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上松 聖典 北岡 隆 佐々木 均 中嶋 幹郎 手嶋 無限 JP 2007106704 公開特許公報(A) 20070426 2005299760 20051014 硝子体可視化剤 国立大学法人 長崎大学 504205521 高島 一 100080791 上松 聖典 北岡 隆 佐々木 均 中嶋 幹郎 手嶋 無限 JP 2005268831 20050915 A61K 45/00 20060101AFI20070330BHJP A61P 27/02 20060101ALI20070330BHJP A61K 9/08 20060101ALI20070330BHJP A61K 31/542 20060101ALI20070330BHJP A61K 31/433 20060101ALI20070330BHJP A61K 9/16 20060101ALI20070330BHJP A61K 9/14 20060101ALI20070330BHJP JPA61K45/00A61P27/02A61K9/08A61K31/542A61K31/433A61K9/16A61K9/14 11 ＯＬ 11 特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年９月１日 第５９回日本臨床眼科学会発行の「第５９回 日本臨床眼科学会」に発表 4C076 4C084 4C086 4C076AA11 4C076AA30 4C076AA31 4C076BB11 4C076CC10 4C084AA17 4C084MA16 4C084MA41 4C084MA43 4C084MA66 4C084NA14 4C084ZA33 4C086AA10 4C086BC85 4C086CB29 4C086MA01 4C086MA04 4C086MA16 4C086MA41 4C086MA43 4C086MA66 4C086NA14 4C086ZA33 4C086ZC20 本発明は、硝子体可視化剤に関する。 硝子体切除術は、多くの眼疾患を治療する上で不可欠な手術手技である。当該手術は、透明な硝子体を見極めながら切除する（図１ａ）ため、熟練を要する上、いかに硝子体を残さず切除するかが問題となる局面が多く（図１ａ）、難易度の高い手術であった。 ２００１年頃より、硝子体切除術時にトリアムシノロンアセトニド（ケナコルト、登録商標）を硝子体腔内に投与して硝子体を可視化する手技が普及し始めた。この手技は、トリアムシノロンアセトニドを投与することにより、硝子体に当該薬剤の白い粒子を付着させ、透明な硝子体の辺縁を白く浮かび上がらせ、硝子体と眼房水及び眼内灌流液とを明確に区別する方法であり、これにより硝子体手術が従来よりも容易かつ安全になった（図１ｂ）。 しかし、トリアムシノロンアセトニドは、ステロイド製剤であり、副作用も多く、特に眼圧上昇と易感染性が問題になっている。眼圧上昇の例としては、トリアムシノロンアセトニドを硝子体内に注射した場合の合併症として、黄斑変性において３０％に高眼圧が出現したという報告（非特許文献１）や、網膜静脈閉塞に伴う黄斑浮腫においては７８％に高眼圧が出現し、そのうち１１％で手術が必要だったという報告（非特許文献２）などがある。易感染性の例としては、硝子体への注射での眼内炎の発生頻度は０．３８％であったという報告（非特許文献３）がある。硝子体切除術時にトリアムシノロンアセトニドを使用した場合の眼内炎の発生頻度は低いといえるが（非特許文献４）、硝子体内への注射では眼内炎の頻度は高く、眼内にステロイドが存在する時点で、感染症には十分に注意する必要があった。Wingate RJ, Beaumont PE: Aust N Z J Ophthalmol. 1999;27:431-432.Sushmita K, Vishali G, Amod G et al: Am J Ophthalmol. 2004;137:758-760.Moshfeghi DM, Kaiser PK, Scott IU et al: Am J Ophthalmol. 2003;136:791-796.Sakamoto T, Enaida H, Kubota T et al: Am J Ophthalmol. 2004;138:137-138. 