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| タイトル： | 特許公報(B2)_メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤及びその製造方法 |
| 出願番号： | 2005505980 |
| 年次： | 2011 |
| IPC分類： | A61K 31/714,A61K 9/19,A61K 47/10,A61K 47/24,C07H 23/00,A61P 21/00 |
特許情報キャッシュ
加藤 晃良 野村 晃子 JP 4753717 特許公報(B2) 20110603 2005505980 20040506 メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤及びその製造方法 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 506137147 稲葉 良幸 100079108 田中 克郎 100080953 大賀 眞司 100093861 大貫 敏史 100109346 加藤 晃良 野村 晃子 JP 2003129251 20030507 20110824 A61K 31/714 20060101AFI20110804BHJP A61K 9/19 20060101ALI20110804BHJP A61K 47/10 20060101ALI20110804BHJP A61K 47/24 20060101ALI20110804BHJP C07H 23/00 20060101ALI20110804BHJP A61P 21/00 20060101ALI20110804BHJP JPA61K31/714A61K9/19A61K47/10A61K47/24C07H23/00A61P21/00 A61K 31/714 A61K 9/19 A61K 47/10 A61K 47/24 A61P 21/00 C07H 23/00 CAplus/REGISTRY(STN) 特開昭５５−１１３７２１（ＪＰ，Ａ） 特表平１１−５０７９４５（ＪＰ，Ａ） AIChE Journal，２００２年，Vol.48, No.6，p.1140-1144 Pharmaceutical Sciences，１９９７年，Vol.3, No.1，p.3-8 Pharmaceutical Research，２００３年 ４月，Vol.20, No.4，p.660-667 20 JP2004005973 20040506 WO2004098614 20041118 19 20051116 瀬下 浩一 本発明は、筋萎縮性側索硬化症治療剤としてのメチルコバラミンを含有する、高濃度注射用の凍結乾燥製剤及びその製造方法に関する。 筋萎縮性側索硬化症は、脳幹・脊髄・運動ニューロンの病変を主体とし、球症状、上位運動ニューロン障害、下位運動ニューロン障害が進行する疾患であり、ＡＬＳ（ａｍｙｏｔｏｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）とも呼称され、「脊髄及び大脳の運動神経細胞が変性、消失するため、臨床的には全身の筋萎縮、痙性を招来し、通常、２〜３年で呼吸筋の麻痺により死亡する」、いわゆる難病の一種である。 筋萎縮性側索硬化症はその原因が解明されておらず、その根本治療法はもちろんのこと、その進行の抑止若しくは進行の遅延すら、有効に行う治療法さえも未だに見出されていないのが現状であった。 近年、梶は、ヒトの抹消神経障害の治療に有効なメチルコバラミンを多量に投与すると（たとえば、メチルコバラミン１５〜５０ｍｇ／１日１回筋注）、筋萎縮性側索硬化症患者において、用量依存的に自覚的な筋力上昇やその他覚的指標である筋複合活動電位の振幅の有意な増加が観測された。そして、従来の治療剤によっては得られたことのない顕著な治療効果が得られることを発見し、メチルコバラミンを有効成分とする筋萎縮性側索硬化症治療剤として、メチルコバラミン高濃度製剤用の水性注射剤が提案されている（たとえば、特許文献１参照）。 なお、ヒトの抹消神経障害の治療におけるメチルコバラミンの投与量は、通例、０．５〜１．５ｍｇ／１日である。 しかしながら、かかる水性注射剤は、エタノール、生理食塩水又は緩衝液に溶解させた、１５〜５０ｍｌ／アンプルのメチルコバラミン溶液であるために、光安定性や保存安定性の確保は困難であり、さらに無菌性の保証が困難であるという問題点が指摘されていた。 一方、ビタミン剤の一種であるメチルコバラミンを薬効成分として含有する注射用凍結乾燥製剤は、種々の必須ビタミンを含有する総合ビタミン注射製剤に関して、主に検討が進められてきた。これらの総合ビタミン製剤の場合には、凍結乾燥製剤とする際に、保存中の安定性の確保や再溶解後の溶解状態の改善について課題が多いことが知られている（たとえば、特許文献２ないし４参照）。：特開平１０−２１８７７５号：特開昭６２−３８号：特開昭６３−３１３７号：特開平１−１３２５１４号 そこで、本発明は、上記事情に鑑み、経時的な安定性に優れる、メチルコバラミンの高濃度療法に使用可能である、メチルコバラミンの高含有量を含む凍結乾燥製剤を提供することを、第一の目的とする。 また、本発明は、メチルコバラミンが凍結乾燥固体中で安定に存在する、メチルコバラミンを含む凍結乾燥製剤の製造方法を提供することを、第二の目的とする。 本発明者らは、上記目的を達成するため、鋭意研究した結果、メチルコバラミンは結晶質の凍結乾燥固体中で存在するよりも、非晶質の凍結乾燥固体中で安定であることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明の第一の態様では、上記第一の目的は、メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と、賦形剤と、を含む凍結乾燥製剤であって、前記賦形剤のうち少なくとも１種類以上が非晶質状態である凍結乾燥製剤により達成される。