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庵原 啓司 星野 躍介 古賀 倫子 杉本 正裕 関戸 治知 JP 2007068532 公開特許公報(A) 20070322 2006058544 20060303 デオキシリボヌクレオシド一リン酸からのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法 株式会社ニチロ 000233620 宮崎 昭夫 100123788 石橋 政幸 100106138 緒方 雅昭 100127454 庵原 啓司 星野 躍介 古賀 倫子 杉本 正裕 関戸 治知 JP 2005232537 20050810 C12P 19/30 20060101AFI20070223BHJP C12P 19/32 20060101ALI20070223BHJP C12N 15/09 20060101ALI20070223BHJP JPC12P19/30C12P19/32C12N15/00 A 7 ＯＬ 19 4B024 4B064 4B024AA01 4B024AA03 4B024BA10 4B024CA04 4B024CA05 4B024CA06 4B024DA06 4B024EA04 4B024FA02 4B024FA10 4B024GA11 4B024GA19 4B024HA03 4B024HA08 4B024HA14 4B064AF23 4B064AF24 4B064CA02 4B064CA19 4B064CA21 4B064CB27 4B064CC24 4B064CD15 4B064CE03 4B064CE11 4B064CE15 4B064DA01 4B064DA16 本発明は、酵素反応によるリン酸化により、デオキシリボヌクレオシド一リン酸からデオキシリボヌクレオシド二リン酸を経て、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を製造する方法に関する。 デオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）の製造法としては、デオキシリボヌクレオシド一リン酸（dNMP）を化学反応によりリン酸化してdNTPを製造する方法（浮田忠之進：医学・生物学のための有機化学7, 核酸ヌクレオシド・ヌクレオチド，122，朝倉書店(1965年)）、微生物による直接発酵法(特公昭46-037871号公報、特公昭46-037872号公報、特公昭46-038558号公報、特公昭46-038559号公報)が知られている。また、リボヌクレオシド三リン酸を原料として、ラクトバチルス属細菌由来のリボヌクレオシド三リン酸レダクターゼ遺伝子をエシェリヒア・コリで発現させて得た組換え酵素を用い、ジチオスレイトール等の還元剤存在下で、dNTPを製造する方法がある（Brunella, A. et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10, 215-222 (2000)）。特公昭46-037871号公報特公昭46-037872号公報特公昭46-038558号公報特公昭46-038559号公報浮田忠之進：医学・生物学のための有機化学7, 核酸ヌクレオシド・ヌクレオチド，122，朝倉書店(1965年)Brunella, A. et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10, 215-222 (2000) 従来のdNTPの製造法では製造効率が低い場合が多く、大量生産に適した製造方法が提供されていない。そのため、dNTPは、もっぱら医薬品や精密化学分野における試薬として利用されており、その他の用途では余り使われていないのが現状である。比較的効率のよい技術として報告されている非特許文献２に開示の製造法は、リボヌクレオシド三リン酸の還元によりデオキシリボヌクレオシド三リン酸を得る技術であり、原料としてリボヌクレオシド三リン酸を必要とするため製造コストの低減に限界がある。 本発明は、比較的安価なdNMPを原料としてdNTPの効率的製造法を提供することを目的とするものである。本発明の他の目的は、大量で安価なdNTP生産を可能にすることにより、dNTPの工業用原料としての用途の拡大を図ることにある。 本発明にかかるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法は、デオキシリボヌクレオシド一リン酸（dNMP）のリン酸化によってデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）を製造する方法において、（１）ヌクレオシド一リン酸(NMP)キナーゼ遺伝子を有する組換えベクターを有し、かつ該遺伝子に基づくヌクレオシド一リン酸キナーゼを有する微生物形質転換体の存在下で、dNMPにATPを反応させてデオキシリボヌクレオシド二リン酸（dNDP）を得る第１のリン酸化工程と、（２）ヌクレオシド二リン酸（NDP）キナーゼの存在下で、前記dNDPにATPを反応させてdNTPを得る第２のリン酸化工程と、を有し、 前記第１のリン酸化工程において用いられるdNMPとNMPキナーゼ遺伝子とが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの組合せである（ａ）デオキシアデノシン一リン酸とアデニレートキナーゼ遺伝子(adk)の組合せ、（ｂ）デオキシグアノシン一リン酸とグアニレートキナーゼ遺伝子(gmk)の組合せ、（ｃ）デオキシシチジン一リン酸とシチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)の組合せ、（ｄ）デオキシチミジン一リン酸とチミジレートキナーゼ遺伝子(tmk)の組合せ、ことを特徴とするデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法である。 本発明によれば、酵素活性を利用することでdNTPの製造効率の向上を図ることが可能となる。更に、比較的安価に入手可能であるdNMPを原料として用いることができる。従って、本発明によれば、dNTPの製造を安価かつ安定して行なうことが可能となり、製造コストの低減を図ることができる。効率的生産によるdNTP製造コストの削減は、dNTPの医薬品、精密化学分野における製品の製造原料としての使用を可能にする。例えば、PCR法による目的とする塩基配列を持つ高分子DNAの効率的製造など、従来原料原価が高価であったため実用化されていなかった技術の実用化を可能にする。 本発明におけるdNTPの製造は、酵素反応を利用したdNMPのリン酸化により開始される。製造原料としてのdNMPとしては、デオキシアデノシン一リン酸(dAMP)、デオキシグアノシン一リン酸(dGMP)、デオキシシチジン一リン酸(dCMP)及びデオキシチミジン一リン酸(dTMP)の何れかが用いられる。第１のリン酸化工程は、ATPをリン酸の供給源として、各dNMPに、これに特異的に作用するヌクレオシド一リン酸（NMP）キナーゼ作用させることで行なわれる。各dNMPに対して用いられる酵素は以下のとおりである。dAMP用：アデニレートキナーゼdGMP用：グアニレートキナーゼdCMP用：シチジレートキナーゼdTMP用：チミジレートキナーゼ 上記の各酵素をそれぞれの基質としてのdNMPに作用させることで、デオキシアデノシン二リン酸（dADP）、デオキシグアノシン二リン酸（dGDP）、デオキシシチジン二リン酸（dCDP）及びデオキシチミジン二リン酸（dTDP）をそれぞれ得ることができる。 dNMPとしては、種々のものが利用できるが、サケ白子等の天然物のDNA粗抽出液を微生物由来ヌクレアーゼにより加水分解物して得られるdNMPを好適に用いることができる。 