生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_サルモネラ菌検出用デバイス及びその利用方法 |
| 出願番号： | 2005518063 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12Q 1/04,C12Q 1/10,C12M 1/34,C12M 1/16,C12R 1/42 |
特許情報キャッシュ
翠川 裕 中村 哲 岸本 和恵 牧野 祥子 竹中 裕美子 JP 4427634 特許公報(B2) 20091225 2005518063 20050210 サルモネラ菌検出用デバイス及びその利用方法 株式会社三重ティーエルオー 802000042 小林 洋平 100108280 翠川 裕 中村 哲 岸本 和恵 牧野 祥子 竹中 裕美子 JP 2004034438 20040212 20100310 C12Q 1/04 20060101AFI20100218BHJP C12Q 1/10 20060101ALI20100218BHJP C12M 1/34 20060101ALI20100218BHJP C12M 1/16 20060101ALI20100218BHJP C12R 1/42 20060101ALN20100218BHJP JPC12Q1/04C12Q1/10C12M1/34 AC12M1/16C12Q1/10C12R1:42 C12Q 1/04 C12Q 1/10 C12M 1/16 C12M 1/34 PubMed JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) 特開平０６−０２２７９１（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−２７９９９（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−１８８０６８（ＪＰ，Ａ） 特開平８−１１６９９７（ＪＰ，Ａ） 特開平１０−３１３８９２（ＪＰ，Ａ） 特開平６−６２８３３（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−１６９７９９（ＪＰ，Ａ） 国際公開第９６／４０８６１（ＷＯ，Ａ１） 厚生省生活衛生局監修，食品衛生検査指針 微生物編，日本食品衛生協会，１９９０年，p. 118-126 8 JP2005002512 20050210 WO2005078120 20050825 8 20070316 濱田 光浩 本発明は、簡便で効率的にサルモネラ菌を検出する分析用デバイス、サルモネラ菌の検出方法およびアスコルビン酸又はクエン酸濃度の分析方法に関わる。 腸内細菌科類の中で、サルモネラ菌等の病原性細菌は、食中毒を誘発するなど人間生活に多大な損害を与えるため、幾つかの食品衛生検査指針および検査方法が示されている（例えば、下記非特許文献１及び２を参照）。 上述指針等に従い、菌の検出方法は、通常、ＥＥＭ培地やセレナイト培地でサルモネラ細菌を培養した後、ＤＨＬ（Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｄｅ Ｌａｃｔｏｓｅ）寒天培地またはＳＳ−ＳＢ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｂｒｏｍｃｒｅｓｏｌ ｐｕｒｐｌｅ）寒天培地に細菌を塗抹して分離培養する。腸内細菌のうち、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｔｏｔｅｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）は、これら培地上で硫化水素を産生し、培地に含まれる鉄成分と反応して黒色の硫化第１鉄を生成する。