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩がさらに非晶質状態であることを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、非晶質状態である前記賦形剤が糖類を含むことを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥性製剤の好ましい態様によれば、前記賦形剤が糖アルコールをさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記凍結乾燥製剤がｐＨ調整剤をさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記凍結乾燥製剤が酸化防止剤をさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記賦形剤が糖類及び糖アルコールを含む場合、糖類と糖アルコール類の合計重量に対して、非晶質状態である前記賦形剤を少なくとも２０重量％含有することを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記糖類はスクロース又はラクトースであることを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記糖アルコールはマンニトールであることを特徴とする。 また、本発明の第二の態様では、上記第一の目的は、メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と、賦形剤とを含み、（ａ）前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と前記賦形剤とを、溶媒に溶解させる工程と、（ｂ）前記賦形剤のうち少なくとも１種類以上の非晶質状態が生じるように、前記溶液を凍結乾燥させる工程と、を備える製造方法により得られる凍結乾燥製剤により達成される。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記工程（ｂ）において、前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩の非晶質状態をさらに生ずるように凍結乾燥させることを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記工程（ｂ）において、前記賦形剤の結晶化が起こらない温度以下で予備凍結を行うことを特徴とする。特に、凍結乾燥させる際の予備凍結は、前記賦形剤の共晶点以下の温度であることが好ましい。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、非晶質状態である前記賦形剤が糖類を含むことを特徴とする。 本発明の好ましい態様によれば、前記凍結乾燥製剤において、前記賦形剤が糖アルコールをさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記工程（ａ）において、ｐＨ調整剤をさらに溶解させることを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記工程（ａ）において、酸化防止剤をさらに溶解させることを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記賦形剤が糖類及び糖アルコールを含む場合、糖類と糖アルコール類の合計重量に対して、非晶質状態である前記賦形剤を少なくとも２０重量％含有することを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記糖類はスクロース又はラクトースであることを特徴とする。 本発明による前記凍結乾燥製剤の好ましい態様によれば、前記糖アルコールはマンニトールであることを特徴とする。 さらに、本発明の第三に態様では、上記第二の目的は、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の製造方法であって、（１）前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と前記賦形剤とを、溶媒に溶解させる工程と、（２）前記賦形剤のうち少なくとも１種類以上の非晶質状態が少なくとも生じるように、前記溶液を凍結乾燥させる工程と、を備える製造方法により達成される。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記工程（２）において、前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩の非晶質状態がさらに生じるように凍結乾燥させることを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記工程（２）において、前記賦形剤の結晶化が起こらない温度以下で予備凍結を行うことを特徴とする。特に、凍結乾燥させる際の予備凍結は、前記賦形剤の共晶点以下の温度であることが好ましい。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、非晶質状態である前記賦形剤が糖類を含むことを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記賦形剤が糖アルコールをさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記凍結乾燥製剤がｐＨ調整剤をさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記凍結乾燥製剤が酸化防止剤をさらに含むことを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記賦形剤は糖類及び糖アルコール類を含む場合、糖類及び糖アルコール類の合計重量に対して、非晶質状態である前記賦形剤を少なくとも２０重量％含有することを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記糖類はスクロース又はラクトースであることを特徴とする。 本発明による前記製造方法の好ましい態様によれば、前記糖アルコールはマンニトールであることを特徴とする。 本発明によれば、経時安定性に優れた、メチルコバラミンを含む凍結乾燥製剤を提供することができる。また、本発明の製造方法によれば、メチルコバラミンが凍結乾燥固体中で安定に存在することが可能である、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の製造方法を提供することができる。 