このヌクレアーゼとしては、微生物由来のヌクレアーゼを用いることができる。 この加水分解物の調製に用いることのできる核酸粗抽出液は、サケ等魚類精巣、ウシ胸腺等から常法により抽出したＤＮＡを含む抽出液を用いることができる。この抽出液に、ＤＮＡを分解してdNMPを生成させることのできるヌクレアーゼを作用させることで、加水分解物としてdNMPの混合物を得ることができる。この混合物を第１のリン酸化工程における原料として用いることができる。 一方、第２のリン酸工程で用いられる酵素は、ヌクレオシド二リン酸（NDP）キナーゼであり、上記の４種の二リン酸化合物に対して作用し得るものである。ATPをリン酸の供給源とし、この酵素の存在下で三リン酸化を行なうことで、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）及びデオキシチミジン三リン酸（dTTP）をそれぞれ得ることができる。なお、デオキシチミジンはチミジンのことであり、２−デオキシリボースを有する点を明確とする上で、本発明ではデオキシチミジンと記載する。 第１のリン酸化工程と第２のリン酸化工程とは別の工程として行ってもよいし、第１のリン酸化工程用の反応系と第２のリン酸化工程用の反応系を混合系とし、これらを並行して同一反応系内で進行させてもよい。 第１のリン酸化工程においてdNMPにNMPキナーゼを作用させるためには、NMPキナーゼ遺伝子を組み込んだ組換えベクターを導入した微生物形質転換体が用いられる。この形質転換体を得るために用いるNMPキナーゼ遺伝子と宿主は、本発明の目的効果が得られるものであれば特に限定されない。 NMPキナーゼ遺伝子の取得、組換えベクターの作製、それを用いた宿主の形質転換は常法により行なうことができる。組換えベクターを得るためのベクター部分としては、宿主での目的遺伝子の発現のためのプロモーターなどの発現用領域と、宿主内での保持に必要な領域とを有したものを適宜選択して用いることができる。このベクターとしては、pUC18などの発現用のプラスミドが好適である。しかしながら、これらに限定されない。 例えば、微生物からプラスミドDNAの単離精製、プラスミドDNAの制限酵素による切断、切断したDNA断片の酵素的結合、組換え体DNAを用いた形質転換等、遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法（「Molecular cloning」（Maniatisら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982)）に準じて行うことができる。また、目的遺伝子の取得などに利用するポリメラーゼ・チェイン・リアクッション（以下、PCRと略す）は公知の方法（Mullis K, Faloona F, et.al.；Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73.）に従って行うことができる。 第１のリン酸化工程は、反応液中で、形質転換体の有するNMPキナーゼ活性を、ATPの存在下にdNMPに作用させることで行なうことができる。反応液は、NMPキナーゼ活性によりリン酸化が可能である各種緩衝液などから形成することができる。 反応液中にATPを供給する方法としては、市販のATPを反応液に混合する方法、通常のエネルギー代謝でATP再生系を強化した微生物やポリリン酸キナーゼの作用でATPを再生する微生物を反応液中に共存させる方法（共役系）が利用できる。後者の共役系を利用すると、高価な市販のATPを用いることを回避でき、製造コストの低減を図ることが可能である。 第１のリン酸化工程に用いるNMPキナーゼとしては、NMPキナーゼを生産する微生物の培養液（菌体を含む）、この培養液を種々処理した培養液の処理物などの形態で反応に用いることができる。培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。 第２のリン酸化工程に用いるNDPキナーゼとしても、種々の形態のものを用いることができる。例えば、NDPキナーゼを生産する微生物の培養液（菌体を含む）、この培養液を種々処理した培養液の処理物などの形態で反応に用いることができる。培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。 上記処理に用い得る界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えば、ナイミーンS-215、日本油脂製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドなどのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤などいずれでもよく、1種または数種混合して使用することもできる。界面活性剤は通常０．１〜５０ｇ／lの濃度で用いられる。有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜50ｍｌ／lの濃度で用いられる。 NDPキナーゼを生産する微生物としては、野生型のもの、野生型に変異を生じさせたもの、あるいはNDPキナーゼ遺伝子を有する組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いることもできる。この形質転換体の製造も、先に述べたNMPキナーゼ遺伝子での形質転換の場合と同様の手法及び材料が利用できる。 なお、dNMPからdNTPへの変換に関わる遺伝子（adk：アデニレートキナーゼ遺伝子, gmk：グアニレートキナーゼ遺伝子, cmk：シチジレートキナーゼ遺伝子, tmk：チミジレートキナーゼ遺伝子, ndk：ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子）は、本発明の目的効果が得られるものであれば特に制限されない。また、第１のリン酸化工程及び第２のリン酸化工程に用いる形質転換体を得るための宿主胞についても特に制限はされず、エシェリヒア属、サッカロマイセス属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。 また、宿主にNMPキナーゼ遺伝子とNDPキナーゼ遺伝子の両方を組み込んだ形質転換体（これらの遺伝子を共発現する形質転換体）を用いることで、同一形質転換体により第１のリン酸化工程と第２のリン酸化工程を逐次連続して行わせることが可能となる。 第２のリン酸化工程も、反応液中で、NDPキナーゼ活性を、ATPの存在下にdNDPに作用させることで行なうことができる。反応液は、NDPキナーゼ活性によりリン酸化が可能である各種緩衝液などから形成することができる。 第２のリン酸化工程においても、反応液中にATPを供給する方法として、市販のATPを反応液に混合する方法、通常のエネルギー代謝でATP再生系を強化した微生物やポリリン酸キナーゼの作用でATPを再生する微生物を反応液中に共存させる方法（共役系）が利用できる。後者の共役系を利用すると、高価な市販のATPを用いることを回避でき、製造コストの低減を図ることが可能である。 第１のリン酸化工程及び第２のリン酸化工程の少なくとも一方において用いることのできるATP生産能を有する微生物としては、糖代謝に伴うATP供給能を持った微生物であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（藤尾達郎ほか：バイオサイエンスとインダストリー，56，737-742(1998).）や酵母（板倉辰六郎：醗酵工学，56，508-526(1978).）などが挙げられる。また、ポリリン酸キンナーゼの作用でATPを再生する微生物として、ポリリン酸キナーゼ遺伝子をクローン化した組換え大腸菌などが挙げられる（J. Biol. Chem.,267, 22556-22561(1992)）。 