生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法 |
| 出願番号： | 2005322105 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C12Q 1/68,A01K 67/027 |
特許情報キャッシュ
山川 和弘 バルジンダー・シン 井上 有史 JP 2007124974 公開特許公報(A) 20070524 2005322105 20051107 ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法 独立行政法人理化学研究所 503359821 社本 一夫 100089705 増井 忠弐 100076691 小林 泰 100075270 千葉 昭男 100080137 富田 博行 100096013 泉谷 玲子 100107386 山川 和弘 バルジンダー・シン 井上 有史 C12N 15/09 20060101AFI20070420BHJP C12Q 1/68 20060101ALI20070420BHJP A01K 67/027 20060101ALI20070420BHJP JPC12N15/00 AC12Q1/68 AC12N15/00 FA01K67/027 23 ＯＬ 25 4B024 4B063 4B024AA01 4B024AA11 4B024BA80 4B024CA04 4B024CA09 4B024CA11 4B024DA02 4B024EA04 4B024GA11 4B024HA14 4B024HA17 4B063QA01 4B063QA05 4B063QA13 4B063QA17 4B063QA18 4B063QA19 4B063QQ03 4B063QQ08 4B063QQ43 4B063QQ52 4B063QR08 4B063QR32 4B063QR56 4B063QR62 4B063QR83 4B063QS25 4B063QS34 4B063QX02 本発明は、ヒトてんかんの遺伝的素因の有無を検出する方法に関する。 てんかんとは、大脳の神経細胞の過剰な同期的反射活動が起こることによって、同一個人の中で同じ型の臨床発作（全身強直−間代発作、欠伸発作、幻聴発作、四肢の一部の強直発作など）を繰り返す病態をいう。また、多種多様な臨床および検査所見を伴う。 てんかんは、てんかん発作のみを症状とし脳室病変を認めない特発性てんかん、脳室病変を認め、難治・重篤な症候性てんかん、および脳室病変は見られないものの、重篤な症状から特発性てんかんには分類しがたい潜因性てんかんの３つに分類される。 特発性てんかんはてんかん全体の約７割をしめるとされる。家族内発症や一卵性双生児での高い一致率（７０％）などから、特発性てんかんには遺伝的な背景が想定され、実際に現在までに２０弱の遺伝子が同定され、そのほとんどがイオンチャネルをコードする。 症候性てんかんでは、その原因の多くが交通事故などによる脳へのけが、感染症、周産期障害などによる。遺伝性のものは１割に満たない（てんかん全体の３％以下）が、その種類は２００を越え、報告された原因遺伝子の数は特発性てんかんのそれを上回る。これまでに特発性てんかんとは対照的に、イオンチャネルをコードする原因遺伝子は報告されていない。 代表的な遺伝性症候性てんかんの例としてはラフォーラ病が知られている。ラフォーラ病は、常染色体劣性遺伝形式をとる遺伝性症候性てんかんであり、全身性痙攣を初発症状として６歳から１８歳で発症し、刺激誘起性ミオクローヌス、欠神発作、大発作、痴呆、小脳失調症などを示す。症状は進行性であり、発症後１０年以内（平均５．５年）で死亡する非常に重篤で悲惨な疾患である。現在までにＥＰＭ２Ａ（プロテインフォスファターゼをコード），ＮＨＬＲＣ１（ユビキチンリガーゼをコード）の２つの原因遺伝子が報告されており、ほとんどのラフォーラ病患者でいずれかの遺伝子の変異が検出される。 また、症候性てんかんに分類される側頭葉てんかんは、成人難治てんかんの最も多くを占める頻度の高いてんかんであり、複雑部分発作（しばしば運動停止、凝視で始まり、口部などの自動症、姿勢異常、意識障害、健忘、近時記憶障害、言語障害などを伴う）を示す。多くが内側側頭部(海馬周辺)を発作の起始部とし外科手術の最も良い適応の１つとされる。海馬硬化がしばしば見られるが病因は未だ明らかではない。側頭葉てんかんは、これまで後天的な症候群として見られてきたが、ある側頭葉てんかんは遺伝要素を有するとする新たなコンセンサスがある。 これまでにラットおよびマウスを用いた実験により、側頭葉てんかんについて生物学的研究がなされている。具体的には、メチルアゾキシメタノールを用いたヒト側頭葉てんかんのラットモデルを使用した最近の研究は、ＫＣＮＤ２遺伝子がコードするＫｖ４．２チャネルにより伝導される抑制性細胞体樹状突起Ａ型電流の喪失が、てんかん発作の根底にある正のフィードバックループを促進する可能性を示唆している（非特許文献１）。また、ＫＣＮＤ２ノックアウトマウスは誘導可能なてんかん発作の傾向がある、との報告もある（非特許文献２）。 現在までにＫＣＮＤ２遺伝子は、電位依存型カリウムチャネルのＳｈａｌサブファミリーのメンバーであるＫｖ４．２をコードし、それは脳内でＡ型外向き（ｏｕｔｗａｒｄ）カリウム電流を仲介し、そして神経の樹状突起における逆伝播活動電位（ｂ−ＡＰ）の調節に重大な役割を果たすことが知られている（非特許文献３）。また、ＫＣＮＤ２遺伝子のカルボキシル末端のフィラミンへの相互作用領域を破壊した、突然変異体Ｋｖ４．２タンパク質を発現する細胞では、より低い電流密度を有する報告がある（非特許文献４）。しかしながら、これらの報告はいずれも非ヒトであるモデル動物または培養細胞におけるものであり、Ｋｖ４．２カリウムチャネルをコードするＫＣＮＤ２遺伝子がヒトの側頭葉てんかんの原因遺伝子であることを直接実証するに至るものではなかった。 日本全国においててんかん患者は、およそ１２０万人に達し、うち難治性の患者は２０万人に達するきわめて一般的な疾患であり、的確に患者の遺伝的素因を検出することは、その後の治療計画の面からも重要である。さらに症候性てんかん、特に側頭葉てんかんにおいて、てんかん性発作の原因が遺伝的素因にあるのか、その他の原因にあるのかを同定することは、同様に治療計画などの面から必要とされている。したがって、正確かつ容易にてんかんに関わる遺伝的素因を検出できる方法の開発が望まれている。Ｂｅｒｎａｒｄ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，５３２（２００４）Ｆｏｒｂｅｓ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ ５８ｔｈ ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ（２００４）Ｂｉｒｎｂａｕｍ Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．８４，８０３（２００４）Ｐｅｔｒｅｃｃａ Ｋ． Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０、８７３６（２０００）Ｅｎｇｅｌ Ｊ． Ｊｒ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，７（４），３４０（２００１）Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．５９、１８９１（２００２）Ｄｕｎｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １２、７３８（２００４） 本発明は、ヒトてんかんの診断および治療の可能性などを探るために、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出する、ことを含む。 本発明はまた、本発明のヒトてんかんの遺伝的素因を検出するキットであって、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の検出に使用するプライマー、プローブ、および核酸チップ、並びにそれらを用いたキットを提供することを目的とする。 本発明はさらに、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を有する、核酸を提供することを目的とする。 本発明はまた、ヒトてんかんモデル用の、非ヒトノックアウト哺乳動物を提供することを目的とする。本発明の非ヒトノックアウト哺乳動物は、ＫＣＮＤ２遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部の改変により、ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能の一部または全部が不活性化されていることを特徴とする。 本発明はさらにまた、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法であって、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列またはその発現の制御配列において、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子またはそのタンパク質の発現量に変化を生じさせる変異の存在を検出する、ことを含む、上記方法を提供する。 発明者らは、上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ヒトの側頭葉てんかん（ＴＬＥ）に関連した初めてのカリウムチャネル突然変異、ＫＣＮＤ２一部切除突然変異、を同定した。ＫＣＮＤ２は、脳内におけるＡ型外向きカリウム電流を仲介する電位依存型カリウムチャネルＫｖ４．２をコードする。本発明は、特にヒトにおいて、ＴＬＥの遺伝的素因を初めて明らかにしたものである。 具体的には、発明者らは、日本の家系の６５人の親族でない、ＴＬＥと診断された個人のこの遺伝子における突然変異を、６つのエクソンおよびイントロン−エクソンの境界すべてを直接的シークエンスによりスクリーニングした。その結果、ナンセンスコドンを生じるｃ．２７２３＿２７２７ｄｅｌＡＡＡＣＴの５塩基対欠失が、ＴＬＥの一人の発端者で同定された（図１）。同定されたアミノ酸変化（Ｎ５８７ｆｓＸ）に対応する同定された変異は、カルボキシル末端の最後の４４アミノ酸を欠く一部切除Ｋｖ４．２タンパク質を産生することが予想された。重要なことに、この欠失領域は重要なＥＲＫリン酸化部位、並びに細胞骨格タンパク質ＰＳＤ−９５およびフィラミンへの相互作用モチーフを持つ（実施例１）。 発明者らは、細胞全体のパッチクランプ記録を使用して、ＨＥＫ２９３細胞中で発現したヒト野生型Ｋｖ４．２チャネル（ＷＴ）および変異体Ｋｖ４．２（ｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸ）チャネルの電気生理学的特性を解析した。