以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。 本発明は、メチルコバラミン高濃度療法に使用可能なメチルコバラミン高含量凍結乾燥製剤を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明する。 本発明に利用されるメチルコバラミンは、血液・髄液中存在型の補酵素型ビタミンＢ１２である。他のＢ１２同属体と比較して神経組織への移行性に優れており、糖尿病性神経障害、多発性神経炎などの抹消性神経障害、特に、しびれ、痛み、麻痺の予防・治療・改善やビタミンＢ１２欠乏による巨赤芽球性貧血に用いられることが知られている。 メチルコバラミンはビタミンＢ１２類似物質であり、この物質はビタミンＢ１２（シアノコバラミン）のコバルトに結合しているシアノ基がメチル基に置換した化合物であって、その化学式はＣ６３Ｈ９１ＣｏＮ１３Ｏ１４Ｐであり、分子量は１３４４．４の赤色粉末である（下記式（Ｉ）を参照）。 本発明に利用するメチルコバラミンは、たとえば、特公昭４５−３８０５９号公報に記載された方法により、シアノコバラミン（上記式（ＩＩ））からの還元反応とそれに続くメチル化反応を経て製造可能である。また、市販の医薬品グレードのメチルコバラミン原薬を用いることもできる。たとえば、シグマ社やエーザイ（株）等から市販されている。さらに、本発明においては、メチルコバラミンの薬理学的に許容し得る塩を用いることもできる。さらにまた、前記メチルコバラミンは光学活性体あるいはラセミ体であってもよい。 上記薬理学的に許容し得る塩としては、通常、酸との塩、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機塩、また、たとえば、トリフルオロ酢酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 本発明に係る凍結乾燥製剤は、前述のメチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩の高含量を有効成分として含む。ここで、本発明で用いる用語「高含量」とは、１バイアル中、通常、５〜２００ｍｇ、好ましくは１０〜１００ｍｇ、さらに好ましくは２５〜５０ｍｇ含有するものをいい、用時溶解させたときの濃度は、１バイアル中に、通常、５〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜２５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍｌであるものをいう。 本発明に係る凍結乾燥製剤は、メチルコバラミンと賦形剤とを少なくとも含むが、その配合割合は、重量比でメチルコバラミン１に対して、賦形剤は、０〜５０であり、好ましくは２．５〜２５であり、さらに好ましくは５〜１０である。 本発明に用いられる賦形剤は、糖類、糖アルコール類やアミノ酸類から選択され得る。後述するように凍結乾燥時に非晶質状態が生じる糖類を少なくとも１種類以上含有すればよい。凍結乾燥時に非晶質状態が生じる糖類としては、以下のものに限定されるわけではないが、例えば、単糖類としては、グルコース、フルクトース等を、二糖類としては、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等を挙げることができる。凍結乾燥時に非晶質状態が生じる糖アルコールの具体例としては、以下のものに限定されるわけではないが、イノシトール、ソルビット等を挙げることができる。とりわけ、凍結乾燥時に非晶質状態が生じる賦形剤としては、ラクトースやスクロースが好ましい。 本発明において利用される賦形剤が糖類及び糖アルコールから構成される場合には、後述する製造方法により製造された凍結乾燥製剤の保存安定性の観点から、糖類と糖アルコール類の合計重量に対して、非晶質状態である賦形剤を少なくとも２０重量％含有することが好ましく、より好ましくは４０重量％含有し、さらに好ましくは５０重量％含有する。 また、本発明に係る凍結乾燥製剤に利用されるアミン酸類としては、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン等を挙げることができる。さらに、これらのアミノ酸を単独でも組み合わせて用いてもよい。 さらにまた、本発明に係る凍結乾燥製剤は、ｐＨ調整剤をさらに含むことができる。ｐＨ調整剤は、医薬製剤において一般的に使用されているものを用いることができる。ｐＨ調整剤としては、無機酸、無機塩基、有機酸、有機塩基、緩衝剤を挙げることができる。具体的には、塩酸、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸２水素ナトリウムグリジン、リン酸、リン酸２水素ナトリウム、リン酸１水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、メグルミン等を挙げることができる。 くわえて、本発明に係る凍結乾燥製剤は、酸化防止剤をさらに含むことができる。酸化防止剤としては、医薬製剤において、通常使用されるものであればよく、具体的な例としては、亜硝酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、トコフェノール、酢酸トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、天然ビタミンＥ、亜硫酸水素ナトリウム、アルファチオグリセリン、塩酸システイン、チオグリコール酸ナトリウム等を挙げることができる。 本発明に係る凍結乾燥製剤の溶解度を上げるため、もしくは注射剤としての浸透圧を調製するために各種添加剤を添加することもできる。これらの添加剤は製剤の添加剤として通常使用されている物質の添加量であれば特に制限はなく、例えば下記のような添加剤を、必要に応じて添加してもよい。 本発明に係る凍結乾燥製剤の溶解度を上昇させるために、又は溶解速度を上昇させるために、溶解補助剤としてポリエチレングリコール、グリセリンなどが挙げられ、また界面活性剤としてポリソルベート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレン硬化ヒマシ油、セスキオレイン酸ソルビタンなどが挙げられる。また、本発明に係る凍結乾燥製剤の浸透圧調整剤としては、ブドウ糖、キシリトール、ソルビトールなどが挙げられる。 