第１のリン酸化工程及び第２のリン酸化工程の両方に必要とされる酵素活性を有する微生物を用いる場合は、各リン酸化工程に別の微生物を用いてもよいし、先に述べたようにこれらの工程に必要な２つの酵素を共発現する形質転換体を用いても良い。 更に、微生物、特に、NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体及びNDPキナーゼを有する微生物は、増殖が抑制された状態で酵素活性を有する静止菌体として用いることが好ましい。 更に、第１のリン酸化工程を行ってから第２のリン酸化工程を行なっても良いし、同一反応液中に２つの酵素活性を存在させて逐次連続して第１及び第２のリン酸化工程を行なっても良い。 本発明の製造において、２種類以上の微生物を用いる場合、該微生物をそれぞれ個別に培養し、該培養液をそれぞれ所望とする工程に利用してもよいし、一つの培養器に同時に植菌し、２種以上の微生物を混合培養した後、該培養液を用いてもよい。 第１及び第２のリン酸化工程における反応温度は、２０℃〜５０℃の範囲から選択することができる。 第２のリン酸化工程終了の反応液からのdNTPの回収は常法により行なうことができる。例えば、反応液から、活性炭処理、イオン交換樹脂、吸着樹脂によるクロマト分離、有機溶媒晶析法、有機溶媒沈殿、活性炭処理などを適宜組み合わせて用い、例えば、dATPナトリウム塩、dGTPナトリウム塩、dCTPナトリウム塩またはdTTPナトリウム塩として取得することができる。 また、生成したdNTPの定量は、HPLC法（P. L. Brown, Journal of Chromatography, 52, 257 (1970)）やキャピラリー電気泳動法（R.Takigiku, R. E. Schneider, Journal of Chromatography, 559, 247 (1991)）などを用いて行うことができる。 dNTPは生体内でのDNA生合成の基質であり、生化学研究分野や臨床検査分野では、PCR（DNAポリメラーゼを用いる鎖形成反応）法の基質として広く使われている。この反応は、効率的な反応であり、産業的には広く活用できる可能性を持っている。しかし、反応の原料であるdNTPの価格は極めて高価であるため、使用量が微量である試験研究・臨床検査領域に活用は限定されているのが現状である。本発明の方法はdNTPの大量生産に適用可能であり、dNTPが大量生産されることで、安価なdNTPを提供することができ、dNTPの新しいニーズを生み出すことが期待される。 以下、本発明を実施例等により更に詳細に説明する。なお、以下における「％」は特に断らない限り重量基準である。 （製造例１） （NMPキナーゼ遺伝子あるいはNDPキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成） 大腸菌由来のdNMPからdNTPへの変換に関わる遺伝子（adk, gmk, cmk, tmk, ndk）を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。 (アデニレートキナーゼ遺伝子（adk）のクローニング) エシェリヒア・コリK12株（IFO3301）の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のadk塩基配列（GenBank accession No. X03038）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（adk(F)及びadk(R)（シグマジェノシスジャパン（株）で合成））によるPCR法を行い、アデニレートキナーゼ（adk）遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれXbaI(adk(F))及びHindIII(adk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 adk(F)：5'−CGTCTAGAATTAACCGTTTCAGCCCC−3'（26mer）（配列番号：１） adk(R)：5'−CTAAGCTTTATCCGGCCTGAGATTGC−3'（26mer）（配列番号：２）PCRによるadk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（62℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をXbaI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素XbaI及びHindIIIで切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-ADKと命名した。pUC-ADKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のXbaI−HindIII切断部位にadk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、アデニレートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-ADKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1001と命名した。 (グアニレートキナーゼ遺伝子（gmk）の取得と発現) エシェリヒア・コリK12株（IFO3301）の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のgmk塩基配列（GenBank accession No. M84400）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（g(F)及びg(R)（インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、グアニレートキナーゼ（gmk）遺伝子を含む約1.0kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (g(F))及びHindIII(g(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 g(F)：5'−TTGAATTCGGCAAATGCGGAAGCAGC−3'（26mer）（配列番号：３） g(R)：5'−TTAAGCTTGCAGCGCGATTACAGTGG−3'（26mer）（配列番号：４）PCRによるgmk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（56℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をEcoRI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-GMKと命名した。pUC-GMKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のEcoRI−HindIII切断部位にgmk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、グアニレートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-ＧＭKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1002と命名した。 (シチジレートキナーゼ遺伝子（cmk）の取得と発現) エシェリヒア・コリK12株（IFO3301）の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のcmk塩基配列（GenBank accession No. D90729）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（ck(F)及びck(R)（シグマジェノシスジャパン（株）で合成））によるPCR法を行い、シチジレートキナーゼ（cmk）遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (ck(F))及びHindIII(ck(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 ck(F)：5'−TCGAATTCAGCCCGCTATAATTGCGC−3'（26mer）（配列番号：５） ck(R)：5'−CGAAGCTTATTTAACGTCCACCTGGC−3'（26mer）（配列番号：６） PCRによるcmk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（60℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をEcoRI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びHindIII で切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-CMKと命名した。pUC-CMKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のEcoRI−HindIII切断部位にcmk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、シチジレートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-CＭKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1003と命名した。 (チミジレートキナーゼ遺伝子（tmk）の取得と発現) エシェリヒア・コリK12株（IFO3301）の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のtmk塩基配列（GenBank accession No. U41456）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（tk(F)及びtk(R)（シグマジェノシスジャパン（株）で合成））によるPCR法を行い、チミジレートキナーゼ（tmk）遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (tk(F))及びHindIII(tk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 tk(F)：5'−GCGAATTCCTATTTTGTGGCCGATGG−3'（26mer）（配列番号：７） tk(R)：5'−ATAAGCTTAGCATCATCGCCCATGCC−3'（26mer）（配列番号：８） PCRによるtmk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（62℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をEcoRI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びHindIII で切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。 このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-TMKと命名した。pUC-TMKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のEcoRI−HindIII切断部位にtmk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、チミジレートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-TＭKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1004と命名した。 (ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子（ndk）の取得と発現) エシェリヒア・コリK12株（IFO3301）の染色体DNAを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のndk塩基配列（GenBank accession No. X57555）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（ndk(F)及びndk(R)（シグマジェノシスジャパン（株）で合成））によるPCR法を行い、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）遺伝子を含む約0.6kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれXbaI (ndk(F))及びHindIII(ndk(R))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 ndk(F)：5'−CGTCTAGAATCAATAGTCAACGGCCC−3'（26mer）（配列番号：９） ndk(R)：5'−TAAAGCTTAGAAACGCCCCGGTGAGC−3'（26mer）（配列番号：１０） PCRによるndk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（62℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。増幅断片をXbaI及びHindIIIで切断し、同じく制限酵素XbaI及びHindIII で切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。 このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-NDKと命名した。pUC-NDKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のXbaI−HindIII切断部位にndk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-NDKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1005と命名した。 エシェリヒア・コリ NCR-1001〜NCR-1005の各形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2005年6月24日で寄託されており、寄託番号は以下のとおりである。エシェリヒア・コリ NCR-1001:NITE P-102エシェリヒア・コリ NCR-1002:NITE P-103エシェリヒア・コリ NCR-1003:NITE P-104エシェリヒア・コリ NCR-1004:NITE P-105エシェリヒア・コリ NCR-1005:NITE P-106 （アデニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成） 大腸菌由来のdAMPからdADPへの変換に関わる遺伝子（adk）と大腸菌由来のdADPからdATPへの変換に関わる遺伝子（ndk）の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。 (アデニレートキナーゼ遺伝子（adk）とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）の共発現) 先に構築したプラスミドpUC-ADKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のadk塩基配列（GenBank accession No. X03038）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（adk(F2)及びadk(R2)（インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、アデニレートキナーゼ（adk）遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれBamHI(adk(F2))及びSalI(adk(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。また、先に構築したプラスミドpUC-NDKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の既知のndk塩基配列（GenBank accession No. X57555）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（ndk(F2)及びndk(R2)（インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）遺伝子を含む約0.6kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれSalI (ndk(F2))及びSphI(ndk(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 adk(F2)：5'−AAGGATCCATTAACCGTTTCAGCCCC−3'（26mer）（配列番号：１１） adk(R2)：5'−TTGTCGACTATCCGGCCTGAGATTGC−3'（26mer）（配列番号：１２） ndk(F2)：5'−GCGTCGACATCAATAGTCAACGGCCC−3'（26mer）（配列番号：１３） ndk(R2)：5'−TTGCATGCAGAAACGCCCCGGTGAGC−3'（26mer）（配列番号：１４） PCRによるadk遺伝子およびndk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（60℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 それぞれの増幅断片をSalIで切断し、Ligation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いてadk及びndkの両断片を連結した。連結後の断片を鋳型DNAとして用い、２種類の両端プライマー（adk(F2)及びndk(R2)（インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、アデニレートキナーゼ（adk）遺伝子およびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）遺伝子を含む約1.5kb断片（adk-ndk）を増幅した。増幅断片をBamHI及びSphIで切断し、同じく制限酵素BamHI及びSphIで切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。 このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-ADK-NDKと命名した。pUC-ADK-NDKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のBamHI−SphI切断部位にadk遺伝子とndk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、アデニレートキナーゼ及びヌクレオシドジホスフェートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-ADK-NDKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1006と命名した。 （グアニレートキナーゼキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成） 大腸菌由来のdGMPからdGDPへの変換に関わる遺伝子（gmk）と大腸菌由来のdGDPからdGTPへの変換に関わる遺伝子（ndk）の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。 (グアニレートキナーゼ遺伝子（gmk）とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）の共発現) 先に構築したプラスミドpUC-GMKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のgmk塩基配列（GenBank accession No. M84400）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（g(F)及びg(R2)（インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、グアニレートキナーゼ（gmk）遺伝子を含む約1.0kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (g(F))及びXbaI(g(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 g(F)：5'−TTGAATTCGGCAAATGCGGAAGCAGC−3'（26mer）（配列番号：３） g(R2)：5'−GGTCTAGAGCAGCGCGATTACAGTGG−3'（26mer）（配列番号：１５） PCRによるgmk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（60℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をEcoRI及びXbaIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びXbaIで切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-GMK2と命名した。 先に構築したプラスミドpUC-NDKを制限酵素XbaI及びHindIIIで切断して得られたヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）遺伝子を含む約0.6kb断片を、同じく制限酵素XbaI及びHindIIIで切断したプラスミドpUC-GMK2とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。 このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-GMK-NDKと命名した。