主要な発見は、突然変異チャネルでトランスフェクトされた細胞における電流密度（ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ）はＷＴチャネルの細胞の記録に比べて劇的に減少したことであった（図３）（実施例２）。 これらの発見はＫＣＮＤ２遺伝子がＴＬＥの原因遺伝子であることを示すものである。本発明は上記発見に基づき、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出することを含む、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法を見出し、本発明を想到した。 （Ｉ）ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法 本発明の方法は、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法を提供する。本発明の方法は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出することを含む。 本発明のおいて、「てんかん」とは、大脳の神経細胞の過剰な同期的反射活動が起こることによって、同一個人の中で同じ型の臨床発作（全身強直−間代発作、欠伸発作、幻聴発作、四肢の一部の強直発作など）を繰り返す病態を意味する。てんかんの種類は、遺伝的原因が関連するものであれば、特に限定されず、特発性てんかん、症候性てんかんおよび潜因性てんかんのいずれも含む。好ましくは側頭葉てんかんであるが、脳内病変がみられないタイプを含む。 「ヒトてんかんの遺伝的素因」とは、ヒトてんかんの発症と関連のあるゲノムＤＮＡ配列中の塩基配列の特徴のことであり、１塩基またはそれ以上の長さにわたり既知の天然の塩基配列と比べて変異を有していることをいう。具体的には、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を指す。あるいは、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列またはその発現の制御配列において、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子またはそのタンパク質の発現量に変化を生じさせる変異を指す。遺伝的素因が検出され、遺伝的素因を有すると判断された場合には、当該遺伝的素因を有する個体は、ヒトてんかんに罹患している、あるいは、ヒトてんかんになる確率が高いことを意味する。 「ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子」とは、ヒトのカリウムチャネル「ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質」をコードする遺伝子である。「ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質」とは、Ｋｖ４．２としても知られ、好ましくは配列番号２で表わされる。 しかしながら、配列番号２以外にも、配列番号２と比べて「ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質」の生物学的性質を変えない変異を有するのもの含む。即ち、「生物学的性質を変えない変異」とは、規定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよいことを意味する。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。 あるいは、「生物学的性質を変えない変異」とは、上記の保存的置換以外のものであっても、ＫＣＮＤ２タンパク質のチャネルとしての活性に変化を与えない変異を有するのものを含む。ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的性質とは、例えば、電位依存型カリウムチャネルとしての機能、即ち、電位依存的に（電気刺激により）カリウムイオンを細胞内から細胞外に出す、機能を意味する。電位依存型カリウムチャネルとしての機能は、例えばＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度の値、活性化・不活性化の膜電位依存性等により決定することができる。 「ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子」は、好ましくは配列番号１で表わされるが、遺伝子の縮重により、配列番号１以外にも配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものも含まれる。さらに、配列番号２以外のアミノ酸配列をコードするものであっても、ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を失わせないＳＮＰｓ、ハプロタイプまたはその他の塩基配列の変異を含むものも、本明細書における「ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子」に含まれる。 （ｉ）ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異 本発明の方法により、ＫＣＮＤ２遺伝子の配列番号１の２７２３番目から２７２７番目のＡＡＡＣＴの塩基配列が欠失した変異体が検出された。ここで、野生型ＫＣＮＤ２遺伝子は２７２０番目以降の塩基配列は、ＣＴＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡ・・・であり、この配列が、ロイシン−アスパラギン−システイン−グルタミン酸−・・・をコードする。一方、当該ＫＣＮＤ２遺伝子の変異体ＫＣＮＤ２遺伝子では欠失により、ＣＴＧＴＧＡＡ・・・となり、ＴＧＡはストップコドンであることから、対応するアミノ酸はロイシン、で翻訳が停止することが明らかとなった。即ち、生じたナンセンス変異のため、アスパラギン以降の４４アミノ酸を欠失したタンパク質が生産されることが明らかとなった。 実施例２の記載から、変異体Ｋｖ４．２（ｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸ）チャネルを発現する細胞は電流密度が有意に減少することが明らかとなった。ここで変異体Ｋｖ４．２は、Ｃ末端側の４４アミノ酸を欠くだけでこの表現型を有している。したがって、ヒトＫＣＮＤ２遺伝子に当該ナンセンス以外の変異が起きても、同様に電流密度を有意に減少することが予測される。したがって、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異は、特に限定されず、公知のあらゆるアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異を含む。このため、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異は、好ましくはミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト形成もしくは欠失、トランケート形成を含み、さらに好ましくは、ＫＣＤＮ２タンパク質の生物学的機能を低下させるか実質的に失わせる変異も含む。 「ミスセンス」とは、遺伝子の翻訳領域内にある塩基配列に変異が生じて、あるアミノ酸に対するコドンが別のアミノ酸に対応するコドンに置き換わることを言う。「ナンセンス」とは、遺伝子上の塩基配列に生じた変異のうち、それまであるアミノ酸に対応していたコドンを終始コドンに変化させ、タンパク質合成を中断、終始させることをいう。「フレームシフト」とは、遺伝子の翻訳領域内にある塩基配列に変異が生じて、ＤＮＡに１個または数個（３の倍数は除く）の塩基が付加または欠失することで、遺伝子のリーディングフレームがずれることをいう。「スプライシングサイト形成もしくは欠失」とは、ゲノムＤＮＡに生じた変異のうち、本来イントロンとしてスプライシングにより除去される部位が除去されず、またはエキソンの領域がスプライシングにより誤って除去されることをいう。「トランケート形成とは」とは、遺伝子の翻訳領域内にある塩基配列に変異が生じて、本来生じるはずのタンパク質の一部分が欠如することをいう。 「ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能」とは、例えば、電位依存型カリウムチャネルとしての機能、即ち、電位依存的に（電気刺激により）カリウムイオンを細胞内から細胞外に出す、機能を意味する。電位依存型カリウムチャネルとしての機能は、例えばＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度の値、活性化・不活性化の膜電位依存性等により決定することができる。 電流密度の量、活性化・不活性化の膜電位依存性などは、当業者に公知のいずれの方法、例えばパッチクランプ法により測定してよい。パッチクランプ法は、培養細胞にチャネルタンパク質を発現させ、これに微小電極を当てることにより、細胞膜を流れる電流を測定することができる。好ましくは、実施例２の方法により、達成することができる。 「ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を低下させる」とは、ＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化によって、ＫＣＮＤ２タンパク質の電位依存型カリウムチャネルとしての機能が低下するこという。例えば、実施例２では、ＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度の値が、変異を有しない場合と比較して、電位が例えば、０ｍＶの際に約６６％（７５→２５ｐＡ／ｐＦ）、４０ｍＶの際に約７０％（１９０→６０ｐＡ／ｐＦ）減少した（図３）。よって、本発明においてＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度の値が、変異を有しない場合と比較して「ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を低下する」とは、ＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度の値が、変異を有しない場合と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは４０％、さらに好ましくは６０％以上、最も好ましくは７０％以上減少することを意味する。 「ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を実質的に失わせる」とは、ＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化によって、ＫＣＮＤ２タンパク質が電位依存型カリウムチャネルとしての実質的に機能しなくなることを意味する。 