従って、サルモネラの同定のためには、更に、ＴＳＩ寒天培地／ＬＩＭ寒天培地／シモンズのクエン酸培地等に接種して、細菌種をスクリーニングする方法がとられている。 しかしながら、上記の検出方法は、工程が複雑な上に分析に長時間を要し、迅速な対応ができないという問題点があった。 これに対し、ＳＳ寒天培地に白糖を添加した改良培地が市販されているが、サルモネラの分離効率は十分でなく、更に改善の必要があった。 また、定性的な試験方法として、ＥＬＩＳＡ法を応用した検査法が開発されている。例えば、特許文献１では、病原菌に特異的な核酸配列からサルモネラ菌族株を検出する代替法を、特許文献２では、試料中に存在する細菌に対して、光や電磁波等の外因子を与え、細菌の内部に寄生しているバクテリオファージを発現させ、該バクテリオファージにから産生される産生物を検出する方法を、又、特許文献３では、試料導入部から導入された細菌を、該細菌と特異的に結合する抗体を備えた免疫クロマトデバイスに結合させ、しかる後、結合した細菌を培地にて増殖させて検出する方法を提供している。 上記の改良試験方法は、何れも迅速且つ高精度に細菌を検出することを目的としている。しかしながら、これら公知の方法は、未だ細菌の検出方法が複雑であり、より簡便で迅速且つ安価に、腸内細菌を検出するためのデバイス及び方法が要望されていた。 特表２００１−５２１７２１号公報 特開２００２−２７９９９号公報 特開２００１−１８８０６８号公報 厚生省生活衛生局監修：食品衛生検査指針、日本食品衛生協会、東京、１９９０ 厚生省：食鳥処理場におけるＨＡＣＣＰ方式による衛生管理指針について、衛乳第７１号、平成４年３月３０日 本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、既存の細菌検出法の改良により、簡便且つ迅速にサルモネラ菌をスクリーニングするためのデバイスを提供すること、及び、該デバイスを使用してサルモネラ菌を検出する方法を提供することである。また他の目的は、該デバイスを発明するに至った技術的骨子を利用して、アスコルビン酸又はクエン酸濃度を定性的に分析する方法を提供することである。 本発明者らは上記課題を解決するため、サルモネラ菌を含む病原性腸内細菌類をＤＨＬ寒天培地で分離培養し、該ＤＨＬ寒天培地上に、輪切りにした種々の果実類及び野菜類を留置して、該ＤＨＬ寒天培地上に顕在する現象を目視にて観察し、一定の傾向が得られることを見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明者らの知見したところによると、サルモネラ／プロテウス／シトロバクターを含むＤＨＬ寒天培地上に、数時間載置され、ある種の輪切り果実類または野菜類の外周部に、幅数ｍｍ（約４〜５ｍｍ）の硫化鉄の黒色反応帯が出現し、その黒色帯の内部は桃色状に色調変化する現象が見出された。一方で、プロテウスおよびシトロバクターにおいては、上述のような明確な現象が認められなかった。 次に、本発明者らは、上記現象にアスコルビン酸又はクエン酸が主要な役割を果たしていることを確認するために、アスコルビン酸又はクエン酸水溶液を含侵させたろ紙をＤＨＬ寒天培地上に載置し、硫化鉄（ＩＩ）の産生を観察した。その結果、アスコルビン酸又はクエン酸濃度が高いほど、該ろ紙の外周部に明瞭な硫化鉄（ＩＩ）の黒色帯を確認し、基本的には本発明を完成するに至った。 具体的には、サルモネラ菌等の病原性腸内細菌類を含有するＤＨＬ寒天培地上またはＳＳ寒天培地またはＴＳＩ寒天培地等の硫黄源を含有する寒天培地に、アスコルビン酸又はクエン酸濃度が０．１ｇ／Ｌ以上（水溶液１リットル当たりのアスコルビン酸濃度が０．１ｇ以上）のアスコルビン酸又はクエン酸水溶液を含有する担体を載置して、半日以上留置すると、サルモネラ菌が存在する場合は、寒天培地上において、該担体の周辺部に幅４ｍｍ程度の硫化鉄（ＩＩ）の黒色帯が目視にて観察される。