pUC-GMK-NDKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のEcoRI−HindIII切断部位にgmk遺伝子とndk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、グアニレートキナーゼ及びヌクレオシドジホスフェートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-GMK-NDKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1007と命名した。 （シチジレートキナーゼキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成） 大腸菌由来のdCMPからdCDPへの変換に関わる遺伝子（cmk）と大腸菌由来のdCDPからdCTPへの変換に関わる遺伝子（ndk）の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。 (シチジレートキナーゼ遺伝子（cmk）とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）の共発現) 先に構築したプラスミドpUC-CMKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のcmk塩基配列（GenBank accession No. D90729）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（ck(F) （シグマジェノシスジャパン（株）で合成））及びck(R2) （インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、シチジレートキナーゼ（cmk）遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれEcoRI (ck(F))及びXbaI(ck(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 ck(F)：5'−TCGAATTCAGCCCGCTATAATTGCGC−3'（26mer）（配列番号：５） ck(R2)：5'−GCTCTAGAATTTAACGTCCACCTGGC−3'（26mer）（配列番号：１６） PCRによるcmk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（60℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をEcoRI及びXbaIで切断し、同じく制限酵素EcoRI及びXbaI で切断したプラスミドpUC18（タカラバイオ（株））とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-CMK2と命名した。 先に構築したプラスミドpUC-NDKを制限酵素XbaI及びHindIIIで切断して得られたヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）遺伝子を含む約0.6kb断片を、同じく制限酵素XbaI及びHindIIIで切断したプラスミドpUC-CMK2とLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。 このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-CMK-NDKと命名した。pUC-CMK-NDKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のEcoRI−HindIII切断部位にcmk遺伝子とndk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、シチジレートキナーゼ及びヌクレオシドジホスフェートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-CMK-NDKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1008と命名した。 （チミジレートキナーゼキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ遺伝子組換え微生物の造成） 大腸菌由来のdTMPからdTDPへの変換に関わる遺伝子（tmk）と大腸菌由来のdTDPからdTTPへの変換に関わる遺伝子（ndk）の両方を宿主大腸菌に組換えた菌株造成の場合を以下に記載する。 (チミジレートキナーゼ遺伝子（tmk）とヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ndk）の共発現) 先に構築したプラスミドpUC-TMKを鋳型DNAとして用い、エシェリヒア・コリK12株の 既知のtmk塩基配列（GenBank accession No. U41456）に基づいて設計した以下に示す２種類の両端プライマー（tk(F2)及びtk(R2) （インビトロジェン（株）で合成））によるPCR法を行い、チミジレートキナーゼ（tmk）遺伝子を含む約0.9kb断片を増幅した。なお、プライマーの5'末端付近には、それぞれBamHI (tk(F2))及びXbaI(tk(R2))の制限酵素認識配列を加えて設計した。 tk(F2)：5'−TTGGATCCCTATTTTGTGGCCGATGG−3'（26mer）（配列番号：１７） tk(R2)：5'−ATTCTAGAAGCATCATCGCCCATGCC−3'（26mer）（配列番号：１８） PCRによるtmk遺伝子の増幅は、反応液50μL（鋳型 DNA 1μg, 50pM プライマーDNA 各1μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10×PCR buffer 5μL, TaKaRa Taq TM DNA polymerase 0.5 μL(2.5U)）を0.2mL容量のPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler GP−TP500）にセットし、熱変性（94℃、0.5分）、アニーリング（60℃、0.5分）、伸長反応（72℃、1.0分）からなる反応ステップを30回繰り返し行った。 増幅断片をBamHI及びXbaIで切断し、同じく制限酵素BamHI及びXbaIで切断したプラスミドpUC18-NDKとLigation-Convenience Kit（（株）ニッポンジーン）を用いて連結した。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリJM109（タカラバイオ（株））を形質転換した。形質転換株をアンピシリン(100μg/mL)、IPTG(0.1mM)およびX-Gal(40μg/mL)を含むLB寒天培地（Tryptone:1.0%, Yeast extract:0.5%, NaCl:1.0%）で培養し、アンピシリン耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を取得した。 このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドをpUC-TMK-NDKと命名した。pUC-TMK-NDKは、pUC18が持つlacプロモーター下流のBamHI−HindIII切断部位にtmk遺伝子とndk遺伝子を含有する断片が挿入されたものであり、lacプロモーター支配下で発現され、チミジレートキナーゼ及びヌクレオシドジホスフェートキナーゼに翻訳されるものである。