その他、医薬製剤に使用しうる防腐剤、安定化剤等の添加物も、必要に応じて添加することができる。具体的には、安息香酸、アスコルビン酸等を挙げることができ、当業者に利用可能な添加物の量を添加することができる。 次に、本発明に係る凍結乾燥製剤の製造方法について述べる。本発明に係る凍結乾燥製剤は、たとえば、メチルコバラミンと、賦形剤とを、さらにはｐＨ調整剤とを、水又は適当な水性溶媒（たとえば、水とアルコールの混合物）に溶かした溶液を、所望によりメンブレンフィルタなどを用いて濾過滅菌を行う。次いで、無菌溶液をバイアル、トレーなどに分注し、通常の凍結乾燥することによって固体状としたものが好ましい。濾過滅菌を採用すると、加熱滅菌に由来する分解物の産出を抑えることができ、不純物の少ない製剤を得ることができる。 前述のように製造された、本発明に係る凍結乾燥製剤は、メチルコバラミンの分解、変質等を長期間抑制し、安定に保つことが可能となる。 前述の溶液を調製する場合、公知の方法にしたがって、メチルコバラミン、賦形剤及びｐＨ調整剤を、水又は水性溶媒（たとえば、水とアルコールの混合物）に溶解すればよい。溶解させる順序は、成分の種類には関係なく溶解させることができる。水性液中のメチルコバラミンの濃度は、通常、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは、２．５ｍｇ／ｍｌ〜７．５ｍｇ／ｍｌである。また、賦形剤の濃度は、通常、０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１２．５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。 また、水性液のｐＨは、４〜８であることが好ましい。より好ましくは、ｐＨが６〜８であり、さらに好ましくは、ｐＨが６．５〜７．５である。前述のｐＨ調整剤を適宜添加することにより、所望のｐＨに調整可能である。 このように調製された水性液を、好ましくは共晶点以下で予備凍結した後、乾燥庫内を真空に保持しながら、棚温を徐々に１次乾燥温度まで昇温し、同温度で１次乾燥を実行する。１次乾燥終了後、さらに棚温を２次乾燥温度に到達するまで昇温し、同温度で２次乾燥を行う。１次乾燥と２次乾燥は同温度であってもかまわない。 具体的な凍結乾燥製剤の製造方法として、所定の濃度のメチルコバラミンと賦形剤とを含有する溶液を滅菌後、所定量をバイアル瓶に分注する。約−６０℃〜−２０℃の条件で予備凍結を行い、次いで、約−２０〜１０℃で減圧下に１次乾燥を行い、約１５〜４０℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して凍結乾燥製剤を得る。なお、予備凍結時には、賦形剤としてのマンニトール等の結晶化が起こらないように、共晶点以上の温度にならないような低温に維持する必要がある。 共晶点は賦形剤を構成する成分の混合割合により異なるが、通常、糖類及び糖アルコールを含む場合、たとえば、１）スクロース（ショ糖）及び／又はラクトース（乳糖）と、２）マンニトールをさらに含む場合は、予備凍結の温度条件は、通常、−４０℃以下の温度で実行することが好ましい。また、賦形剤としてマンニトールのみを含有する場合、さらに好ましい予備凍結の温度条件は、−１０℃以下である。 このようにして得られる本発明に係る凍結乾燥製剤は、少なくとも賦形剤が非晶質状態で存在する場合、メチルコバラミンを長期間安定に保つことができる。 本発明に係る凍結乾燥製剤は、任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって極めて容易に再溶解し、凍結乾燥前の溶液を再構築することができる。かかる再溶解液としては、用時注射用蒸留水、生理食塩水、その他一般的輸液（たとえば、ブドウ糖、アミノ酸輸液など）が挙げられる。 本発明に係る凍結乾燥製剤を再溶解させた溶液は、静脈注射剤、皮下注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの注射剤又は点眼剤として、非経口投与することができる。この注射用蒸留水又は輸液で溶解した液は十分に安定である。この場合、溶解液中のメチルコバラミンの濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌである。賦形剤の濃度は、０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１２．５ｍｇ／ｍｌから７５ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。 本発明に係る凍結乾燥製剤の特徴について説明する。本発明における安定性とは、化学的及び物理的な安定性を意味する。加温条件下での保存における経時的分解により、主成分であるメチルコバラミンの残存量が減少し、製剤としての凍結乾燥製剤の外観に顕著な着色が見られる。顕著な着色分解が観測された製剤の使用は、溶解時に濁り、沈殿が生じる蓋然性が高いため好ましくはないが、一般的には、残存量が安定性の指標となる。 本発明では、残存率は次のように定義される。メチルコバラミンを含む凍結乾燥製剤をバイアルに密閉し、５℃〜４０℃の範囲から選ばれた温度雰囲気下に保存する。一定温度で一定期間保存した後、主成分であるメチルコバラミンについて、高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」という。）により、その濃度をメチルコバラミンに対応するピーク面積から算出する。そして、ＨＰＬＣによる保存開始時のメチルコバラミンのピーク面積と、所定の期間保存後のメチルコバラミンのピーク面積とから、後述する実施例にて定義される式から、残存率を見積もることができる。 本発明に係る凍結乾燥製剤は、室温で少なくとも２年間保存した場合の残存率が９５％以上であることが望ましい。また、４０℃で６ヶ月間保存した場合においても、残存率が９５％以上であることがより望ましい。 本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の記載に基づき、種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に包含される。 