しかしながら、プロテウス菌やシトロバクター菌等の場合は、黒色帯の生成が不明暸であり、サルモネラとは明確に区別できる。従って、上記現象を観察するためには、担体の外形寸法は、ＤＨＬ寒天培地の外形寸法より、どの位置においても数ｍｍ以上小さくする必要がある。 ここで、アスコルビン酸又はクエン酸水溶液とは、果汁、野菜汁、水道水、地下水等の天然由来の水または尿、汗，乳等の体液または人工的に合成した人工水や生理緩衝液を溶媒または分散媒として、アスコルビン酸又はクエン酸を含む水溶液を意味する。そして、水溶液中におけるアスコルビン酸又はクエン酸の濃度が、０．１ｇ／Ｌ未満では硫化鉄の黒色帯が明瞭に観察されない。 また、上記担体とは、ろ紙、含侵紙、布、不織紙、無機多孔質体等の有機質または無機質の多孔質体であって、寒天培地の外形寸法より数ｍｍ以上小さい外形寸法と０．１ｍｍ以上の厚みを有するものである。又、その表面全体にわたってほぼ均一にアスコルビン酸又はクエン酸濃度０．１ｇ／Ｌ以上のアスコルビン酸又はクエン酸水溶液を含侵できるもの、又は、レモンや蜜柑等の柑橘類、キウイフルーツ、アセロラ、イチゴ、ピーマン、パプリカであって、アスコルビン酸又はクエン酸を０．１ｇ／Ｌ以上含有する天然物の何れであってもよい。ところで、一般的にアスコルビン酸又はクエン酸は分解されやすので、上記果実または野菜の中で、アスコルビン酸又はクエン酸を安定化させる作用があるレモン等の柑橘類が特に好適に用いられる。 従って、果実または野菜類以外の担体を使用する場合は、ろ紙、含侵紙、布等のアスコルビン酸又はクエン酸水溶液を含む担体が、更にアスコルビン酸又はクエン酸の他に、果実類や野菜類に通常含まれる成分である炭水化物、タンパク質、脂質、灰分、カリウム、カルシウ厶、鉄、マグネシウム等の無機質、ナイアシン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＥ等のビタミン、脂肪酸または植物繊維等のいずれか一種以上を複合的に含んでいてもよい。ここで、水分量は一般的に８５０ｇ／Ｌ以上であることが望ましいが、必ずしも限定されるものでない。 更に、次の発明は、サルモネラ菌を含有するＤＨＬ寒天培地等の硫黄源を含有する寒天培地上に、アスコルビン酸又はクエン酸を必須成分とする水溶液を含有する担体を載置・保持し、寒天培地上で該担体の周辺に形成される硫化鉄（ＩＩ）帯及びその内部に発現する寒天培地の色調変化を画像分析することによって、アスコルビン酸又はクエン酸濃度を定性的に分析する方法を提供する。 すなわち、予めアスコルビン酸又はクエン酸濃度が既知の担体を、サルモネラ菌を含有するＤＨＬ寒天培地等の硫黄源を含有する寒天培地上に載置して、寒天培地上で該担体の外周部に観察される黒色帯および／または該黒色帯の内部に形成される色調変化を画像としたデータベースを構築して標準試料とし、次に、アスコルビン酸又はクエン酸濃度が未知の担体から得られる画像を、上記のデータベースと比較して画像解析を行い、定性的にアスコルビン酸又はクエン酸濃度を分析する。ここで、画像解析は、コンピュータソフトウエアを使用してもよいし、又は、より簡便には目視によってもよく、特に限定されるものではない。 ところで、サルモネラ菌、プロテウス菌及びシトロバクター菌は、硫黄源が豊富なＤＨＬ寒天培地またはＳＳ寒天培地またはＳＳ−ＳＢ寒天培地またはＴＳＩ寒天培地において、硫化水素（Ｈ２Ｓ）を産生し、硫化水素と該寒天培地に含まれる鉄イオンとが反応して、硫化鉄（ＩＩ）が作られる。そして、寒天培地上においてアスコルビン酸又はクエン酸を含む担体の外周部に明暸に硫化鉄（ＩＩ）の黒色帯が形成されると共に、その内部の寒天培地色が桃変化する機構については、アスコルビン酸又はクエン酸の還元作用が、何らかの影響を及ぼしていると考えられる。 