本発明の目的は、眼疾患治療時に用いる、安全で副作用の少ない硝子体可視化剤及び可視化方法を提供することである。 本発明者らは、前記課題の解決について研究を重ねた結果、炭酸脱水素酵素阻害剤が、硝子体可視化剤として利用できることを見出し、かつ副作用も低減できることを確認して本発明を完成させるに至った。 すなわち、本発明は以下のとおりのものである。（１）炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物を含有する硝子体可視化剤。（２）液剤である（１）記載の硝子体可視化剤。（３）散剤又は顆粒剤である（１）記載の硝子体可視化剤。（４）炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物がブリンゾラミド、アセタゾラミド及びその塩である（１）〜（３）いずれか１つに記載の硝子体可視化剤。（５）糖尿病網膜症、網膜剥離、増殖硝子体網膜症、硝子体出血、黄斑円孔、加齢黄斑変性、黄斑上膜、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、外傷性眼疾患、眼内炎、眼内異物、前部硝子体切除術、白内障手術、緑内障手術、眼内レンズ挿入術、又は眼内レンズ逢着術の手術時に用いられる（１）〜（４）いずれか１つに記載の硝子体可視化剤。（６）（３）記載の硝子体可視化剤、及び水性媒体を別々の容器に含んでなる、硝子体可視化用キット。（７）（１）〜（５）いずれか１つに記載の硝子体可視化剤又は（６）に記載のキットを用いることを特徴とする硝子体を可視化する方法。（８）硝子体可視化剤を製造するための炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物の使用。（９）炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物を含有する、眼疾患の改善のための硝子体内注射用組成物。（１０）眼疾患が眼圧上昇又は黄斑浮腫である（９）記載の注射用組成物。（１１）（１）〜（５）いずれか１つに記載の硝子体可視化剤、及び当該硝子体可視化剤を硝子体を可視化するために使用することができること、又は使用すべきであることを記載した当該硝子体可視化剤に関する記載物を含む商業用パッケージ。（１２）（９）又は（１０）記載の組成物、及び当該組成物を眼疾患の改善に使用することができること、又は使用すべきであることを記載した当該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。 本発明の硝子体可視化剤は、硝子体処置時において、硝子体の視認性に優れ、処置後の眼圧上昇を有意に抑制する。高眼圧症や易感染症などの副作用もない。 本発明のキットは、硝子体処置時に、硝子体可視化剤を液剤に用時調製するために供されるものであり、可視化剤の長期安定性と利便性とを兼ね備えるものである。 本発明の硝子体を可視化する方法は、硝子体処置時において、硝子体を容易に可視化するとともに、処置後の眼圧上昇を有意に抑制できる。高眼圧症や易感染症などの副作用も伴わない。 本発明の注射用組成物は、即効性の眼疾患の改善作用を有する。 本発明において硝子体可視化とは、硝子体と眼房水及び眼内灌流液との境界を明確にさせ、硝子体を視認可能にすることを意味する。硝子体可視化剤とは、上記の目的のために用いるものであり、手術時に注射等で硝子体腔内に注入し、手術の確実性を高めるものである。 炭酸脱水素酵素とは、を可逆的に触媒する酵素である。炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物とは、炭酸脱水素酵素を阻害して、利尿作用又は眼圧低下作用を示す化合物である。眼圧下降の作用機序は毛様体における炭酸脱水素酵素抑制に起因する房水分泌抑制である。 本発明の炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物としては、例えば、アセタゾラミド、ブリンゾラミド、ドルゾラミドが挙げられる。好ましくは、アセタゾラミド又はブリンゾラミである。前記化合物は、市販品、又は自体公知の方法により製造したものを使用することが可能である。 本発明において使用するアセタゾラミド、ブリンゾラミド等は、塩の形態で使用することもできる。塩の形態には金属塩、アンモニウム塩、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩等を挙げることができるが、難水溶性の塩を選択することが好ましい。 