製造例１本発明に係る凍結乾燥製剤の製造法としての一の実施態様として、スクロースとマンニトールとの混合物からなる賦形剤を、後述するような混合割合に基づく、メチルコバラミンとともに仕込み液を調製し、下記の凍結乾燥法により製造した。 メチルコバラミン（商品名メチコバール：エーザイ（株）製）０．５％（ｗ／ｖ）と、賦形剤混合物２．５％（ｗ／ｖ）を混合した仕込み液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに正確な量で充填し、凍結乾燥に供した。凍結乾燥後、完全に打栓し、本発明に係るメチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を製造した。 具体的には、図１中に示すスクロースとマンニトールとの混合比になる量を、１００ｍｌビーカに入れ、８０ｍｌの注射用蒸留水を加えて、マグネティックスターラで攪拌溶解させた。前記賦形剤が十分に溶解したことを確認した後、５００ｍｇのメチルコバラミンを添加して攪拌し、十分に溶解したことを確認した後、１００ｍｌメスフラスコにて全体の溶液量を１００ｍｌになるように蒸留水を添加した。 その後、前述の溶液を１８ｍｌバイアルに５ｍｌずつ充填し、予備凍結−５５℃、３時間、１次乾燥−１０℃、２４時間（０．１ｍｂａｒ）、２次乾燥２５℃、３６時間（０．０２ｍｂａｒ）で凍結乾燥を行い、実施例１〜５として、本発明に係る凍結乾燥製剤を得た。 なお、比較例１として、図１に示すマンニトールのみを賦形剤として含有する凍結乾燥製剤の調製も同様な方法により行った。 製造例２メチルコバラミン（商品名メチコバール：エーザイ（株）製）０．５％（ｗ／ｖ）と、賦形剤混合物５．０％（ｗ／ｖ）とを混合した仕込み液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに正確な量で充填し、凍結乾燥に供した。凍結乾燥後、完全に打栓し、本発明に係るメチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を製造した。 具体的には、図２中に示すスクロースとマンニトールとの混合比になる量を、１００ｍｌビーカに入れ、８０ｍｌの注射用蒸留水を加えて、マグネティックスターラで攪拌溶解させた。前記賦形剤が十分に溶解したことを確認した後、５００ｍｇのメチルコバラミンを添加して攪拌し、十分に溶解したことを確認した後、１００ｍｌメスフラスコにて全体の溶液量を１００ｍｌになるように蒸留水を添加した。 その後、前述の溶液を１８ｍｌバイアルに５ｍｌずつ充填し、予備凍結−５５℃、３時間、１次乾燥−１０℃、２４時間（０．１ｍｂａｒ）、２次乾燥２５℃、３６時間（０．０２ｍｂａｒ）で凍結乾燥を行い、実施例６〜１０として、本発明に係る凍結乾燥製剤を得た。 なお、比較例２として、図２に示すマンニトールのみを賦形剤として含有する凍結乾燥製剤の調製も同様な方法により行った。 製造例３次に、賦形剤として、ラクトースとマンニトールとの混合物を、図３に示す混合割合に基づいて、製造例１に記載した方法（スクロースとマンニトールの代わりに、ラクトースとマンニトールを使用する）に準じてメチルコバラミンとともに仕込み液を調製し、製造例１と同様の条件にて、凍結乾燥製剤を製造した（実施例１１及び１２）。 なお、比較例３として、図３に示すマンニトールのみを賦形剤として含有する凍結乾燥製剤の調製も同様な方法により行った。 製造例４賦形剤として、ラクトースとマンニトールとの混合物を、図４に示す混合割合に基づいて、製造例１に記載した方法（スクロースとマンニトールの代わりに、ラクトースとマンニトールを使用する）に準じてメチルコバラミンとともに仕込み液を調製し、製造例１と同様の条件にて、凍結乾燥製剤を製造した（実施例１３及び１４）。 なお、比較例４として、図４に示すマンニトールのみを賦形剤として含有する凍結乾燥製剤の調製も同様な方法により行った。 製造例５１００ｍｌビーカにスクロース１２．５ｇを量りとり、予め用意しておいたｐＨ７．０の１ｍＭリン酸緩衝液８０ｍｌに溶解させた。前記スクロースが十分に溶解したことを確認した後、０．５ｇのメチルコバラミンを前記緩衝液にさらに添加し、溶解確認後、１００ｍｌメスフラスコで、蒸留水にて１００ｍｌに調液した。このように調製された溶液を１５ｍｌバイアルに５ｍｌずつ充填し、製造例１と同条件にて凍結乾燥させて、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を得た（実施例１５）。 製造例６１０００ｍｌのビーカにラクトース２５ｇを量りとり、８００ｍｌの注射用水で溶解させる。これに、０．６９ｇのリン酸２水素ナトリウム１水和物を加え、十分に攪拌させた。前記ラクトース及びリン酸２水素１ナトリウムが十分に溶解したことを確認した後、５ｇのメチルコバラミンを添加し、計量した容器に残ったメチルコバラミン注射用水で洗い込んだ。そして溶解確認後、予め用意しておいた０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を適宜添加し、ｐＨを７．０に調整した。１０００ｍｌメスシリンダーで、蒸留水にて１０００ｍｌに調液した。このように調製された溶液１５ｍｌバイアルに５ｍｌずつ充填し、製造例１と同条件にて凍結乾燥させて、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を得た（実施例１６）。 製造例７１００ｍｌビーカにラクトース１２．５ｇを量りとり、酸化剤としてのクエン酸１水和物１ｇと８０ｍｌの注射用水を加えて攪拌した。前記ラクトースとクエン酸が十分に溶解したことを確認した後、０．５ｇのメチルコバラミンをさらに添加した。溶解確認後、予め用意しておいた０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００ｍｌメスフラスコで、蒸留水にて１００ｍｌの調液した。このように調製された溶液を１５ｍｌバイアルに５ｍｌずつ充填し、製造例１と同条件にて凍結乾燥させて、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を得た（実施例１７）。 製造例８１００ｍｌの各ビーカに、スクロースと、ラクトースとを、それぞれ、１２．５ｇを量りとり、予め用意しておいたｐＨ７．０の１ｍＭリン酸緩衝液８０ｍｌで溶解させた。溶解確認後０．