また、プラスミドpUC-TMK-NDKを保持する形質転換体をエシェリヒア・コリ NCR-1009と命名した。 エシェリヒア・コリ NCR-1006〜NCR-1009の各形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2006年2月21日及び2月28日に寄託手続がなされ、受領日及び受領番号は以下のとおりである。エシェリヒア・コリ NCR-1006:NITE AP-196 (受領番号)；２月２１日（受領日）エシェリヒア・コリ NCR-1007:NITE AP-197 (受領番号)；２月２１日（受領日）エシェリヒア・コリ NCR-1008:NITE AP-213 (受領番号)；２月２８日（受領日）エシェリヒア・コリ NCR-1009:NITE AP-199 (受領番号)；２月２１日（受領日） （使用するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの特性） ATPを再生し、反応系にATPを供給する微生物としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170を使用した。但し、ATP再生系をもち、反応系にATPを供給できる微生物であれば、本菌株にこだわるものではない。 （各キナーゼ含有静止菌体及びATP再生系菌体の調整法） 本特許に記載の組換えエシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（以下「コリネ菌」と略す）の培養菌体は、以下の方法で作成する。 （組換えエシェリヒア・コリ（NRC-1001, NRC-1002, NRC-1003, NRC-1004, NRC-1005）の培養菌体の作成） アンピシリン100μg/mｌを含有するLB斜面培地（バクトトリプトン1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl 1.0%；pH7.0(NaOH添加による)）で37℃、一晩培養したものを種菌とした。これを、同LB培地（アンピシリン含有）3mLに一白金耳接種し、37℃にて24時間振とうしながら一次培養を行った。一次培養液2mLを 200mLの同LB培地（アンピシリン含有、500mL容坂口フラスコを使用）に接種し、37℃で振とう培養（回転数130rpm）した。培養2時間後にIPTGを終濃度0.5mMとなるように添加後、20時間培養した。 （組換えエシェリヒア・コリ（NRC-1006, NRC-1007, NRC-1008, NRC-1009）の培養菌体の作成） アンピシリン100μg/mｌを含有するLB斜面培地（バクトトリプトン1.0%、酵母エキス0.5%、NaCl 1.0%；pH7.0(NaOH添加による)）で37℃、一晩培養したものを種菌とした。これを、同LB培地（アンピシリン含有）3mLに一白金耳接種し、37℃にて24時間振とうしながら一次培養を行った。一次培養液2mLを 200mLの同LB培地（アンピシリン含有、500mL容坂口フラスコを使用）に接種し、37℃で振とう培養（回転数130rpm）した。培養2時間後にIPTGを終濃度0.5mMとなるように添加後、20時間培養した。 （コリネ菌の培養菌体の作成） 肉エキス・ブイヨン斜面培地（肉エキス0.3%、ペプトン0.3%；pH6.8）で30℃、1〜2日間培養したものを種菌とした。これをグルコース・ブイヨン培地（ペプトン1.0%、酵母エキス0.2%、グルコース1.0%、MgSO4・7H2O 0.1%、ビオチン100μg/L；初発pH7.0(NaOH添加による)；500mL容坂口フラスコ使用）3mLに一白金耳接種し、30℃にて24時間振とうしながら一次培養を行った。一次培養液2.5mLを75mLのグルコース・ブイヨン培地（ペプトン 1.0%、酵母エキス 0.2%、肉エキス 1.0%、尿素 0.4%、グルコース 5.0%、MgSO4・7H2O 0.1%、(NH4)2SO4 1.0%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4 0.2%、MnSO4・2H2O 1mg/L、FeSO4・7H2O 1mg/L、CaCl2・2H2O 10mg/L、ビオチン 100μg/L；初発pH 7.0 （NaOH溶液による）；500mL容バッフル付き三角フラスコを使用）に接種し、30℃で24時間、回転数170rpmで振とう培養した。 （共役反応） コリネ菌 15g/l、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1005） 1(〜3)g/l に相当する遠心分離菌体、アデニレートキナーゼ、グアニレートキナーゼ、シチジレートキナーゼ、あるいはチミジレートキナーゼの何れか一つを高生産するエシェリヒア・コリ（NCR-1001, NCR-1002, NCR-1003, NCR-1004） 1g/l に相当する遠心分離菌体、グルコース 5% KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/Lからなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3（KOH溶液により調整）でスターラー攪拌しながら反応させた。 （共発現大腸菌を用いた共役反応） コリネ菌 20g/l、アデニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1006）、グアニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1007）、シチジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1008）、あるいはチミジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1009） 1(〜6)g/l に相当する遠心分離菌体、グルコース 5%、KH2PO4 0.1%、ニコチン酸 0.016%、MgSO4・7H2O 0.1%、ナイミーン 0.4%、キシレン 10mL/Lからなる反応液15mLを30mLビーカーに添加し、32℃、初発pH 7.3（KOH溶液により調整）でスターラー攪拌しながら反応させた。 （実施例１） dTMP（10mM）、チミジレートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1004 培養菌体(1g/L)、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1005 培養菌体（1g/L）、コリネ菌（ATCC-21170）培養菌体（15g/L）で前述の反応条件下15時間反応させた。最終反応液中の生成したdTTPは4.4 mM、副生成物のdTDPは 2.8 mMであった。 （実施例２） 実施例１と同様な手順で、dAMP、dGMP、dCMPを原料とし、組換えエシェリヒア・コリを下表の組合わせで実施した。反応条件は前述の条件で実施した。 原料となる各dNMP10ｍＭから得られた反応生成物を下表に示す。 （実施例３） dTMP（10mM）、チミジレートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1004 培養菌体(1g/L)、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリNCR-1005 培養菌体（1g/L）、ATP（10mM）で前述の反応条件下8時間反応させた。最終反応液中の生成したdTTPは1.9mM、副生成物のdTDPは5.0mMであった。 （実施例４） 実施例３と同様な手順で、dAMP、dGMP、dCMPを原料として反応を行った。