「ＫＣＤＮ２タンパク質の生物学的機能を低下させる」および「ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を実質的に失わせる」いずれの場合も、ヒトＫＣＤＮ２遺伝子の塩基配列中に変異が生じることで、変異型タンパク質が発現することを含む。これは、コード領域内に終始コドンが入った結果の短縮型タンパク質を含む。さらには、カリウムチャネルは４分子が会合して、その機能を発揮することが知られているが、この分子会合を妨げるような変異であってもよい。あるいはナンセンス変異依存分解系（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ：ＮＭＤ）等を介した系によりタンパク質が発現しなくなる場合も含む。 「ＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度を減少する」とは、ＫＣＮＤ２タンパク質が単位時間当たりに通過させることができるカリウムイオンの絶対量が減少することをいう。ここにおいても、変異型タンパク質が発現し１分子当たりの通過イオン量が減少する場合と、塩基配列の変化により細胞に発現するタンパク質の量が減少する場合を含む。 したがって、本発明は、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異の結果が、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト形成もしくは欠失、トランケート形成のいずれかである、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法を提供する。さらに本発明は、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異が、ヒトＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を低下させるか実質的に失わせる変異である、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法を提供する。 （ｉｉ）ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位 本発明の方法においては、ヒトＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を低下させる、または実質的に失わせる変異は、いずれもてんかんに関連することが予測できる。例えば、実施例２の記載から、ＫＣＮＤ２タンパク質のヒトのＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度を減少させる変異に着目することができる。したがって、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位は、ＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列のいずれの部位でもよい。 非限定的に、以下好ましさが増える順に特定すると：最もＣ末端側の膜貫通セグメントの直後のアミノ酸をコードするコドンよりも３’側である；５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸をコードするコドンであるかあるいはそれよりも３’側である；フィラミンへの相互作用モチーフ、ＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化部位、またはＰＳＤ９５結合ドメイン、から選択される１つまたは複数の部分をコードする領域内に存在するまたは同領域を含む；配列番号２の５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸をコードするコドン；そして、配列番号１の２７２３ないし２７２７番目に相当する塩基配列のＡＡＡＣＴである。 「最もＣ末端側の膜貫通セグメントの直後のアミノ酸」とは、６回膜貫通型のタンパク質であるＫＣＮＤ２タンパク質の、６番目の膜貫通領域の最もＣ末端のアミノ酸の次のアミノ酸をいう。しかしながら、これに限定されることなく、スプライシングバリアントまたはその他の変異などによって膜の貫通領域の数が異なるタンパク質が生成する場合は、周囲の配列などから前記６番目の膜貫通領域の最もＣ末端のアミノ酸の次のアミノ酸と同等と判断されるアミノ酸を意味する。膜貫通領域の決定は、各アミノ酸のハイドロパシー値を用いたハイドロパシー図の作成により、その分野の通常の知識から推測することができる。ハイドロパシー値とは、ポリペプチド鎖中の連続しているアミノ酸それぞれについて、そのアミノ酸の前後の一定の大きさ（通常は１０個程度）の断片から計算される、各アミノ酸の疎水性を表わす生物学的変数である。経験的に、正のハイドロパシー値がおよそ２０〜３０アミノ酸連続する領域が膜貫通領域と推測される。また、アミノ酸配列から膜貫通領域を予測するソフトウエアやウェブサイトを利用してもよい。 「５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸」とは、好ましくは配列番号２のヒトＫＣＮＤ２タンパク質の５７８番目のアミノ酸であるアスパラギンを指す。スプライシングバリアントまたはその他の変異などによって配列番号２と比べてアミノ酸配列の異なるタンパク質が生成する場合は、周囲の配列などから前記アスパラギンと同等と判断されるのアスパラギンを意味する。 本発明の一態様において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異は、配列番号２の５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸からＣ末端側のアミノ酸配列をすべて欠如させる変異である。 「フィラミンへの相互作用モチーフ」とは、配列番号２の６０１−６０４番目のアミノ酸配列ＰＴＰＰに相当する部分を、「ＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化部位」とは、配列番号２の６０２番目のＴ、６０７番目のＴ、６１６番目のＳに相当するアミノ酸を、そして「ＰＳＤ９５結合ドメイン」とは、配列番号２の６２７−６３０番目のアミノ酸配列ＶＳＡＬに相当する部分を言うが、スプライシングバリアントまたはその他の変異などによって配列番号２と比べて一部アミノ酸の異なるタンパク質が生成する場合は、周囲の配列などから各部位と同等の部位を指すという意味である。 本発明の一態様において、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位は、好ましくは、フィラミンへの相互作用モチーフ、ＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化部位、またはＰＳＤ９５結合ドメイン、から選択される１つまたは複数の部分をコードする領域内に存在する、または同領域を含む。より好ましくは上記３つの部位をすべてコードする領域を含む。 「２７２３ないし２７２７番目に相当する塩基配列のＡＡＡＣＴ」とは、配列番号１の２７２３ないし２７２７番目のＡＡＡＣＴを指すが、変異などによって塩基配列が異なる場合は、周囲の配列などから２７２３ないし２７２７番目のＡＡＡＣＴと同等と判断される配列を意味する。 さらに本発明の一態様において、本発明は、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法であって、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列またはその発現の制御配列において、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子またはそのタンパク質の発現量に変化を生じさせる変異の存在を検出する、ことを含む、上記方法を提供する。 「ＫＣＮＤ２の発現制御配列」とは、開始コドンを含む５’側上流の部分、即ち、ゲノム中の転写または翻訳を制御するための核酸配列を含む部位であって、例えば、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び、その他、転写および翻訳の開始を調節する部位を含む領域をいう。 （ｉｉｉ）ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を検出する手法 本発明においては、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を検出するための具体的な手法は特に限定されず、塩基配列決定、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション、電気泳動、制限酵素処理のいずれかの手法、あるいはこれらの組み合わせを用いた、ヌクレオチドの差異を検出するための公知の方法を使用することが可能である。例えば、非限定的に、塩基配列の決定、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）、プローブを用いた系、ＳＳＣＰ法、などが含まれる。 変異を検出する工程の一方法として、ＫＣＮＤ２の塩基配列の配列決定を行うことが可能である。即ち、ＫＣＮＤ２遺伝子を、ゲノムＤＮＡを生体試料、例えば、血液、毛、または頬由来の試料から抽出し、ＰＣＲなどの適当な手段により増幅し、配列決定することができる。または、生体試料からｍＲＮＡを精製し、逆転写により得られたｃＤＮＡを基に配列決定してもよい。ＰＣＲ用のプライマー群は、ＫＣＮＤ２遺伝子を含むゲノム配列中の６つのコード領域および境界領域すべてを増幅するように設計する。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、増幅反応中に塩基の変異が生じないように複製忠実度の高いものを使用する。配列決定は既知のいずれの方法で行ってよく、好ましくはキャピラリー自動シークエンスシステムで行う。 変異を検出する工程の他の一方法として、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）の原理を用いて変異の有無を検出することもできる。即ち、ゲノムＤＮＡにおいて変異があると思われる領域の両端を適切な制限酵素で切断する。その後に、制限酵素処理後のゲノムＤＮＡ断片を１本鎖に変性し、変異があると思われる領域に対するプローブを加え、ハイブリダイズし電気泳動することでヌクレオチド長の違いを検出することができる。 変異を検出する工程の他の一方法として、プローブを用いた系で変異の有無を検出することも可能である。即ち、変異ＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするプローブのハイブリダイゼーションの有無に基づいて検出することもできる。その場合のプローブは、蛍光標識、放射性標識、酵素標識などの適当な標識により、検出を容易にすることも可能である。