５ｇのメチルコバラミンを各々の溶液に加え、さらに攪拌溶解し、溶解確認後１００ｍｌメスフラスコで、蒸留水にて１００ｍｌに調液した。このように調製された各溶液を１５ｍｌバイアルに５ｍｌずつ充填し、予備凍結−５５℃、３時間、１次乾燥−１０℃、２４時間（０．１ｍｂａｒ）、二次乾燥２５℃、３６時間（０．００２ｍｂａｒ）の製造条件で凍結乾燥させて、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を得た（それぞれ、実施例１８と、実施例１９とする）。 ［保存安定性の評価］メチルコバラミンの残存量に基づく、保存安定性の評価を以下のように行った。すなわち、前述の製造例に基づいて無菌的に調製したメチルコバラミン含有凍結乾燥製剤を、５℃、２５℃及び４０℃の恒温槽で１ヶ月間保存した。保存凍結乾燥製剤をＨＰＬＣ測定時の移動相で溶解し、２５ｍｌのメスフラスコを用いて調液した。この検体を用いて、下記の試験方法によりメチルコバラミン含有量（残存率）を測定し、メチルコバラミンの保存安定性を評価した。 ＨＰＬＣ分析は、下記の条件でメチルコバラミン含有量を測定した。ＨＰＬＣ条件カラム：ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８，Ｓ−５μｍ，２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．移動相：アセトニトリル／０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）／１−ヘキサンスルホン酸ナトリウム（２／８／３．８，ｖ／ｖ／ｗ）ＨＰＬＣ分析条件１）カラム温度 ４０℃、２）サンプル温度 ８℃、３）流量 １ｍＬ／ｍｉｎ４）検出器 紫外線吸光光度計（測定波長：２６６ｎｍ） メチルコバラミンの残存率は、該メチルコバラミンに対応するピーク面積から算出した。ＨＰＬＣによる保存開始前のメチルコバラミンのピーク面積と、保存後のメチルコバラミンのピーク面積との相対面積比から、前記残存率を以下のように求めた。 残存率（％）＝｛（保存後のメチルコバラミンのピーク面積）／（保存後の全ピーク面積）／｛（保存前のメチルコバラミンのピーク面積）／（保存前の全ピーク面積）｝ｘ１００ ここで、全ピーク面積とは、ＨＰＬＣ測定による全てのピークの総和面積をいう。かかる測定方法により得られた、製造例１〜４の残存率の結果を、図５〜図８に、それぞれ示す。 また、各実施例および各比較例を、４０℃の恒温槽で１ヶ月間および／または３ヶ月保存した場合の、メチルコバラミンの残存率（％）の結果を、図９〜図１２に示す。 ［粉末Ｘ線回折］製造例１で得られた各メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の粉末Ｘ線回折を行い、保存前の製剤と、５℃、２５℃、４０℃の恒温層での１ヶ月保存製剤について、該製剤の結晶状態を、下記の条件で観測した。 粉末Ｘ線回折の測定条件を以下に示す。Ｘ線：Ｃｕ Ｋ−ａｌｐｈａ１／３０ｋＶ／４０ｍＡゴニオメータ：ＲＩＮＴ２０００縦型ゴニオメータフィルタ：Ｋβフィルタ発散スリット：１／２ｄｅｇ散乱スリット：１／２ｄｅｇ受光スリット：０．１５ｍｍ走査スピード：連続スキャンスピード：２°／ｍｉｎスキャンステップ：０．０２°走査軸：２θ／θ走査範囲：５〜４０°オフセット：０°固定角：０° 図１３は、製造例１の保存前の製剤の代表的なＸ線回折パターンの結果を示す。なお、図１３中の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、製造例１の実施例１、実施例３〜５及び比較例１についてのＸ線回折パターンを示し、各保存条件における保存前後において、Ｘ線回折パターンの変化は認められなかった。 図５及び図６の結果から明らかなように、メチルコバラミンに対する賦形剤混合物の添加量にかかわらず、賦形剤混合物であるスクロース／マンニトール中の存在するスクロースの混合割合が２０％以上である場合、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤中のメチルコバラミンの残存率が非常に高く、メチルコバラミンの保存安定性が優れることが判明した。 一方、図１３に示すＸ線回折の結果から、メチルコバラミン及びスクロースからなる実施例１の（ａ）では、粉末Ｘ線回折ピークはほとんど存在せず、凍結乾燥製剤に対するメチルコバラミンの含有量に鑑みれば、スクロースが非晶質状態で存在していることが分かった。そして、賦形剤混合物中のマンニトールの割合の増加とともに、マンニトールに由来する回折ピークが出現する。 したがって、残存率及びＸ線回折パターンの結果から、賦形剤中にスクロースが２０％以上の場合、換言すれば、賦形剤のうち少なくとも１種類が非晶質状態である場合、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の保存安定性は非常に良好であることが実証された。 なお、実施例１５〜１９のサンプルを、６０℃、１ヶ月の保存条件にて保存安定性を評価したが、いずれのサンプルでも極めて安定であり、メチルコバラミン残存率の低下は認められなかった。 また、図７及び図８は、賦形剤混合物としてのラクトース／マンニトールの混合割合に対する、メチルコバラミンの残存率の結果を示す図である。図７及び図８に示す結果から明らかなように、メチルコバラミンに対する賦形剤混合物の添加量にかかわらず、賦形剤混合物のラクトース／マンニトール中において、非晶質状態で存在するラクトースの混合割合が５０％以上である場合、メチルコバラミンの残存率は非常に高いことが明らかとなった。 さらに、図９および図１０に示す、４０℃における３ヶ月保存によるメチルコバラミンの残存率の結果から、メチルコバラミンに対する賦形剤混合物のスクロース／マンニトール中に存在するスクロースの混合割合が２０％以上である場合、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤中のメチルコバラミンの残存率が非常に高いことが明らかなとなった。 さらにまた、図１１に示す４０℃における１ヶ月保存によるメチルコバラミンの残存率の結果と、図１２に示す４０℃における３ヶ月保存によるメチルコバラミンの残存率の結果とから、メチルコバラミンに対する賦形剤混合物のラクトース／マンニトール中に存在するラクトースの混合割合が５０％以上である場合、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤中のメチルコバラミンの残存率が非常に高く、優れた保存安定性を示した。 