組換えエシェリヒア・コリの組合わせは実施例２と同様の組合せで実施した。原料となる各dNMP10ｍＭから得られた反応生成物を下表に示す。 （実施例５） dTMP（20mM）、チミジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1009）培養菌体(3g/L)、コリネ菌（ATCC-21170）培養菌体（20g/L）で前述の反応条件下12時間反応させた。最終反応液中の生成したdTTPは6.8 mM、副生成物のdTDPは 7.0 mMであった。 （実施例６） 実施例５と同様な手順で、dAMPを原料とした場合はアデニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1006）、dGMPを原料とした場合はグアニレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1007）、dCMPを原料とした場合はシチジレートキナーゼおよびヌクレオシドジホスフェートキナーゼ高生産エシェリヒア・コリ（NCR-1008）を用い、前述の反応条件で実施した。原料となる各dNMP20ｍＭから得られた反応生成物を下表に示す。 （実施例７）（白子由来DNA加水分解物の調製） ここで示す実施例は、公知のデオキシリボヌクレオシド一リン酸（dNMP）の調製を示すものである。白子より抽出したDNA-Na溶液に市販酵素ヌクレアーゼを添加し、60℃で15時間反応させた。反応終了後冷却し、メンブランフィルターにてろ過を行い、このDNA-Na酵素分解液を陰イオン交換樹脂カラムに通液し４種のdNMPを吸着した。カラムを水洗後、希塩酸で溶出し、４種のdNMP画分を取得した。各画分についてHPLCにより分析した結果、それぞれ純度は98%以上であった。 （実施例８） 原料dAMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したdAMPである以外、実施例２と同様にして反応を実施し、原料dAMP 70mMからdATP14.2 mM、副生成物としてdADP 23.6 mM得られた。 （実施例９） 原料dGMP、dCMP及びdTMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したでdGMP、dCMP及びdTMPある以外、実施例１及び２と同様にして反応を実施し、実施例１及び２と同様な結果を得た。 （実施例１０） 原料dAMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したdAMPである以外、実施例６と同様にして反応を実施し、原料dAMP 65mMからdATP14.7 mM、副生成物としてdADP 18.2 mM得られた。 （実施例１１） 原料dGMP、dCMP及びdTMPが、白子由来DNA加水分解物で取得したdGMP、dCMP及びdTMPである以外、実施例５及び６と同様にして反応を実施し、実施例５及び６と同様な結果を得た。 （実施例１２）（dATPの精製） ここで示す実施例は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の公知の方法を利用した精製を示すもので、精製法はこの実施例に限定されるものではない。実施例４で行った最終反応液（dATP7.8g/L、dADP12.5g/L、dAMP9.5g/l）を加熱することで反応を停止し、遠心分離及びろ過を行うことで菌体及び不溶物を除去せしめた。この反応液400mlを100mlの陰イオン交換樹脂カラムに通液しdATPを吸着した。カラムを水洗後、0.025N-HClを通液しdAMP、dADP等の不純物を除去した。さらに0.05N-HCl+0.15N-NaClで溶出しdATP画分を取得する。dATP画分をHPLCにより分析した結果、純度99%以上（対dATP+dADP+dAMP）のdATPが2.0g含まれることを確認した。得られたdATP画分にはNaClが含まれているが、メタノールを用いた晶析を行うことで、dATP-2Na塩の結晶を得ることが出来る。 デオキシリボヌクレオシド一リン酸（dNMP）のリン酸化によってデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）を製造する方法において、（１）ヌクレオシド一リン酸(NMP)キナーゼ遺伝子を有する組換えベクターを有し、かつ該遺伝子に基づくヌクレオシド一リン酸キナーゼを有する微生物形質転換体の存在下で、dNMPにATPを反応させてデオキシリボヌクレオシド二リン酸（dNDP）を得る第１のリン酸化工程と、（２）ヌクレオシド二リン酸（NDP）キナーゼの存在下で、前記dNDPにATPを反応させてdNTPを得る第２のリン酸化工程と、を有し、 前記第１のリン酸化工程において用いられるdNMPとNMPキナーゼ遺伝子とが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの組合せである（ａ）デオキシアデノシン一リン酸とアデニレートキナーゼ遺伝子(adk)の組合せ、（ｂ）デオキシグアノシン一リン酸とグアニレートキナーゼ遺伝子(gmk)の組合せ、（ｃ）デオキシシチジン一リン酸とシチジレートキナーゼ遺伝子(cmk)の組合せ、（ｄ）デオキシチミジン一リン酸とチミジレートキナーゼ遺伝子(tmk)の組合せ、ことを特徴とするデオキシリボヌクレオシド三リン酸の製造方法。 前記第２のリン酸化が、NDPキナーゼ(ndk遺伝子)を有する微生物の存在下で行なわれる請求項１に記載の製造方法。 前記NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体が、前記NDPキナーゼを共有するものであり、該微生物形質転換体を前記第１及び第２のリン酸化工程の両方に用いる請求項２に記載の製造方法。 前記NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体と、該微生物形質転換体と異なるNDPキナーゼを有する微生物と、を前記第１及び第２のリン酸化工程のそれぞれにおいて用いる請求項２に記載の製造方法。 前記NMPキナーゼ活性を有する微生物形質転換体が静止菌体の状態で用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。 前記NDPキナーゼを有する微生物が静止菌体の状態で用いられる請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。 前記第１及び第２のリン酸化工程の少なくとも一方において用いられるATPが、ATP生産能がある微生物によってリン酸化工程に供給される請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。 【課題】比較的安価なdNMPを原料としてdNTPの効率的製造法を提供し、dNTPの工業用原料としての用途の拡大を図ること。【解決手段】デオキシリボヌクレオシド一リン酸（dNMP）のリン酸化によってデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）を製造する際に、（１）ヌクレオシド一リン酸(NMP)キナーゼ遺伝子を有する組換えベクターを有し、かつ該遺伝子に基づくヌクレオシド一リン酸キナーゼを有する微生物形質転換体の存在下で、dNMPにATPを反応させてデオキシリボヌクレオシド二リン酸（dNDP）を得る第１のリン酸化工程と、（２）ヌクレオシド二リン酸（NDP）キナーゼの存在下で、前記dNDPにATPを反応させてdNTPを得る第２のリン酸化工程と、を有する方法を用いる。【選択図】なし配列表

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