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内橋 欣也 池内 喜郎 白上 篤 浜口 行雄 JP 2006220665 公開特許公報(A) 20060824 2006105733 20060406 血液中のヘモグロビン濃度測定方法 シスメックス株式会社 390014960 西野 卓嗣 100088867 内橋 欣也 池内 喜郎 白上 篤 浜口 行雄 G01N 33/72 20060101AFI20060728BHJP G01N 33/48 20060101ALI20060728BHJP JPG01N33/72 AG01N33/48 B 7 1 1997101808 19970418 ＯＬ 11 2G045 2G045AA02 2G045AA25 2G045BB29 2G045BB39 2G045CA11 2G045DA52 2G045DA77 2G045GC10 本発明は、血液試料中の白血球及びヘモグロビン濃度測定方法に関する。 血液中の白血球数及びヘモグロビン濃度を測定することは、白血病や貧血症等の臨床診断あるいは、治療経過をモニタリングする上で極めて重要である。 現在では、白血球数及びヘモグロビン濃度は、自動血液分析装置によって短時間で測定することができ、広く使用されている。 自動血液分析装置には、光散乱や蛍光等を検出する光学的検出方式によるものと、細孔を粒子が通過するときのインピーダンス変化を検出する電気抵抗検出方式によるものとに大別できるが、後者の方が簡便さという点では優れている。電気抵抗検出方式によれば、白血球数の測定は、血液試料に溶血剤を加えて赤血球を溶解し、白血球のみを残した白血球測定用試料を調製した後、検出器に流して発せられる信号を検出することによって行われる。 また、通常末梢血液中の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球の5種類が存在するが、溶血剤の組成を好適に配合することによって、2つあるいは3つに分画したり、特定の種類の白血球のみを検出することができる。これにより、顕微鏡観察に頼らざるを得なかった白血球分類も自動的に短時間で行うことができるようになり、検査技師の負担が軽減され、また検査に特別の技術を要することがなくなった。 一方、ヘモグロビン濃度の測定には、シアン化合物を含むVan Kampen試薬によりヘモグロビンをシアンメトヘモグロビンに転化して541nm付近の吸光度を測定することによって行う方法が国際標準法として採用されている。また、自動血球分析装置用には、界面活性作用を有する四級アンモニウム塩で赤血球を断片化し、かつヘモグロビンを変性し、シアン化アルカリでシアンメトヘモグロビン様の吸収曲線を得て測定を行い、さらに白血球の測定をも可能にしたものが知られている。しかしながらこれらの方法は、試薬中に有害なシアン化合物を含むため、試薬あるいは測定後の試料は、無毒化してから廃棄する必要がある。 そこで、ヘモグロビン濃度の測定のためにシアン化合物を使用せず、白血球計数を可能にした試薬が知られている（特許文献１）。この試薬では、界面活性作用を有する水溶性四級アンモニウム塩と、少量の炭素数約8個までのポリカルボン酸を白血球の溶解を十分阻止できる量で含む。さらには、白血球の3分類を可能にした溶血剤も知られている。これらは、四級アンモニウム塩と特定のヘモグロビン安定化剤とを含む。（特許文献２、特許文献３、特許文献４）米国特許第4,185,964号公報特開平3-137566号公報特開平3-252557号公報特開平4-13969号公報 上記の溶血剤は、ヘモグロビンを速やかに変性させることができるが、試料の液温が変動するとヘモグロビン濃度が大きく変動するという欠点がある。とくに、特許文献１では、安定化剤がないため、変動が大きい。特許文献２、特許文献３、特許文献４では、特定のヘモグロビン安定化剤が加えられているため変動は小さくなるものの、液温が変動したときにはヘモグロビン濃度が変動し、そのような場合の安定化効果としては不十分である。従って、安定した測定値を得るためには、液温を一定に保つためのユニットが必要になる。このため、装置のコストアップの要因の一つになる。本発明は、シアン化合物を使用せず、白血球数を測定でき、また試料の液温が変動しても安定してヘモグロビン濃度を測定できる方法を提供することを目的とする。 本発明は、（１）赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性するカチオン性界面活性剤、並びに下記の（a）、（b）及び（c）からなる群から選ばれるヘモグロビン安定化剤：（a）スルホサリチル酸あるいはその塩、（b）窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート剤、及び（c）ピペラジンあるいはその塩、を含有する試薬と血液とを混合し、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに転化して測定用の試料を調製する工程、（２）（１）の工程で調製された試料中のメトヘモグロビンを測定する工程、を含む血液中のヘモグロビン濃度測定方法を提供する。また、本発明は、（１）カチオン性界面活性剤で、血液中の赤血球を溶解し、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変性する工程、（２）下記の（a）、（b）及び（c）からなる群から選ばれるヘモグロビン安定化剤：（a）スルホサリチル酸あるいはその塩、（b）窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート剤、及び（c）ピペラジンあるいはその塩、で、変性されたメトヘモグロビンを安定化する工程、（３）安定化されたメトヘモグロビンを測定する工程、を含む血液中のヘモグロビン濃度測定方法を提供する。 本発明によれば、試料の液温が変わっても安定に白血球数及びヘモグロビン濃度を測定することができる。このため、試料の液温を一定にするためのユニットも不要になり、分析装置を安価にすることができる。