本発明により、簡便且つ迅速にサルモネラ菌をスクリーニングするためのデバイス、及び、サルモネラ菌の検出方法を提供することが可能となる。このため、食品工業、病院、給食サービス業、食料品店および一般家庭において、食料中におけるサルモネラ菌の存在可否を容易に分析でき、食品衛生管理が格段に向上する。また、アスコルビン酸又はクエン酸濃度を定性的ではあるが、迅速に分析する方法も提供できるため、食品中のアスコルビン酸又はクエン酸濃度を安価に確認でき、品質管理に有用である。 サルモネラ菌、プロテウス菌およびシトロバクター菌を含むＤＨＬ寒天培地と、輪切りレモンの反応により発現する、硫化鉄（ＩＩ）および寒天培地の色調変化を示す図である。 サルモネラ菌を含むＤＨＬ寒天培地およびＳＳ寒天培地と、輪切りレモンとの反応により発現する、硫化鉄（ＩＩ）および寒天培地の色調変化を示す図である。 サルモネラ菌を含むＤＨＬ寒天培地と、各種果実および野菜類との反応により発現する、硫化鉄（ＩＩ）および寒天培地の色調変化を示す図である。 サルモネラ菌を含むＤＨＬ寒天培地と、種々の濃度のアスコルビン酸を含むろ紙との反応により発現する、硫化鉄（ＩＩ）および寒天培地の色調変化を示す図である。 以下に、本発明の実施形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。 ＜実施例１：サルモネラ菌の同定＞ 硫酸源を含有する寒天培地として、ＤＨＬ寒天培地（栄研化学社製）を使用し、該ＤＨＬ寒天培地上で培養した細菌のうち、硫化鉄（ＩＩ）を生成した細菌（サルモネラ菌、プロテウス菌、シトロバクター菌）を、綿棒でＤＨＬ寒天培地上に直接塗抹または生理食塩水に懸濁後塗抹した。そして、該ＤＨＬ寒天培地上に、輪切りしたレモン（アスコルビン酸濃度０．４ｇ／Ｌ）を載置し、３５℃で１８時間留置した。その後、寒天培地上で担体外周部に発現する硫化鉄（ＩＩ）の状態を目視にて観察した。 結果を図１に示した。サルモネラ菌が存在する場合は、担体外周部に、幅４〜５ｍｍの硫化鉄（ＩＩ）の黒色帯が明瞭に観察された。一方、プロテウス菌およびシトロバクター菌の場合には、黒色帯が明瞭でなく不定であった。又、黒色帯の内部はほぼ均一に桃色に変化していた。 ＜実施例２：硫黄源を含む寒天培地の比較＞ 硫化鉄（ＩＩ）の発現および寒天培地色の桃変化現象が、硫黄源を含む他の寒天培地でも生じるか調べるため、ＤＨＬ寒天培地とＳＳ寒天培地（何れも栄研化学社製）とを比較した。これらの寒天培地は上記と同様の手法でサルモネラ菌を接種し、又、アスコルビン酸含有担体として、レモンを輪切りしたもの（アスコルビン酸濃度０．４ｇ／Ｌ）を用いた。 結果を図２に示した。何れの寒天培地においても、硫化鉄（ＩＩ）の発現および寒天培地色の桃変化現象は明暸に認められた。 ＜実施例３：アスコルビン酸水溶液含有担体の比較＞ 上記のようにレモンの効果は明らかとなったので、レモン以外の種々のアスコルビン酸濃度を有する下記の市販の生果実および生野菜を輪切りしたもので、アスコルビン酸濃度が明らかなものを用いてサルモネラ菌の同定が可能か否かを比較した。すなわち、キウイフルーツ（０．３ｇ／Ｌ）、アセロラ（２．０ｇ／Ｌ）、グアバ（１．０ｇ／Ｌ）、イチゴ（０．３ｇ／Ｌ）、パプリカ（０．５ｇ／Ｌ）、煎茶葉（０．６ｇ／Ｌ）、ブロッコリー（０．４ｇ／Ｌ）、カリフラワー（０．２ｇ／Ｌ）及びアスコルビン酸濃度の低い青リンゴ（０．０２ｇ／Ｌ）を輪切りしたものであって、輪切り断面が寒天培地の外形寸法より５ｍｍ以上小さなものを使用した。 結果を図３に示した。硫化鉄（ＩＩ）の発現および寒天培地色が桃色状に変化する現象は、レモンを使用した場合に最も明瞭なパターンとなり、次いでキウイフルーツ、イチゴ、アセロラ、パプリカの順であり、グアバ、ブロッコリー、カリフラワー、青リンゴではあまり明暸なパターンが得られず、茶葉は最も不鮮明であった。