以上のことから、本発明に係るメチルコバラミン含有凍結乾燥製剤では、賦形剤のうち少なくとも１種類が非晶質状態である場合、メチルコバラミンの安定性が向上することが判明した。また、ｐＨ調整剤や酸化防止剤をさらに含有する、メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の保存安定性も向上した。 ところで、マンニトールを賦形剤として添加した製剤では、凍結乾燥工程の予備凍結時に熱処理（単に、「アニーリング」ともいう。）を行うことで、マンニトールの結晶化を促進することは公知である。たとえば、Ｉｚｕｔｓｕ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔｅｒａｏ，Ｔ．，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１０，１２３２−１２３７；Ｐｉｋａｌ，Ｍ，Ｊ．，Ｄｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｍ．Ｒｏｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｉｇｇｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓ．８（１９９１）４２７−４３６；Ｉｚｕｔｓｕ，Ｋ．，Ｏｃｈｅｄａ，Ｓ．，Ａｏｙａｇｉ，Ｎ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２７３（２００４）８５−９３；Ｗｕ，Ｓ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．，Ｔｒｅｔｙａｋｏｖ，Ｌ．，Ｈｕ，Ｊ．，Ｇｕｚｚｅｔｔａ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００（２００）１−１６；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｔ．，Ｆｏｒｂｅｓ，Ｒ．，Ｙｏｒｋ，Ｒ．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２５８（２００３）１０９−１２０参照。これは、主にタンパク製剤の凍結乾燥条件の晶質への影響を評価する目的で検討されている。Ｉｚｕｔｓｕらの報告にあるように、ＤＳＣ測定において、マンニトールの結晶化によるは発熱ピークが、−２３℃付近にあることから、予備凍結乾燥工程にこの温度を超えるように熱処理を施すことで、マンニトールの結晶化を促進させることが可能である。 そこで、以下に示すように、アニーリングによるマンニトールの結晶化促進の有無による、本発明に係るメチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の安定性を検討した。 図１４は、マンニトールを用いた凍結乾燥製剤において、熱処理影響の調査の用に供した組成を示す図である。凍結乾燥条件としては、アニーリング工程有と、アニーリング工程無では、以下の条件を採用した。 アニーリング工程有（１）−５５℃で２．５時間、予備凍結を行い、（２）３時間かけて昇温し、（３）−１０℃で３時間、アニーリングを行い、（４）３時間かけて降温し、（５）−５５℃で２．５時間、一次乾燥（−１０℃、２４時間（０．１ｍｂａｒ））を行う。 アニーリング工程無（Ａ）−５５℃で２．５時間、予備凍結を行い、その後、（Ｂ）一次乾燥（−１０℃、２４時間（０．１ｍｂａｒ））を行う。 保存安定性の評価メチルコバラミンの含量変化に基づく、保存安定性の評価は、前述の実施例における評価と同様に、各温度の恒温槽にて３ヶ月保存した後、ＨＰＬＣを用いて行った。 図１５は、マンニトールを用いた凍結乾燥製剤において、凍結乾燥工程中の熱処理の有無によるメチルコバラミンの安定性の結果を示す。なお、図１５中のメチルコバラミン（Ｂ１２−ＣＨ３）およびヒドロキシコバラミン（Ｂ１２−ＯＨ）の各数値は、ＨＰＣＬ測定による結果から、（Ｂ１２−ＣＨ３またはＢ１２−ＯＨのピーク面積）／（全てのピーク面積の総和）ｘ１００から算出した値である。 図１５に示す結果から、アニーリング工程を施さないものと対比すると、マンニトールの結晶化を促進させるアニーリング工程を施して凍結乾燥させると、メチルコバラミンの安定性が低下するとともに、メチルコバラミンの分解生成物であるヒドロキシコバラミンの生成量が、増大することが判明した。これは、非晶質雰囲気中と比較して、メチルコバラミンが結晶質雰囲気中で不安定であることを実証している。 本発明に係るメチルコバラミンを含有する凍結乾燥製剤によれば、賦形剤の結晶化状態を制御することにより、メチルコバラミンの保存安定性を改善し、かつ、溶液に溶解して注射液を調製するのに適した用時溶解型の凍結乾燥製剤を提供することができる。 ［図１］図１は、本発明による一の実態態様における、メチルコバラミン凍結乾燥製剤を製造する場合に用いられる、スクロース／マンニトールの混合割合を示す図である。［図２］図２は、本発明による一の実施態様における、メチルコバラミン凍結乾燥製剤を製造する場合に用いられる、スクロース／マンニトールの混合割合を示す図である。［図３］図３は、本発明による一の実施態様における、メチルコバラミン凍結乾燥製剤を製造する場合に用いられる、ラクトース／マンニトールの混合割合を示す図である。［図４］図４は、本発明による一の実施態様における、メチルコバラミン凍結乾燥製剤を製造する場合に用いられる、ラクトース／マンニトールの混合割合を示す図である。［図５］図５は、本発明に係る凍結乾燥製剤の賦形剤としてのスクロース／マンニトールの混合割合に対する、メチルコバラミンの残存率の結果を示す図である。なお、図５と後述する図６〜８について共通することであるが、１Ｍとは保存期間の１ヶ月を表す。［図６］図６は、本発明に係る凍結乾燥製剤の賦形剤としてのスクロース／マンニトールの混合割合に対する、メチルコバラミンの残存率の結果を示す図である。［図７］図７は、本発明に係る凍結乾燥製剤の賦形剤としてのラクトース／マンニトールの混合割合に対する、メチルコバラミンの残存率の結果を示す図である。