前記化合物は、水に対して溶解性が低いものが望ましい。通常、水に溶かした時に懸濁状態になるものが望ましい。可視化剤として機能を果たすためには、水に対する溶解度が、１ｍｇ／ｍＬ以下のものが望ましい。 本発明の硝子体可視化剤中の前記化合物の含有量は、０．００１〜１００重量％であり、好ましくは、０．０１〜１重量％である。 本発明の硝子体可視化剤中の前記化合物は、少なくとも１種を含んでいればよく、２種以上を混合して含んでいてもよい。 本発明の硝子体可視化剤は、液剤の形態でもよい。液剤は、前記化合物に薬学的に許容されうる添加剤を加えて、自体公知の方法で製造することができる。 また本発明の硝子体可視化剤は、散剤又は顆粒剤の形態であってもよい。前記化合物をそのまま、又は、本発明の目的の効果を損なわない範囲内で、前記化合物に薬学的に許容されうる添加剤を加えて、自体公知の方法で粉末又は微粒状とすることにより、散剤又は顆粒剤とすることができる。これらの散剤又は顆粒剤は、硝子体投与の便宜の観点から、使用時に、滅菌精製水、生理食塩水、眼内灌流液等の水性媒体で液剤に調製して硝子体に投与することが望ましい。 本発明は、前記散剤又は顆粒剤、及び前記水性媒体を別々の容器に含む硝子体可視化用キットを提供する。 本発明の硝子体可視化剤の投与形態は、注射投与、とりわけ注射による局所投与が望ましい。 本発明の硝子体可視化剤の投与量は、投与する患者の症状、特に眼の状態、年齢、投与方法等によって異なるが、硝子体可視化剤を硝子体腔内に投与して、硝子体が視認出来得る量であればよい。炭酸脱水素酵素阻害を有する化合物は、硝子体手術時に、通常０．０１〜１ｍｇを投与すると硝子体が視認できる。好ましくは、０．０４〜０．４ｍｇの投与である。これを硝子体腔内（体積は約４ｍｌ）に均等に拡散した場合の濃度に換算すると、通常は０．００２５〜０．２５ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌに該当する。例えば、アセタゾラミド１０ｍｇ／ｍｌを１回あたり１眼に１００μｌを硝子体腔内に投与することにより、硝子体腔内のアセタゾラミドの濃度は０．２５ｍｇ／ｍｌになり、硝子体を視認可能にすることができる。 本発明の硝子体可視化剤の使用対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスなど、眼疾患に罹患し得る任意の動物とする。 本発明における硝子体手術とは、硝子体自体に障害があり該硝子体を切除する手術及び眼疾患を治療する上で硝子体を切除しなければならない手術を意味する。 本発明の硝子体可視化剤を適応できる眼疾患としては、網膜はく離、眼内炎、硝子体出血、硝子体混濁、糖尿病網膜症、増殖性硝子体網膜症、増殖糖尿病網膜症、黄斑部疾患（黄斑円孔、黄斑前膜、黄斑浮腫、加齢黄斑変性）、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症などが挙げられる。好ましくは、網膜はく離、黄斑部疾患又は糖尿病網膜症である。 本発明の硝子体可視化剤を硝子体腔内に投与した場合、硝子体を切除しても、手術後眼内に残留した硝子体可視化剤が炭酸脱水素酵素阻害作用を有するため、頻度の高い術後合併症である高眼圧症を抑制することができる。さらに、本発明の硝子体可視化剤にはトリアムシノロンアセトニドに見られる易感染性の副作用はなく、トリアムシノロンアセトニド使用による術後感染症の潜在的な危険性を回避できる。 本発明の硝子体内注射用組成物は、前記炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物を含有する。眼疾患、特に眼圧上昇又は黄斑浮腫に対して、硝子体内に局所注射することにより、即効性を有し、経口投与により認められる副作用を回避することができる。 以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。 （実験１） 屠殺されたブタの眼球から硝子体を摘出し標本ビンに入れ、ブリンゾラミド（エイゾプト（登録商標）点眼液）１０ｍｇ／ｍｌを０．１ｍｌ、アセタゾラミド（シグマ社）１０ｍｇ／ｍｌを０．１ｍｌ投与した。薬剤投与前後の硝子体の視認性を目視で比較した。 結果を、図２に示す。