また、複数のプローブをＤＮＡチップ上の担体に固定し、核酸チップとして用いることもできる。別の態様においては、プローブはビーズまたはマルチウェルプレート中の担体等に固定化してもよい。 変異を検出する工程の他の一方法として、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法を用いて変異の有無を検出することもできる。２本鎖ＤＮＡを１本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した特有の高次構造をとる。この解離したＤＮＡを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、異なる位置に泳動される（ＳＳＣＰ解析）。ＳＳＣＰ法は、この性質を利用して３２Ｐなどの放射性同位体、蛍光標識、または酵素標識などで標識したプライマーを用いたＰＣＲ、または反応基質の１つに３２Ｐ標識ヌクレオチドなどの放射性同位体、蛍光標識、または酵素標識などを用いたＰＣＲで目的の遺伝子断片を増幅し、ＳＳＣＰ解析を行うことで変異の有無を同定できる。 （ｉｖ）てんかんの遺伝的素因を有すると判断する工程 実施例２によれば、ＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列に変異が生じ、アミノ酸配列に変化を生じさせ、ＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度を著しく減少させる場合、または活性化・不活性化の膜電位依存性を減少させる場合などは、それによりてんかん症状を起こすことが示唆されている。したがって、本発明のヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法は、好ましくは、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異が存在する場合に、てんかんの遺伝的素因を有すると判断する、工程を含む。 （ＩＩ）プライマー 本発明は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出するプライマーを提供する。 本発明のプライマーは、抽出した生体試料からの核酸を増幅するために使用することができ、増幅した核酸を、制限酵素処理による多型の検出方法に使用、または直接的シークエンスによる配列決定に使用することができる。 本発明の検出方法の一態様において、特定の部位および／または変異に限定して検出を行う場合、例えば、ＰＣＲ等による増幅産物の制限酵素断片の長さの相違が多型を生じるので、これを利用した多型検出用マーカーをＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−ｒｅｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカー、またはＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）マーカーを用いて検出することができる（Ａ．Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ａ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｍａｐｐｉｎｇ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｃｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ，（１９９３），Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（２）ｐ．４０３−４１０）。したがって、本発明はそのためのプライマーも提供する。 限定されるわけではないが、本発明のプライマーは、増幅される領域が、好ましくは約５０塩基ないし約３０００塩基、より好ましくは約５０塩基ないし約２０００塩基、より好ましくは約１００塩基ないし約１０００塩基の範囲内にある。 本発明では、上記プライマー対を用いて、ヒトのゲノムＤＮＡを鋳型に核酸増幅反応を行う。核酸増幅反応は、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）である。 直接的シークエンスためのプライマー対は、ＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列に基づき、公知の方法により作成することが可能である。具体的には、限定されるわけではないが、例えば、転移因子および／またはその隣接領域の塩基配列に基づき、以下の条件： １）各プライマーの長さが１５−３０塩基であること； ２）各プライマーの塩基配列中のＧ＋Ｃの割合が３０−７０％であること； ３）各プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの分布が部分的に大きく偏らないこと； ４）プライマー対によって増幅される核酸増幅産物の長さが５０−３０００塩基、好ましくは１００−２０００塩基であること；そして ５）各プライマー自身の塩基配列中、又はプライマー同士の塩基配列間に相補的な配列部分が存在しないことを満たすように、ＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列と同じ塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、必要であれば、ＫＣＮＤ２遺伝子に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造することを含む方法により、プライマー対を作成できる。 本発明の検出方法の一態様において、ＫＣＮＤ２における突然変異を、６つのコード領域および境界領域すべてでプライマー対によって増幅し、直接的シークエンスにより配列を決定する。したがって、本発明のプライマーは、ＫＣＮＤ２遺伝子の６つのコード領域および境界領域の少なくとも１つの領域の５’側または３’側に対応し、ＫＣＮＤ２遺伝子のコード領域を増幅するものをすべて含む。即ち、本発明に使用するプライマーの選択は、各エキソンを挟むイントロン領域または５’側もしくは３’側ＵＴＲを選択することにより、各エキソンを増幅、および配列決定することができる。これらの条件を満たせば、プライマーの選択はエキソン−イントロン境界付近のイントロン領域が増幅され、一部配列決定されてもよい。本発明に使用するプライマーセット間の塩基長は、配列決定に用いる場合は、好ましくは８００塩基以下、さらに好ましくは６００塩基以下である。 したがって、本発明は、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法に使用するプライマーを含む。好ましくは配列番号３〜１８で表わされる。 プライマーを用いて特定の領域を増幅する方法は、当業者に既知の方法を用いて行う。即ち、試料から取り出したゲノムＤＮＡ試料に、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液などを加え、試料増幅用の混合液を作る。その混合液を、２本鎖のＤＮＡを解離させる工程、鋳型ＤＮＡとプライマーのアニーリング工程、それぞれのプライマーからＤＮＡ合成をする工程を含むサイクルを繰り返すサーマルサイクラーのプログラムにより増幅される。２本鎖のＤＮＡを解離させる工程は、９０℃〜１００℃の温度に数十秒置くことにより容易に２本鎖ＤＮＡは１本鎖ＤＮＡに解離する。鋳型ＤＮＡとプライマーのアニーリング工程の温度は、各プライマー配列ごとの融解温度（Ｔｍ）により決定される。融解温度（Ｔｍ）とは、オリゴヌクレオチドの５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度をいい、反応条件が融解温度（Ｔｍ）より高くなると、鋳型ＤＮＡとプライマーのアニーリングが起こりにくくなり増幅効率が減少する。一方、反応条件が融解温度（Ｔｍ）より低くなると、プライマーがその相補配列以外の配列ともアニーリングを起こし、増幅したい配列以外の配列も増幅されてしまう。そして、プライマーからＤＮＡ合成をする工程はＤＮＡポリメラーゼに適した温度で、増幅したい塩基配列長に応じた時間で反応を行う。例えば、９４℃２分を１回、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃６０秒のＰＣＲサイクルを３０回、最後に７２℃５分のインキュベートを行うことで増幅する。 （ＩＩＩ）プローブ 本発明は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出するプローブも提供する。プローブはＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。 本発明のプローブの塩基配列は、ＫＣＮＤ２遺伝子の各エキソンに対応した配列の全部または一部を有する。この配列を有するならば、各エキソンと連続するイントロン領域または５’側もしくは３’側ＵＴＲの配列も、適宜連結していてよい。本発明のプローブの適切な塩基長はいずれの長さでもよいが、好ましくは１０から１００塩基、さらに好ましくは２０から１００塩基である。 本発明のプローブの生成方法は、既知のいずれの方法を用いてもよいが、例えば合成プローブ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写による系などを用いてもよい。好ましくは、合成プローブである。 本発明の態様において、本発明のプローブはヒトのＫＣＮＤ２遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションの確認を容易にする手段、たとえば蛍光ラベル、放射性同位体元素（ＲＩ）、およびビオチンなどによる標識を付してもよい。また、本発明のプローブには上記の配列の他のＤＮＡ配列を付加してもよく、付加するＤＮＡの配列はヒトのＫＣＮＤ２遺伝子配列とは関連がない、すなわち、該遺伝子との相同性がなくてもよい。 本発明の態様において、プローブは、配列番号１の塩基配列の変異ＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能である。 「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。 （ＩＶ）核酸チップ 本発明は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出する核酸チップも提供する。核酸チップは前述のプローブの複数をスライドガラスに固定化してもよい。 本発明の核酸チップは、ＫＣＮＤ２遺伝子の各エキソンに対応した配列の全部または一部を有する核酸がガラス等の基盤上に整列することを特徴とする。この各エキソンの配列を有するならば、各エキソンと連続するイントロン領域または５’側もしくは３’側ＵＴＲの配列も、適宜連結していてよい。