また、シアン化合物を使用せずに白血球数及びヘモグロビン濃度を測定することができるため、廃液処理のための特別な操作は不要になる。 白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬を用いると、白血球及びヘモグロビン濃度を同時に測定することもできるし、あるいは別々に測定することもできる。 白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬には、赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性しうる量のカチオン性界面活性剤を含む。カチオン性界面活性剤としては、好適には、下記の構造を有する四級アンモニウム塩型あるいはピリジニウム塩型の少なくとも１種類を含む。 具体的には以下のものが好ましい：(a)四級アンモニウム塩（式中、Ｒ1はＣ8〜Ｃ20のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は独立にＣ1〜Ｃ8のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｘ-はハロゲンイオン基である）(b)ピリジニウム塩（式中、ｎ＝７〜１９の整数であり、Ｘ-はハロゲンイオン基である） 上記試薬で使用されるカチオン性界面活性剤の好適な濃度は、0.1〜15.0ｇ／Ｌである。上記のうち、好ましくは四級アンモニウム塩であり、特に好適な濃度は0.1〜4.0ｇ／Ｌである。また、上述の界面活性剤を適宜組み合わせることによって、白血球を例えば、リンパ球とその他の２つ、あるいは、リンパ球、好中球およびその他の３つに分画することができる。 また、白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬には、メトヘモグロビンへの転化を促進するのに有効な量のヘモグロビン安定化剤を含む。安定化剤は(a)スルホサリチル酸あるいはその塩、(b)窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート剤及び(c)ピペラジンあるいはその塩からなる群から選ばれる少なくとも１種類である。水溶性キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸あるいはその塩、ジアミノプロパノール四酢酸あるいはその塩、ジアミノプロパン四酢酸あるいはその塩、エチレンジアミン二酢酸あるいはその塩、エチレンジアミン二プロピオン酸あるいはその塩が挙げられる。特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸塩である。 ヘモグロビン安定化剤はメトヘモグロビンへの転化を促進するのに有効な量で使用するが、通常0.2〜10.0ｇ／Ｌの範囲で好適に使用される。より好適な濃度については、用いる物質によって異なるが、スルホサリチル酸あるいはその塩を使用する場合、より好適な濃度は0.2〜2.0ｇ／Ｌである。また、水溶性キレート剤を使用する場合、例えばエチレンジアミン四酢酸塩では0.5〜10ｇ／Ｌ、ジアミノプロパノール四酢酸あるいはその塩では0.5〜5ｇ／Ｌ、ジアミノプロパン四酢酸あるいはその塩では0.5〜5ｇ／Ｌ、エチレンジアミン二酢酸あるいはその塩では0.5〜5ｇ／Ｌ、エチレンジアミン二プロピオン酸二塩酸塩では0.5〜5ｇ／Ｌで特に好適に使用される。ピペラジンあるいはその塩では、0.5〜5ｇ／Ｌで好適に使用される。なお、この安定化剤が緩衝能を有する場合には、緩衝剤の一部として用いてもよい。 これらの安定化剤は、上述したカチオン性界面活性剤または、その組み合わせ組成により変性したメトヘモグロビン中のヘム鉄と結合することにより安定化するものと推測できる。 緩衝剤は、pHを4.0〜6.0に維持できるものであれば、とくに制限されない。pHが低すぎると、白血球が脆弱化されることにより白血球数の測定に悪影響を及ぼす。又、pHが高すぎるとヘモグロビンの経時安定性が悪くなる。具体的には、Good緩衝剤、リン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、マレイン酸−トリス緩衝剤等公知のものが使用できる。濃度は、5〜50mM、さらには15〜30mMが好適である。 なお、上記の各成分の濃度は、血液を直接白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬に希釈して使用する場合の濃度である。あるいは、あらかじめ、血液を希釈液（例えば、生理食塩水やセルパックTM （東亞医用電子（株）））で希釈した後に試薬を添加してもよい。その場合は、試薬添加後の濃度が上記の範囲になるように、各成分の濃度を調整すればよい。このとき用いられる希釈液は、血球の形態を保持するために、通常ｐＨが中性付近(6〜8)、浸透圧が等張付近(240〜330 Osm/kg)のものが好適に使用される。 上記試薬は電気伝導度を８〜２０mS/cmとすることが好ましく、１０〜１５mS/cmとすることがさらに好ましい。電気伝導度の調節はＮａＣｌなどの電解質を適宜添加して行うことができる。 白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬を用いて血液から測定用の試料を調製し、自動血球分析装置に試料を導入し、粒子が細孔を通過するときのインピーダンス変化を検出することにより白血球を、また試料の吸光度を検出することによりヘモグロビン濃度を同一試料で同時に、又は別々に測定することができる。 上記試薬の組成例としては例えば次のものが挙げられる。