい。また、使用する培地が液体培地であれば、培地中へ直接気体を吹き込んでもよい。 培地へ供給する気体の切り替えは、マンガンペルオキシダーゼの活性が略最大となってから行うことが好ましい。ここで、マンガンペルオキシダーゼの活性測定はいずれの方法で行ってもよいが、例えば、後述の実施例で述べるように、硫酸マンガンを基質とした酸化反応（Ｍｎ３＋−マロン酸錯体形成）の光学的測定により行うことができる。 培地へ供給する気体の切り替えは、速やかに行う方がマンガンペルオキシダーゼの失活抑制効果が高く、この時の酸素分圧の低減速度は０．００５〜８０％／秒であることが好ましい。 培地へ気体を供給しながら培養を行う時間は、培地の組成やその他の培養条件により適宜調整すればよく、培養中のマンガンペルオキシダーゼの活性の推移を確認しながら決めればよい。例えば、前述の培養条件であれば、培地へ供給する気体の切り替えまでの時間は１６０時間程度が好ましいが、この限りではない。 [マンガンペルオキシダーゼの回収] 担子菌培養後のマンガンペルオキシダーゼの回収は、従来公知の方法により行えば良い。例えば、培養液を吸引濾過して得られた培養濾液を粗酵素溶液とし、各種緩衝液を使用してｐＨ調整すると共にイオン交換樹脂に該粗酵素溶液を添加して、該粗酵素溶液中のマンガンペルオキシダーゼをイオン交換樹脂に吸着させ、マンガンペルオキシダーゼ以外の成分を除去し、次いで、所定のｐＨに調整された各種緩衝液を使用して、吸着されたマンガンペルオキシダーゼを流出させることで、マンガンペルオキシダーゼ溶液を得ることができる。この時使用する緩衝液などは、使用するイオン交換樹脂に応じて適宜選択すればよい。また、イオン交換樹脂を使用するマンガンペルオキシダーゼの回収方法はここに挙げたものに限定されない。 また、イオン交換樹脂を使用する方法以外にも、例えば、培養液を濾過して得られた培養濾液に対して、適宜限外ろ過膜等を用いて、夾雑物の除去、濃縮・脱塩等を行うことで、マンガンペルオキシダーゼを回収しても良い。◎マンガンペルオキシダーゼの失活抑制方法 培地に酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで培地に供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えることで、産生されたマンガンペルオキシダーゼの失活を効果的に抑制することができる。ここで、用いる担子菌、培地成分及び培養条件は、前述の内容に従うことが好ましく、切り替え前後の酸素を含む気体の供給方法及び時間、切り替えのタイミング、酸素の分圧なども、好ましくは前述の条件を適用すればよい。 本発明によれば、担子菌の培養において、産生されたマンガンペルオキシダーゼの失活を効果的に抑制できるので、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができ、しかも酸素分圧の低減は低コストで行うことができるので、マンガンペルオキシダーゼの製造コストを低減することができる。 以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。[実施例１]空気置換あり（培地） 表１に示した培地各２．５Ｌを用意した。なお、表１中の６×トレースエレメンツの組成を表２に示した。そして、ｐH電極を備えた５Ｌ容量発酵槽Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ型（株式会社丸菱バイオエンジ製）に前記培地を仕込み、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。（担子菌の培養及びマンガンペルオキシダーゼの回収） 前記の発酵槽にファネロケーテ クリソスポリウム ＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３７℃、空気供給０．５ｖｖｍ、フルゾーン翼（神鋼パンテック株式会社製）１５０ｒｐｍの条件で撹拌培養を開始した。培養中、培養液のｐＨは４．５を維持するよう、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いて制御した。 ３日後、ベラトリルアルコールを１．０５ｍｌ添加し、空気の供給を停止すると共に３０ｍｌ／ｍｉｎで純酸素供給を開始した。培養を継続し、経時的に培養液を採取した。採取した培養液を下記酵素活性測定に供し、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）濃度を算出した。そして、ＭｎＰ濃度がピークを過ぎた時点で直ちに純酸素の供給を停止し、空気の通気により積極的に純酸素を追い出し置換した。その後は空気の供給も停止した状態で温度調節及び撹拌を継続し、経時的に培養液の採取と活性測定を行った。培養液中のＭｎＰ濃度の経時変化を図１に示す。その結果、培養途中で急激なＭｎＰ濃度低下（失活）は起こらず、ＭｎＰ回収時点まで高い濃度（活性）を維持することが出来た。 前記培養で得た培養液から不織布による濾過、及び濾紙を用いた吸引濾過で菌体を除いた。この液を、ＵＦ１０００Ｋの膜を透過させて高分子夾雑物を除去し、次いでＵＦ５Ｋの膜を用いて濃縮・脱塩し、ＭｎＰ精製液を回収した。ＭｎＰの活性測定から算出した回収率は約９０％であった。（マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の活性測定） ＭｎＰの活性は、硫酸マンガンを基質とした酸化反応（Ｍｎ３＋−マロン酸錯体形成）の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に蒸留水４３５μＬ、５００ｍＭマロン酸二ナトリウム−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）５０μＬ、５０ｍＭ硫酸マンガン５μＬ、培養液サンプル５μＬを入れ、これに対し１０ｍＭ過酸化水素５μＬを添加することで酸化反応を開始した。 そして、分光光度計ＵＶ−１６５０ＰＣ（株式会社島津製作所製）を用いて、反応液のＵＶ２７０ｎｍにおける吸収の増加をモニタすることで反応初速度を測定した。濃度既知のＭｎＰ溶液との反応初速度比較により、培養液サンプル中のＭｎＰの濃度（ｍｇ／Ｌ）を算出した。[比較例１] 空気置換なし ＭｎＰ濃度がピークを過ぎた時点で、酸素の供給停止及び空気の通気による酸素の追い出し置換を行うことなく、そのまま培養を継続したこと以外は、実施例１と同様にして培地調製、培養及び酵素活性測定を行った。その結果、図１に示すように、ＭｎＰ濃度は培養１４５時間の３７ｍｇ／Ｌをピークに、その後は急激に低下（失活）してしまい、回収時点では１１ｍｇ／Ｌにまで落ち込んだ。 本発明は、安価なマンガンペルオキシダーゼの供給に有用である。実施例１及び比較例１における、培養液中のマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）濃度の経時変化を示したグラフである。 空気中の酸素分圧よりも高い分圧の酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えた後、マンガンペルオキシダーゼを回収することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。 マンガンペルオキシダーゼの活性が略最大となってから、前記気体の切り替えを行う請求項１に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。 前記切り替え後の気体中の酸素分圧が、空気中の酸素分圧以下である請求項１又は２に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。 前記気体の切り替えにおける酸素分圧の低減速度が、０．００５〜８０％／秒である請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。 前記担子菌がファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。 培地に酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで培地に供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの失活抑制方法。 【課題】担子菌の培養途中におけるマンガンペルオキシダーゼの失活を抑制できるマンガンペルオキシダーゼの製造方法及び失活抑制方法を提供する。【解決手段】空気中の酸素分圧よりも高い分圧の酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えた後、マンガンペルオキシダーゼを回収することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法、及び培地に酸素を含む気体を供給しながら担子菌を培養し、次いで培地に供給する気体を、当該酸素分圧よりも低い分圧の酸素を含む気体に切り替えることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの失活抑制方法。【選択図】なし