本発明の核酸チップは、基盤上で核酸を合成していく型でも、基盤上に核酸を貼り付けて作成する型でもよい。本発明の核酸チップに使用する核酸の適切な塩基長はいずれの長さでもよいが、好ましくは１０から１００塩基、さらに好ましくは２０から１００塩基である。 本発明の核酸チップに使用する核酸の生成方法は、既知のいずれの方法を用いてもよいが、例えば合成核酸、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写による系、またはＰＣＲなどによるｃＤＮＡなどを用いてもよい。好ましくは、合成核酸である。 核酸チップは当業者に一般的な方法で作成可能であり、例えば「新遺伝子工学ハンドブック 第４版」羊土社、２８９−２９４（２００３）を参照されたい。具体的には、市販のアレイヤー、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒなどを用いてアミノシランコートしたガラス基盤上に前述のプローブなどスポットして調製することができる。アレイヤーとは、具体的には、コンピューター制御下でピン先あるいはスライドホルダーをＸＹＺ軸方向に作動し、ガラス基盤の表面上に核酸サンプルを運び、洗浄、乾燥という工程を繰り返す装置をいう。 核酸チップは当業者に一般的な方法で使用可能である。具体例として以下にｍＲＮＡサンプルの塩基配列の変異を核酸チップで検出する方法を示す。初めにｍＲＮＡサンプルをランダムプライマーと混合し、サーマルサイクラーにセットして、９９℃で３分間、７０℃で１０分間、４２℃で１０分間インキュベートすることにより、ｍＲＮＡサンプルとランダムプライマーをアニーリングする。次いで、ＤＴＴ、緩衝液、ｄＮＴＰとともに、シアニン５（または３）−ｄＵＴＰのような検出可能な色素とｄＮＴＰの連結体、さらにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩのような逆転写酵素を混合し、プレミックスを作成する。サーマルサイクラーの試料を１５℃で５分間保温した後、プレミックスを混合し、４２℃で２時間反応して、逆転写反応とともにそれにより生成したｃＤＮＡを標識する。ｍＲＮＡを分解した後に、例えばＭｉｃｒｏｐｕｒｅＥＺやＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０などの核酸精製用フィルター付き遠心チューブにより、シアニン５（または３）で標識したｃＤＮＡサンプルを精製する。次いで、本試料を核酸チップに滴下し、ハイブリダイゼーションチャンバーに入れて密封して、４２℃で１６〜１８時間程度放置する。それから、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ、ミリＱ水で室温中にて洗浄する。核酸チップの水分を、例えば軽く遠心することで取り除き、スキャナーで各スポットのシグナル強度の画像をコンピューターに取込み、適宜変異の有無を解析する。 （Ｖ）ヒトてんかんの遺伝的素因を検出するためのキット 本発明は、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出するためのキットを提供する。 本発明のキットは、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を生じさせる変異を検出するための、プライマー、プローブおよび／または核酸チップを含む。本発明のキットは、さらにヒトゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡの抽出手段、ＤＮＡの増幅手段、反応容器、陽性および陰性対照サンプル、説明書、パッケージなどを適宜含んでよい。 （ＶＩ）核酸 本発明は、ＫＣＮＤ２遺伝子に上述のいずれかの変異を有する核酸を含有する。即ち、この変異とは、好ましくなっていく順に：ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異；ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異の結果が、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト形成もしくは欠失、トランケート形成のいずれかである変異；ヒトＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を低下させるか実質的に失わせる変異である。 また、変異を生じる部位に関しても、上述のいずれも部位を含む。即ち、「（ｉｉ）ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位」の項目にあげられたいずれの部位に変異を生じていてもよい。 ここでいう「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡの他に合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡを含む。さらにはこれらを含むベクターなども本発明の範囲内である。特に言及しない限り、二本鎖、一本鎖のいずれかの態様も含む。二本鎖の場合、本明細書で塩基配列に言及する場合、その相補的な塩基配列も含めて意図する。 （ＶＩＩ）非ヒトノックアウト哺乳動物 本発明は、ＫＣＮＤ２遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部の改変により、ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能の一部または全部が不活性化されているヒトてんかんモデル用の、非ヒトノックアウト哺乳動物を提供する。本発明において、ヒトてんかんとＫＣＮＤ２タンパク質の関連が明らかにされたことにより、ＫＣＮＤ２遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部を改変させた、非ヒトノックアウト哺乳動物の提供が可能となった。 本発明中の非ヒトノックアウト哺乳動物とは、ゲノムＤＮＡ中のＫＣＮＤ２が相同組換えなどにより一部または全部が欠失している非ヒト哺乳動物のみならず、ＫＣＮＤ２遺伝子の発現をＲＮＡｉなどの機構により抑制する、ＫＣＮＤ２遺伝子に対する２本鎖ＲＮＡを発現するようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物も含む。 本発明の非ヒトノックアウト哺乳動物は、非ヒトの哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ヤギ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ等である。取扱いが容易で、実験系が確立しているマウスが最も好ましい。また、本発明のノックアアウト哺乳動物は成体のみならず、ＥＳ細胞、受精卵、８細胞期から胚盤胞形成そして出生直前までの胚、卵、精子、組織・器官培養物、キメラ動物等の全ての態様を含む。これらは、保存のため、必要に応じ冷凍された状態であってもよい。 以下にノックアウトマウスの作成法を示す。 １）ターゲティングベクターの作成 ターゲティングベクターは、ＫＣＮＤ２遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部または全部を相同組換えするために使用する。したがって、本発明のノックアウトマウス作成のためのターゲティングベクターは、マウスゲノムＤＮＡ中において、ＫＣＮＤ２遺伝子の５’および３’側の配列を有し、ＫＣＮＤ２遺伝子のエキソン領域の全部または一部が欠損する形で構築される。また、同時に、後の工程において行わなければならない相同組換え体のスクリーニングを、より容易に行うことができるようにポジティブ選別、ネガティブ選別等の選別用の遺伝子を適切に導入する。このターゲティングベクターにより、ＫＣＮＤ２遺伝子の５’および３’側により相同組換えが誘発され、改変ＫＣＮＤ２遺伝子遺伝子とともにゲノムＤＮＡ中に組み込まれうる。 ポジティブ選別とは、ターゲティングベクターが染色体に導入された胚性幹細胞のみを選別することを意味する。一般に形質転換に用いられるエレクトロポレーション法により、導入した遺伝子ＤＮＡが染色体に組み込まれる確率は、１０３−１０４個の細胞に１個程度の頻度であるため、遺伝子ＤＮＡが導入された細胞のみを選び出すための配列（ポジティブ選別）をまず考えなければならない。 ポジティブ選別用マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８によって選別）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子（ハイグロマイシン−Ｂによって選別）、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子（ブラスティシジンＳによって選別）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシンによって選別）等が使用可能である。ネオマイシン耐性遺伝子が最も好ましい。 ネガティブ選別とは、非相同組換えを生じた胚性幹細胞を選択的に除くことを意味する。これは、特に対象とする遺伝子がＥＳ細胞で発現していないか、発現量が低い場合に、利用しうる。相同組換えは相同領域で生じるが、非相同組換えは多く直線化した導入ＤＮＡの両末端で生じる。ネガティブ選別は導入ＤＮＡの一端に、これが組み込まれると細胞に毒性を持つ遺伝子を付加することによって行う。ネガティブ選別としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子を用いる方法等が知られている。細胞内在性のチミジンキナーゼ（ＴＫ）に比し、ＨＳＶ由来のＴＫは、より高率にＦＩＡＵ、ガンサイクロビアなどの核酸類似体をリン酸化する。ｔｋ選別は、非相同組換えでＨＳＶｔｋ遺伝子が導入されるとＦＩＡＵなどを加えた場合、これがリン酸化されて染色体ＤＮＡ中に取り込まれＤＮＡ合成が阻害されることを利用したものである。ＤＴ−Ａは、細胞内で伸長因子ＩＩをｐｏｌｙＡＤＰリボシル化してタンパク質合成を阻害する。ＥＳ細胞で高い発現活性を有するプロモーターと連結したＤＴ−Ａ遺伝子を用いれば、非相同組換えでこれが染色体に組み込まれた細胞は死滅すると期待される。翻訳レベルの選別で、選択剤を必要としない、という利点を有する。 ２）ターゲッティングベクターによる相同組換え 上記の方法により作製したターゲティングベクターを使用して、相同組換えを行う。現在確立されている遺伝子ターゲティング法では、ＥＳ細胞を使用する系が望ましい。現時点では、ヒト、ミンク、ハムスター、ブタ、ウシ、マーモセット、アカゲザル等の複数の哺乳動物でＥＳ細胞が樹立されている。将来さらに多種の動物で同様なＥＳ細胞が樹立されれば、同様な方法を用いて遺伝子改変動物を作製することができる。 遺伝子改変マウス作製用のＥＳ細胞株は、公知のマニュアルを使用して自己で作製してもよいが、既存の樹立されたＥＳ細胞株が入手可能であり、好ましい。