組成例１ セチルトリメチルアンモニウムクロライド 0.3〜3.0ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 0.5〜5.0ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 15〜30mM ＮａＣｌ 適量 精製水 １Ｌ組成例２ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.3〜10.0ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.1〜1.0ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 0.5〜5.0ｇ／Ｌ Ｇｏｏｄ緩衝液 15〜30mM ＮａＣｌ 適量 精製水 １Ｌ組成例３ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.3〜10.0ｇ／Ｌ ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン 0.5〜5.0ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 0.5〜5.0ｇ／Ｌ コハク酸緩衝液 15〜30mM ＮａＣｌ 適量 精製水 １Ｌ 組成例１〜３では、白血球及びヘモグロビンを同時に測定することができるが、各界面活性剤の種類、濃度を調整することにより、白血球を２つ以上の集団に分画することも可能である。白血球の集団とは、例えばリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球などを示す。組成例１では、白血球を１つの集団に、組成例２、３では白血球を２〜３つの集団にそれぞれ分けるように組み合わせたものである。 実施例１：温度変化に対する安定性 以下の本発明の試薬及び比較例１、２の試薬を調製して、異なる温度下で反応させたときのヘモグロビンの量を測定した。本発明の試薬 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.0ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.2ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 1.0ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 20mM(pH 5.0) ＮａＣｌ 適量 （電気伝導度を約13mS/cmにする量） 精製水 １Ｌ比較例１ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.0ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.2ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 20mM ＮａＣｌ 適量 （電気伝導度を約13mS/cmにする量） 精製水 １Ｌ比較例２ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.0ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.2ｇ／Ｌ イミダゾール 1.0ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液 （電気伝導度を約13mS/cmにする量） 精製水 １Ｌ 血液を上記組成の各試薬で５００倍に希釈し、１０℃及び３５℃で３０秒反応させた後の吸光度を分光光度計を用いて測定し、３５℃における吸光度の１０℃における吸光度に対する変化率、ならびにそれから計算した変化ヘモグロビン量（換算値）を求めた。得られた結果を表１に示す。表１ 比較例１の試薬は、本発明の試薬から安定化剤を除いた組成であるが、この場合、温度による変化率は大きい。上記本発明の試薬では安定化剤としてＥＤＴＡ−２Ｋを、比較例２では安定化剤としてイミダゾールを含むが、これらにおいては変化率は安定化剤を含まない比較例１に比べて減少した。 安定化剤としてはこれ以外のものも使用可能であるが、その変化率の程度は使用する安定化剤の種類によって異なっていた。 実施例２：従来法との相関関係試薬組成 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 8.7ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.8ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 3.0ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 60mM(pH 5.0) ＮａＣｌ 電気伝導度を13mS/cmにする量 精製水 １Ｌ １）ヘモグロビンにおける相関関係 上記試薬を用い、セルパックTM（東亞医用電子（株））を希釈液とし、Ｋ−４５００（東亞医用電子（株））を使用して、１１３検体についてヘモグロビン量の測定を行った。対照は、シアンメトヘモグロビン変法（国際標準法を自動血球分析装置用に改良された方法：ストマトライザーＣ（東亞医用電子（株））を使用し、同様にＫ−４５００で測定）で測定したヘモグロビン量として相関図を作成した（図１）。この装置では、血液はまず希釈液で希釈され、次いで上記試薬と混合される。最終的には、血液は５００倍に希釈され、上記試薬のカチオン界面活性剤、EDTA-2K、リン酸緩衝液濃度は１／３になる。ＮａＣｌは希釈液中にも含まれており、電気伝導度はほとんど変わらない。図中、Ｘ軸に従来法を、Ｙ軸に本発明の試薬を用いた方法を表した。グラフの相関係数r=0.997、回帰直線Y=0.951X+0.588と良好な相関関係が得られ、ヘモグロビンが測定可能であることが確認できた。 ２）白血球における相関関係 上記試薬を用い、セルパックTM（東亞医用電子（株））を希釈液とし、Ｋ−４５００（東亞医用電子（株））を使用して、白血球数の測定を行った。対照は、ストマトライザー３ＷＰTM（東亞医用電子（株））を使用し、同様にＫ−４５００で測定を行い、相関図（図２）を作成した（Ｎ＝１１３）。