［図８］図８は、本発明に係る凍結乾燥製剤の賦形剤としてのラクトース／マンニトールの混合割合に対する、メチルコバラミンの残存率の結果を示す図である。［図９］図９は、本発明による凍結乾燥製剤の実施例１ないし５と、比較例１における、４０℃での保存安定性の結果を示す図である。［図１０］図１０は、本発明による凍結乾燥製剤の実施例６ないし１０と、比較例２における、４０℃での保存安定性の結果を示す図である。［図１１］図１１は、本発明による凍結乾燥製剤の実施例１１および１２と、比較例３における、４０℃での保存安定性の結果を示す図である。［図１２］図１２は、本発明による凍結乾燥製剤の実施例１３および１４と、比較例４における、４０℃での保存安定性の結果を示す図である。［図１３］図１３は、本発明より製造されたメチルコバラミン含有凍結乾燥製剤のＸ線回折パターンを示す図である。図１３において、（ａ）賦形剤がスクロースのみからなる場合（実施例１）、（ｂ）賦形剤がスクロース／マンニトール＝１／１の場合（実施例３）、（ｃ）賦形剤がスクロース／マンニトール＝２／３の場合（実施例４）、（ｄ）賦形剤がスクロース／マンニトール＝１／４の場合（実施例５）、（ｅ）賦形剤がマンニトールのみからなる場合（比較例１）、の各Ｘ線回折パターンを示す。［図１４］図１４は、マンニトールを用いた凍結乾燥製剤において、凍結乾燥工程中の熱処理の影響の調査の用に供した組成を示す図である。［図１５］図１５は、マンニトールを用いた凍結乾燥製剤において、凍結乾燥工程中の熱処理の有無によるメチルコバラミンの安定性の影響の結果を示す図である。なお、図における３Ｍとは、３ヶ月を意味し、図中の数字は、メチルコバラミンおよびヒドロキシコバラミンの面積％を示す。 メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と、賦形剤と、を含み、 前記賦形剤は少なくとも１種類以上の非晶質状態である糖類を含み、前記糖類がグルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースからなる群から選択される凍結乾燥製剤。 前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩が、非晶質状態である、請求項１記載の凍結乾燥製剤。 前記賦形剤は、マンニトール、イノシトール、ソルビットからなる群から選択される糖アルコールをさらに含む、請求項１又は２記載の凍結乾燥製剤。 前記凍結乾燥製剤は、ｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１乃至３のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 前記凍結乾燥製剤は、酸化防止剤をさらに含む、請求項１乃至４のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 前記非晶質状態である糖類が、前記賦形剤中、少なくとも２０重量％である量である、請求項１乃至５のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と、賦形剤とを含み、前記賦形剤は少なくとも１種類以上の非晶質状態である糖類を含み、前記糖類がグルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースからなる群から選択され、 （ａ）前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と前記糖類とを、溶媒に溶解させる工程と、 （ｂ）前記糖類の非晶質状態が生じるように、溶液を凍結乾燥させる工程と、を備える製造方法により得られる凍結乾燥製剤。 前記工程（ｂ）において、前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩の非晶質状態を生ずるように凍結乾燥させる、請求項７記載の凍結乾燥製剤。 前記工程（ｂ）において、前記糖類の結晶化が起こらない温度以下で予備凍結を行う、請求項７又は８記載の凍結乾燥製剤。 前記賦形剤は、マンニトール、イノシトール、ソルビットからなる群から選択される糖アルコールをさらに含む、請求項７乃至９のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 前記工程（ａ）において、さらにｐＨ調整剤を溶解させる、請求項７乃至１０のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 前記工程（ａ）において、さらに酸化防止剤を溶解させる、請求項７乃至１１のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 前記非晶質状態である糖類が、前記賦形剤中、少なくとも２０重量％である量である、請求項７乃至１２のうち何れか一項に記載の凍結乾燥製剤。 メチルコバラミン含有凍結乾燥製剤の製造方法であって、賦形剤は少なくとも１種類以上の非晶質状態である糖類を含み、前記糖類がグルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースからなる群から選択され、 （１）メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩と前記糖類とを、溶媒に溶解させる工程と、 （２）前記糖類の非晶質状態が生じるように、溶液を凍結乾燥させる工程と、 を備える製造方法。 前記工程（２）において、前記メチルコバラミン又はその薬理学的に許容しうる塩の非晶質状態が生じるように凍結乾燥させる、請求項１４記載の製造方法。 前記工程（２）において、前記糖類の結晶化が起こらない温度以下で予備凍結を行う、請求項１４又は１５記載の製造方法。 前記賦形剤は、マンニトール、イノシトール、ソルビットからなる群から選択される糖アルコールをさらに含む、請求項１４乃至１６のうち何れか一項に記載の製造方法。 前記凍結乾燥製剤は、ｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１４乃至１７の何れか一項に記載の製造方法。 前記凍結乾燥製剤は、酸化防止剤をさらに含む、請求項１４乃至１８のうち何れか一項に記載の製造方法。 前記非晶質状態である糖類が、前記賦形剤中、少なくとも２０重量％である量である、請求項１４乃至１９のうち何れか一項に記載の製造方法。