このように、黒色帯パターンの明瞭さは、アスコルビン酸濃度の他に、アスコルビン酸の分布状態およびアスコルビン酸の安定度によって異なり、ＤＨＬ寒天培地上でアスコルビン酸が安定なレモンやキウイフルーツほど、明瞭なパターンが得られる傾向があった。＜実施例４：アスコルビン酸の定性分析＞ アスコルビン酸を含有する担体として、直径２０ｍｍのろ紙に、０ｍｏｌ／Ｌ（ｃｏｎｔｒｏｌ），０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ、１．５ｍｏｌ／Ｌのアスコルビン酸水溶液５０μＬを含侵させた後、２４時間乾燥させたものを用いた。 次に、サルモネラ菌同定用キットを用い、サルモネラＢＧ１と同定された細菌を、生理食塩水に懸濁後、滅菌綿棒でＤＨＬ寒天培地に塗抹し、更に、その上に上述のアスコルビン酸含有担体を載置し、３８℃で２４時間留置した。 結果を図４に示した。アスコルビン酸濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の場合に、硫化鉄（ＩＩ）の黒色帯が観察され、濃度が増加するほど、明瞭なパターンが観察された。これにより、本発明のデバイスを用いて、食品、健康食品、医薬品、飼料等に含まれるアスコルビン酸量を、簡便に定性分析可能であることが証明された。ここで、サルモネラ菌を同定する場合とアスコルビン酸濃度を定性分析する場合とでは、アスコルビン酸濃度に１００倍以上の乖離があるが、これは本実験においては、担体に含侵させたアスコルビン酸が乾燥状態にあることが影響していると考えられる。 上記と同様の方法で、チフス菌と輪切りレモンを用いて、黒色帯の形成状態を試験したところ、黒色帯は形成されなかった。これより、本発明のデバイスを用いてサルモネラ菌とチフス菌を区別できることが明確になった。 硫黄源を含有する寒天培地と、アスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）又はクエン酸水溶液を含有する担体とで構成されることを特徴とする、サルモネラ菌検出用デバイスであって、 水溶液中におけるアスコルビン酸又はクエン酸濃度が０．１ｇ／l（リットル）以上であることを特徴とするサルモネラ菌検出用デバイス。 前記硫黄源を含有する寒天培地が、ＤＨＬ寒天培地またはＳＳ寒天培地またはＳＳ−ＳＢ寒天培地またはＴＳＩ寒天培地の何れかであることを特徴とする、請求項１に記載のサルモネラ菌検出用デバイス。 前記担体が、アスコルビン酸又はクエン酸の他に、炭水化物、タンパク質、脂質、灰分、無機質、ビタミン、脂肪酸のいずれか一種以上を含む水溶液を含有することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のサルモネラ菌検出用デバイス。 前記担体が、ろ紙、含侵紙、布、不織布または多孔質無機物であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のサルモネラ菌検出用デバイス。 前記担体の形状が、略円形状であることを特徴とする請求項４に記載のサルモネラ菌検出用デバイス。 前記担体が、柑橘類、アセロラ、キウイフルーツ、イチゴ、ピーマン、パプリカのいずれかを輪切りしたものであることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載のサルモネラ菌検出用デバイス。 請求項１〜請求項６のいずれかに記載のサルモネラ菌検出用デバイスを使用して、寒天培地上における硫化鉄（II）の発現状態、及び／又は寒天培地の色調変化を解析することによりサルモネラ菌を検出する方法。 サルモネラ菌を含み且つ硫黄源を含有する寒天培地上に、アスコルビン酸又はクエン酸水溶液を含有する担体を載置・保持し、該寒天培地上に形成される硫化鉄（II）及び該硫化鉄（II）の黒色帯の色調変化を画像分析することによってアスコルビン酸又はクエン酸濃度を分析する方法。