グラフの相関係数r=0.997、回帰直線Y=0.986X+1.137と良好な相関関係が得られ、従来法と同様に白血球が測定可能であることが確認できた。 又、白血球分類値についても検討を行ったところ、従来法と同等の良好な相関関係が得られた（Ｎ＝５１）。図３〜図５に結果を示す。なお、Ｗ−ＳＣＲは溶血剤添加後の小型白血球比率でリンパ球比率に相当し、Ｗ−ＬＣＲは溶血剤添加後の大型白血球比率で好中 球比率に相当し、Ｗ−ＭＣＲは溶血剤添加後の中型白血球比率でその他の白血球の比率に相当する。また、粒度分布図を図６に示す。 実施例３：白血球２分類試薬試薬組成 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 6.1ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 1.1ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 3.0ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 60mM(pH 5.0) ＮａＣｌ 電気伝導度を13mS/cmにする量 精製水 １Ｌ 上記試薬を用い、セルパックTM（東亞医用電子（株））を希釈剤とし、Ｋ−４５００（東亞医用電子（株））を使用して、白血球の測定を行ったところ、白血球が２分類できることが確認された。粒度分布図を図７に示す。図中、大きさの小さな集団がリンパ球に相当し、大きい側の集団がその他の白血球に相当する。実施例２の試薬を用いて測定したヘモグロビン量と従来法で測定したヘモグロビン量との相関図である。実施例２の試薬を用いて測定した白血球数と従来法で測定した白血球数との相関図である。実施例２の試薬を用いて測定した、Ｗ−ＳＣＲと従来法で測定したＷ−ＳＣＲとの相関図である。実施例２の試薬を用いて測定したＷ−ＭＣＲと従来法で測定したＷ−ＭＣＲとの相関図である。実施例２の試薬を用いて測定したＷ−ＬＣＲと従来法で測定したＷ−ＬＣＲとの相関図である。実施例２の試薬を用いて測定した白血球の粒度分布図である。実施例３の試薬を用いて測定した白血球の粒度分布図である。（１）赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性するカチオン性界面活性剤、並びに下記の（a）、（b）及び（c）からなる群から選ばれるヘモグロビン安定化剤： （a）スルホサリチル酸あるいはその塩、 （b）窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート剤、及び （c）ピペラジンあるいはその塩、を含有する試薬と血液とを混合し、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに転化して測定用の試料を調製する工程、（２）（１）の工程で調製された試料中のメトヘモグロビンを測定する工程、を含む血液中のヘモグロビン濃度測定方法。前記（１）の工程において、シアン化合物を使用せずにヘモグロビンをメトヘモグロビンに転化して測定用の試料を調製する請求項１に記載のヘモグロビン濃度測定方法。さらに、前記（１）の工程で調製された試料中の白血球を測定する工程を含む請求項１に記載のヘモグロビン濃度測定方法。前記白血球を測定する工程が、白血球を分類する工程である請求項３に記載のヘモグロビン濃度測定方法。前記水溶性キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸塩である請求項１に記載のヘモグロビン濃度測定方法。前記赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性するカチオン性界面活性剤が、一般式（I）：（式中、Ｒ1はＣ8〜Ｃ20のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は独立にＣ1〜Ｃ8のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｘ-はハロゲンイオン基である）で表される四級アンモニウム塩、及び一般式（II）：（式中、ｎ＝７〜１９の整数であり、Ｘ-はハロゲンイオン基である）で表されるピリジニウム塩からなる群から選ばれる請求項１に記載のヘモグロビン濃度測定方法。（１）カチオン性界面活性剤で、血液中の赤血球を溶解し、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変性する工程、（２）下記の（a）、（b）及び（c）からなる群から選ばれるヘモグロビン安定化剤： （a）スルホサリチル酸あるいはその塩、 （b）窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート剤、及び （c）ピペラジンあるいはその塩、で、変性されたメトヘモグロビンを安定化する工程、（３）安定化されたメトヘモグロビンを測定する工程、を含む血液中のヘモグロビン濃度測定方法。 【課題】シアン化合物を使用せず、また試料の液温が変動しても安定してヘモグロビン濃度を測定できる方法を提供する。【解決手段】（１）赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性するカチオン性界面活性剤、並びに下記の（a）、（b）及び（c）からなる群から選ばれるヘモグロビン安定化剤： （a）スルホサリチル酸あるいはその塩、 （b）窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート剤、及び （c）ピペラジンあるいはその塩、を含有する試薬と血液とを混合し、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに転化して測定用の試料を調製する工程、（２）（１）の工程で調製された試料中のメトヘモグロビンを測定する工程、を含む血液中のヘモグロビン濃度測定方法。【選択図】 図１

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