現在使用することができるマウス由来のＥＳ細胞は、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、などがある。所期のＥＳ細胞株は必要に応じ、各々特定の研究機関より入手可能である。 作成したＫＣＮＤ２遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を改変したターゲティングベクターをＥＳ細胞中に導入する。相同組換えは、ＫＣＮＤ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列と、ターゲティングベクター中の非改変部分の配列との相同性を利用して生じさせることができる。ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など公知の方法を使用することができる。 ３）相同組換え体のスクリーニング 得られた組換えＥＳ細胞を、ネオマイシン耐性のフィーダー細胞上にプレーティングする。そしてＥＳ培養液中で、相同組換えによってＥＳ細胞に導入されたポジティブ選別用マーカー及び／又はネガティブ選別用マーカーにより、スクリーニングである選択培養を行う。即ち、培養液中には、選択マーカー遺伝子の種類に依存して、たとえばネオマイシンなどが含まれている。選択培養６−８日目に生存するコロニーを耐性クローンとして採取する。また、相同組換えを起こした形質転換体を確実に選択するために、ＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などにより相同組換えの有無を適宜確認する。 ４）ＫＣＮＤ２遺伝子改変動物の作成 次いで、相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期または胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製することができる。 ＥＳ細胞を胚内に移植する方法は、たとえばマイクロインジェクション法、アグリゲーション（凝集）法などが知られておりいずれを用いてもよい。マウスの場合、まず、ホルモン剤（たとえば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このように回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。 一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするために、受精卵を採取する雌マウスと仮親になる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。 このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。選択したＥＳ細胞移植胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させ、そして次世代産仔にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するためには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色により行うことが望ましい。このように、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖することにより目的とする遺伝子を欠損する個体を得ることができる。これにより得られたＫＣＮＤ２遺伝子ヘテロ欠失マウス同士を掛け合わせることによって、ＫＣＮＤ２欠失ホモ接合体マウスを得ることができる。遺伝的背景の単一性の観点から、できるだけ戻し交配の回数を経たものがノックアウトマウスとしては好ましい。 （ＶＩＩＩ）てんかんを遺伝子治療する方法 本発明の発見により、ヒトのてんかんを遺伝子治療により克服することができる。遺伝子治療とは、遺伝的素因が病気の発症原因となっている場合に、特定の遺伝子クローンを患者の体細胞に導入し、導入された遺伝子が機能を発揮することによって治療する方法である。患者の幹細胞、リンパ球や骨髄細胞などをいったん体外に取り出して遺伝子クローンを導入した後、患者の体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法と、患者の病変組織へ遺伝子クローンを直接導入するｉｎ ｖｉｖｏ法とがある。ｉｎ ｖｉｖｏ法は安全性に問題が残るため、ｅｘ ｖｉｖｏ法が一般的であるが、いずれの方法によっても良い。 以下にｅｘ ｖｉｖｏ法による遺伝子治療の方法を述べる。 ＫＣＮＤ２遺伝子は、脳内におけるＡ型外向きカリウム電流を仲介する電位依存型カリウムチャネルＫｖ４．２をコードする。したがって、本発明の遺伝子治療に用いられる細胞は神経に分化可能な幹細胞であり、例えば神経幹細胞などが適当である。神経幹細胞は、幹細胞の特徴である、増殖能、自己複製能、多分化能、組織修復能を有し、発生期から生体において、一生を通じて存在することが明らかとなっている。これまでに神経幹細胞は、海馬の歯状回の顆粒細胞層下部や前脳の脳室下帯などに存在すると考えられ、これらの領域から分離することが可能である。 神経幹細胞を分離する方法としては、これまでにいくつかの方法が確立している。例えば、表面抗原に対する抗体を用いて神経幹細胞を回収するという方法である。コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣｈＴｘ）、破傷風毒素フラグメントＣ（ＴｎＴｘ）、Ａ２Ｂ５などの抗体の組み合わせで神経幹細胞が分離できる。 分離された神経幹細胞は、ＥＧＦやＦＧＦ−２を添加することにより、細胞増殖を引き起こし、さらに様々な因子を投与することにより分化誘導することも可能である。したがって１個の神経幹細胞から多量の神経幹細胞を確保することができ、これらの細胞は患者から分離したものであるため、免疫応答を引き起こすことなく自家移植が可能である。 神経幹細胞への遺伝子の導入方法は、ウイルスベクター（レトロウイルスまたはレンチウイルスなど）を用いる方法、化学的な、例えばリポフェクションによる方法、あるいは物理的な、例えばエレクトロポレーションによる方法のいずれの方法も使用可能である。本発明においては、これらの遺伝子導入方法を用いて、変異を有さないＫＣＮＤ２遺伝子を発現するように導入する。安定的にＫＣＮＤ２遺伝子が導入された神経幹細胞を、適切な神経分化誘導因子で誘導することにより神経細胞に分化することができ、あるいは分化させないままで脳内に移植することで、正常なＫＣＮＤ２遺伝子を有する神経の存在によりてんかんを治療できることが期待される。 したがって、本発明は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在が検出された患者に、変異のないＫＣＮＤ２を発現するように遺伝子治療する方法も含む。 本発明により、初めて、てんかんとＫＣＮＤ２遺伝子の変異の関係が明らかとなった。本発明から、６５人の患者で４パターンの変異が発見された（実施例１）。このことから、今後新たなてんかんとＫＣＮＤ２遺伝子の変異の関係が明らかになると期待される。また、てんかん患者の発症原因を的確に同定することができ、臨床治療への有意義な情報を提供する。 以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。 実施例１ 側頭葉てんかん患者のＫＣＮＤ２遺伝子の変異解析 発端者および突然変異解析 発明者らは、日本人家系の６５人の親族でない、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）と診断された個人のＫＣＮＤ２における突然変異を、６つのコード領域および境界領域すべてを直接的シークエンスによりスクリーニングした。ゲノムＤＮＡは、ヘパリン処理された血液試料からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、そして毛および頬の試料はＩＳＯＨＡＩＲ Ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を使用して抽出した。すべてのゲノムＤＮＡ試料は初めＰＣＲにより増幅し、そしてＰＣＲ産物はＡＢＩ３７００キャピラリー自動シークエンスシステム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して直接的シークエンスにより解析した。 ゲノムＤＮＡの増幅に用いられたプライマーは、配列番号３〜１８であり、それぞれのプライマーセットはＫＣＮＤ２遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の各領域を増幅する。即ち、配列番号３と配列番号４のプライマーセットは配列番号１の８４３〜１３８８（第１エキソンの一部）を、配列番号５と配列番号６のプライマーセットは配列番号１の１１３８〜１６９９（第１エキソンの一部）を、配列番号７と配列番号８のプライマーセットは配列番号１の１６４８〜２０８０（第１エキソンの一部）を、配列番号９と配列番号１０のプライマーセットは配列番号１の２０８１〜２２４３（第２エキソン）を、配列番号１１と配列番号１２のプライマーセットは配列番号１の２２４４〜２３３９（第３エキソン）を、配列番号１３と配列番号１４のプライマーセットは配列番号１の２３４０〜２４３２（第４エキソン）を、配列番号１５と配列番号１６のプライマーセットは配列番号１の２４３３〜２６８０（第５エキソン）を、配列番号１７と配列番号１８のプライマーセットは配列番号１の２６８１〜２９７６（第６エキソン）を、それぞれ増幅する。ただし、配列番号６〜１５はＫＣＮＤ２遺伝子のイントロン領域に相補する配列であるため、イントロン領域の一部もともに増幅される。 ＰＣＲ反応のために、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ）、およびＢｌｅｎｄ Ｔａｑ Ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）ＤＮＡポリメラーゼシステムを、製品の説明書に従って使用した。６５人のＴＬＥ患者すべては、日本、静岡県、静岡てんかん・神経医療センターで、疾患の確立した臨床基準を満たし、そして診断され、そして治療された。インフォームドコンセントを、本発明で試験したすべての個人から得た。 結果 ６５人の日本人ＴＬＥ患者の発明者らのプールにおいて、計４つの異なったヌクレオチド変化が同定された。 ５塩基対の欠失が早まったストップコドンを生じるフレームシフトを作り出すヘテロ接合体ｃ．２７２３＿２７２７ｄｅｌＡＡＡＣＴ突然変異である、これらのうち１人が、アミノ酸変化（Ｎ５８７ｆｓＸ）を含むと予想される。この突然変異タンパク質で欠失される４４カルボキシル末端アミノ酸は、フィラミンへの相互作用モチーフ、アミノ酸６０１−６０４（ＰＴＰＰ）；３ＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化部位、アミノ酸Ｔ６０２、Ｔ６０７、Ｓ６１６；およびＰＳＤ９５結合ドメイン、アミノ酸６２７−６３０（ＶＳＡＬ）を含む。該発端者の無症候性の父親からのリンパ球とともに毛および頬の標本試料からのＤＮＡは、直接的シークエンスにより検査され、ヘテロ接合体ｃ．２７２３＿２７２７ｄｅｌＡＡＡＣＴ突然変異を表わした（図２）。 ヘテロ接合体非コード領域ＳＮＰ、ＩＶＳ３＋４０Ｔ＞Ｃ、は２人のＴＬＥ患者で発見されたが、親族でない健康な個人から得た２２４人の染色体のプール中に存在しなかった。ヘテロ接合体コード領域サイレント突然変異、ｃ．７５６ Ｃ＞Ｔ（Ｃ２５２Ｃ）、は唯一のＴＬＥ患者で発見され、そして１人の親族でない健康な個人でも発見された。ｃ．７５６ Ｃ＞Ｔ（Ｃ２５２Ｃ）およびＩＶＳ３＋４０Ｔ＞Ｃの両方とも、ＮＣＢＩまたは日本のＳＮＰデータベースのいずれかにリストアップされていなかった。 他のヘテロ接合体非コード領域ＳＮＰ、ＩＶＳ３＋６８Ｔ＞Ｃ、はＮＣＢＩ ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ７７９５３７０としてＮＣＢＩデータベースにリストアップされる。 これらのデータは、ＮＣＢＩ ＳＮＰデータベースとの関連で見られるとき重要性を持ち、このデータベースはＫＣＮＤ２遺伝子のおよそ１０００のＳＮＰｓをリストアップし、このＫＣＮＤ２遺伝子は唯一のサイレント突然変異がコード領域内にある。 即ち、ｃ．２７２３＿２７２７ｄｅｌＡＡＡＣＴ突然変異は、ＫＣＮＤ２タンパク質にアミノ酸変化として現れたために、てんかんと直接的に関わることが示唆される。一方、そのほか３つの変異（ｃ．７５６ Ｃ＞Ｔ（Ｃ２５２Ｃ）、ＩＶＳ３＋４０Ｔ＞Ｃ、ＩＶＳ３＋６８Ｔ＞Ｃ）は、いずれもＫＣＮＤ２のアミノ酸変化に現れる変異ではなく、また健常人でも発見されることから、いずれも疾患との関わりは薄いことが考えられる。 実施例２ パッチクランプ ２−Ａ 野生型および突然変異ＫＣＮＤ２発現ベクターの構築 野生型ヒトＫＣＮＤ２のｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、正常ヒトトータル脳ポリ（Ａ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から合成した。次いで、結果得られたｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ部位を含有する５’オリゴヌクレオチドプライマーおよびＥｃｏＲＩ部位を含有する３’プライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。結果得られた増幅物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を、初めにｐＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、そして次いで、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位の間にサブクローニングした。突然変異ベクターを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、野生型ベクターから生成した。すべての構築物はシークエンスにより確認した。 ２−Ｂ 細胞培養およびトランスフェクション ＨＥＫ２９３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の熱非動化ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）で補ったダルベッコ変法イーグル培地中で生育し、そして３７℃で、加湿した５％のＣＯ２インキュベーターで維持した。細胞全体のパッチクランプのために、初めにＨＥＫ２９３細胞を、ポリリジンでコートした６ウェルディッシュにまき、そして次いで製品の説明書に従って、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、１μｇのｐＫＣＮＤ２−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰおよび／またはｐＫＣＮＤ２（Ｎ５８７ｆｓＸ）−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰで、翌日にトランスフェクトした。パッチクランプ解析のために、ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間後、ポリリジンでコートしたカバースリップ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ Ｃｏ．，日本、東京）の上にまいた。 ２−Ｃ パッチクランプ解析 倒立顕微鏡（ＩＸ７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本、東京）を使用して、ＧＦＰ陽性のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、電気的記録のために選択した。スペースクランプの問題を最小限にするために、融合細胞（ｓｙｎｃｙｔｉａ）のＧＦＰ陽性細胞は考慮に入れず、そして強い蛍光の細胞のみを選択した。外部の溶液はＮａＯＨでｐＨ７．４に調節し、そして以下を（ｍＭ）で含有する：ＮａＣｌ、１３５；ＫＣｌ、４．０；ＣａＣｌ２、１．０；ＭｇＣｌ２、２．０；グルコース、１０；およびＨｅｐｅｓ，１０。ピペット電極は、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（内径０．８−１．０ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ ＧｍｂＨ、ドイツ、マルスフォード）から、多工程水平プラー（Ｐ−９７、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．カナダ、ノボト）を使用して作成した。ピペット溶液はＫＯＨでｐＨ７．２に調節し、そして以下からなる（ｍＭ）：ＫＣｌ、１３５；ＭｇＣｌ２、１．０；ＥＧＴＡ、１０；グルコース、５．０；およびＨＥＰＥＳ、１０。内部ピペット溶液で満たしたとき、ピペット抵抗は１．０−３．５ＭΩであった。一角（ｖｅｒｙ ｔｉｐ）を除いて、ピペットの外壁は、浮遊容量を減少するため歯科用ワックスでコートした（ＧＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本、東京）。参照電極は、１５０ｍＭ ＮａＣｌで満たされた寒天橋を使用した槽につながった、壁内のＡｇ−ＡｇＣｌペレットであった。電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ 増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カナダ、バーリンゲーム）を使用して記録した。電流シグナルおよび電圧シグナルは、１０ｋＨｚの周波数でカットするｌｏｗ−ｐａｓｓ Ｂｅｓｓｅｌ ｆｉｌｔｅｒを使用してフィルターをかけ、Ｖ４５０ＪＳ２（Ｉｉｙａｍａ、日本、名古屋）のハードディスクに保存した；“ｐｃｌａｍｐ８．０”ソフトウエアを終始使用した（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カナダ、バーリンゲーム）。すべてのパルスプロトコルの値を、コンピューターでプログラムした。細胞の電気容量を、“ｐｃｌａｍｐ８．０”ソフトウエアを使用して計算した。容量性の電流および直列抵抗を、電気的に補った。すべての実験を、室温（２２℃）で行った。電流密度の比較のため、Ｋ＋過渡電流のピーク振幅を計測し、総細胞電気容量に対して標準化した。 細胞全体の設定を導入した後、保持電流（ｈｏｌｄｉｎｇ ｃｕｒｒｅｎｔ）が＜２００ｐＡのときに、記録を始めた；これは日常的に５分間の細胞内潅流を必要とした。図４は、Ｋ＋過渡電流（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｋ＋ ｃｕｒｒｅｎｔ）が野生型Ｋｖ４．２チャネルの細胞で、−８０ｍＶの保持電位から脱分極電圧ステップ（−７０から７０ｍＶ）により引き出されることを示した。Ｋ＋過渡電流は２５ｍｓ以内にピークに達し、そして次第に不活性化した。外因性のＫ＋過渡電流は、トランスフェクトされないＨＥＫ２９３細胞でＫ＋過渡電流が存在しないことにより確認された。ｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸ突然変異チャネルを発現する細胞において、同様のＫ＋過渡電流が観察され（データは示さない）、そして突然変異チャネルの表面の発現レベルもまた野生型チャネルレベルと同様であった（データは示さない）。また、保持電位の−８０ｍＶでは、いずれをトランスフェクトした細胞でも、Ｋ＋過渡電流は観察されなかった。しかしながら、ｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸチャネルの細胞により表わされた電流密度は、野生型チャネルを持つ細胞の電流密度よりも有意に低かった。具体的には、ＫＣＮＤ２タンパク質の電流密度の値が、変異を有しない場合と比較して、電位が例えば、０ｍＶの際に約６６％（７５→２５ｐＡ／ｐＦ）、４０ｍＶの際に約７０％（１９０→６０ｐＡ／ｐＦ）減少した（図３）。野生型チャネルおよびｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸチャネルの両方を発現する細胞において、電流密度は野生型チャネルまたは突然変異チャネルのどちらかで記録された値の間に収まった（図３）。 実施例３ ＫＣＮＤ２一部切除突然変異の発端者 発端者 ｃ．２７２３＿２７２７ｄｅｌＡＡＡＣＴ（Ｎ５８７ｆｓＸ）突然変異を持つ３１歳女性の発端者は、１３歳に始まった医学的に難治性な発作の複雑な病歴を有する。前兆はなく、彼女の発作の型はけいれん発作（ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎ）および口の自動症を伴う複雑な部分発作から、全身けいれん（ｓｐａｓｍ）に続く静止した凝視および口の自動症の範囲に及んだ。バルプロエート（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）療法およびカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）療法で非常に限られた発作調節しか観察されないように、てんかんは顕著に薬剤耐性がある。発作の完全な休止は、立て続けの２回の外科的治療行為の後、２８歳の時にはじめて達成された。 標準ＥＥＧ（脳波図）解析は、てんかん発作性の放電が左前方側頭領域から右側へ広がることを示した。これらの研究および脳磁図（ｍａｇｎｅｔｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｐｈｙ）法を使用した他の機能的研究は、左側頭領域がてんかん発生に関わるとするが、神経イメージングデータは注目に値するものではなかった。従って、進入性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）頭蓋内のＥＥＧ評価は、変則の放電活性の源として左中央基底（ｍｅｓｉｏ−ｂａｓａｌ）側頭領域の地図を描くために使用した。実際に、１１の記録された発作すべては、左中央基底側頭領域で始まった。 これらの所見は、２７歳の時の、扁桃体および海馬は切除するが側頭新皮質には触れない選択的左扁桃対−海馬切除（ａｍｙｇｄａｌｏ−ｈｉｐｐｏｃａｍｐｅｃｔｏｍｙ）によっててんかん発生組織を切除するための最初の試みを容易にした。不幸なことに、解決困難な発作が手術後６か月に再発し、それはてんかん発作性活性を最終的に根絶するために第二のより大規模な外科的医療行為、即ち左前方側頭葉切除（ｌｅｆｔ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅｃｔｏｍｙ）を必要とした。 考察 近心（ｍｅｓｉａｌ）ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）は、ヒトてんかんの最も一般的な型としてしばしば引用され、そしててんかん患者で単一の最も頻繁に遭遇するてんかん発生障害因子である海馬硬化症とほとんど不変に同時に生じる（非特許文献５）。放電が中央基底構造から生じる電気診断的発見とともに、発端者により表わされる臨床上の徴候がｍＴＬＥの診断と一致するが、発端者から切除した組織において明白な病変は明らかでなかった。これは逆説的であるように思われるが、家族性ｍＴＬＥで無症候性の一等親血縁者におけるそのような異常な特性の発見により認められたように（非特許文献６）、海馬の萎縮は直接的に明白なてんかん症状に関係はない。それにもかかわらず、患者の左前方側頭葉切除後３年間発作なしのままであるという外科的に治療できる成果が、てんかん発生に重要で、切除された組織内に生来の、基礎を成すある病理を示す。 発端者の無症候性の父親は、リンパ球のゲノムＤＮＡにヘテロのＮ５８７ｆｓＸ突然変異も有していた。ほとんどのてんかんは遺伝の複雑な形態を有し、そしてこれはおそらく、今では発生的要因、環境的要因、および遺伝的要因の多因子性の病因を有すると信じられている（非特許文献５）、ＴＬＥについても当てはまるであろう。多くの変異因子の相互作用がしばしば不完全な浸透度に至り、そしてこのことが発端者の無症候性の父親のＮ５８７ｆｓＸ突然変異の発見の説明になるかもしれない。同様に、父親と発端者の間の表現型の食い違いは、表現度の差異、即ち、父親はより重大でなく、臨床診断を逃れることができた表現型の形を有することができたことの指標になるかもしれない。このようなばらつきは、突然変異ｍＲＮＡ対正常ｍＲＮＡの発現レベルが、表現型に影響されたまたはされない個人で異なって調節されることによる、対立遺伝子不均衡からしばしば生じる。重要なことに、対立遺伝子不均衡は少なくとも１つのチャネル病（ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｙ）について記載され（非特許文献７）、そしてここにおいて役割を果たしているかもしれない。他の可能性はモザイク現象（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）、即ち父親のＮ５８７ｆｓＸ突然変異はある細胞系列に限られるのかもしれないことを含む。ヘテロの、早まったストップコドン（ＴＧＡ）を生じるフレームシフトを起こすＫＣＮＤ２の５塩基対欠失、ｃ．２７２３＿２７２７ｄｅｌＡＡＡＣＴ、はＴＬＥの発端者で同定された。無症候性の父親もまた、この突然変異のヘテロであった。アミノ酸５８７−６３０を欠く一部切除Ｋｖ４．２タンパク質を産生することが予想された、Ｎ５８７ｆｓＸアミノ酸変化に対応する５塩基欠失。電位依存型カリウムチャネル電流を、野生型ヒトＫｖ４．２チャネルのみ（ＷＴ）、ＷＴ及び突然変異Ｋｖ４．２（ＷＴ＋ｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸ）チャネル、並びに突然変異Ｋｖ４．２チャネルのみ（ｄｅｌＡＡＡＣＴ＿Ｎ５８７ｆｓＸ）を発現するＨＥＫ２９３から記録した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＫ＋電流の電流−電圧の関係。突然変異Ｋｖ４．２タンパク質のみを発現する細胞は、ＷＴチャネルでの細胞に比べて有意に（ｐ＝１．４９ｘ１０−５）低い電流密度を示す。データの要点は、プールされたデータの平均電流密度を表わす。ＷＴチャネルの電位依存型カリウム過渡電流。電流を、−８０ｍＶの保持電流から脱分極工程（−７０ｍＶから７０ｍＶ、により引き起こした。パルスインターバル１５秒）により引き起こした。 ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法であって、 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出することを含む、上記方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表わされる請求項１の方法。 ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる塩基配列の変異の結果が、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スプライシングサイト形成もしくは欠失、トランケート形成のいずれが生じる、請求項１または２の方法。 ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異が、ヒトＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能を低下させるか実質的に失わせる変異である、請求項１ないし３のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位が、最もＣ末端側の膜貫通セグメントの直後のアミノ酸をコードするコドンよりも３’側である、請求項１ないし４のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位が、配列番号２の５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸をコードするコドンであるか、あるいはそれよりも３’側である、請求項１ないし５のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異が、配列番号２の５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸からＣ末端側のアミノ酸配列をすべて欠如させる変異である、請求項１ないし６のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位が、フィラミンへの相互作用モチーフ、ＭＡＰ／ＥＲＫリン酸化部位、またはＰＳＤ９５結合ドメイン、から選択される１つまたは複数の部分をコードする領域内に存在するまたは同領域を含む、請求項１ないし７のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位が、配列番号２の５８７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸をコードするコドンである、請求項１ないし８のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の変異を生じる部位が、配列番号１の２７２３ないし２７２７番目に相当する塩基配列のＡＡＡＣＴである、請求項１ないし９のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異が、配列番号１の２７２３ないし２７２７番目に相当する塩基配列のＡＡＡＣＴが欠失する変異である、請求項１０の方法。 ヒトてんかんが、症候性てんかん群に含まれるてんかんである、請求項１ないし１１のいずれか１つの方法。 ヒトてんかんが、側頭葉てんかんである、請求項１２の方法。 ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を検出する工程が、塩基配列決定、核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション、電気泳動、制限酵素処理のいずれかの手法、あるいはこれらの組み合わせを用いて行われる、請求項１ないし１３のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を検出する工程が、血液、毛、または頬由来の試料中のゲノムＤＮＡの塩基配列を調べることを含む、請求項１ないし１４のいずれか１つの方法。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異が存在する場合に、てんかんの遺伝的素因を有すると判断することをさらに含む、請求項１ないし１５のいずれか１つの方法。 請求項１ないし１６のいずれか１つの方法に使用するための、プライマー。 請求項１ないし１６のいずれか１つの方法に使用するための、プローブ。 請求項１ないし１６のいずれか１つの方法に使用するための、核酸チップ。 ヒトてんかんの遺伝的素因を検出するためのキットであって、 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を生じさせる変異を検出するための、プライマー、プローブおよび／または核酸チップを含む前記キット。 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異を有する、核酸。 ＫＣＮＤ２遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部の改変により、ＫＣＮＤ２タンパク質の生物学的機能の一部または全部が不活性化されているヒトてんかんモデル用の、非ヒトノックアウト哺乳動物。 ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法であって、 ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列またはその発現の制御配列において、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子またはそのタンパク質の発現量に変化を生じさせる変異の存在を検出することを含む、上記方法。 【課題】 本発明は、ヒトてんかんの遺伝的素因を検出する方法を提供することを目的とする。【解決手段】 本発明の方法は、ヒトのＫＣＮＤ２遺伝子の塩基配列において、ヒトのＫＣＮＤ２タンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる変異の存在を検出することを含む。【選択図】 なし配列表