ブタ硝子体は、ブリンゾラミドやアセタゾラミドを投与することにより、白色の粒子が硝子体表面に付着し、可視化されることが明らかになった。（実験２） 培養網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ−１９を、様々な濃度のブリンゾラミド、アセタゾラミド、トリアムシノロンアセトニド（ケナコルト、登録商標）を含む培地で培養し、ＷＳＴ−１ ａｓｓａｙにより５０％細胞生存濃度を求めた。 ＡＰＲＥ−１９細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。培地は１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ ＳｅｒｕｍとＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（５０μｇ／ｍｌ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍを使用し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞をまき、インキュベータで培養した。３日後培地を吸引し、Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）で前記細胞を洗浄し、様々な濃度のアセタゾラミド、ブリンゾラミド、トリアムシノロンアセトニドを含む培地で培養した。３０分後、薬剤含有培地を吸引し、ＨＢＳＳで洗浄し、通常の培地で培養した。３時間後、ＷＳＴ−１試薬（Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１、登録商標）を１０μｌ加え培養した。１時間後、マイクロプレートリーダーでホルマザン色素の吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した。薬剤を含まない培地で培養した細胞における吸光度を１００％として、細胞生存率を算出した。 結果を、図３及び４に示す。 ブリンゾラミドのＡＰＲＥ−１９細胞における細胞生存率は、原液である１％（１０ｍｇ／ｍｌ）製剤では１％であったが、２倍希釈（５ｍｇ／ｍｌ）では１０％に上昇し、４倍希釈（２．５ｍｇ／ｍｌ）では９９％となった。アセタゾラミドでは、１００ｍｇ／ｍｌで３０％、１０ｍｇ／ｍｌで５４％、５ｍｇ／ｍｌで７７％、２．５ｍｇ／ｍｌで８７％、１．２５ｍｇ／ｍｌで９２％となだらかに変化した（図３）。トリアムシノロンアセトニドでは原液である４０ｍｇ／ｍｌ製剤では７％であったが、２倍希釈（２０ｍｇ／ｍｌ）では１０４％となった（図４）。 ブリンゾラミド、アセタゾラミド及びトリアムシノロンアセトニドの今回の実験条件でのＡＰＲＥ−１９細胞における５０％細胞生存濃度は、それぞれ約３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌであった。（実験３） 各薬剤につき、雄性日本白色ウサギ（体重２．５−３．０ｋｇ）３羽３眼を使用した。ウサギを固定具に固定し、ペントバルビタール（ネンブタール、登録商標）静脈注射で全身麻酔後、片眼に対して２７Ｇ鋭針を前房に刺入し前房水を１００μｌ除去し、硝子体内に２７Ｇ鋭針にて薬剤１００μｌを注射した。ブリンゾラミド（エイゾプト、登録商標）、アセタゾラミド（シグマ社）及びトリアムシノロンアセトニド（ケナコルト、登録商標）の濃度は、実験２から算出した５０％細胞生存濃度、それぞれ３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌを用いた。コントロールとしては、生理食塩水を注射した。 処置前、処置後６時間、１日、３日、７日後に眼圧測定、眼底検査、網膜電位（ＥＲＧ）の測定を行った。まず塩酸オキシブプロカイン（ベノキシール、登録商標）にて点眼麻酔後、開瞼器で開瞼し、電子眼圧計（トノペンＸＬ、登録商標）にて眼圧を測定した。眼圧測定は各時点で３回行い、平均値を測定値とした。次に散瞳剤であるトロピカミド・塩酸フェニレフリン（ミドリンＰ、登録商標）を点眼し、ペントバルビタールで全身麻酔し、２０分間暗順応させ、ポータブルＥＲＧ（ＬＥ−２０００、登録商標）でＥＲＧを測定した。フラッシュＥＲＧを４回加算平均し、ａ波、ｂ波の潜時と振幅を測定した。その後、倒像鏡にて眼底検査を行い、眼底写真を撮影した。全検査終了後、ペントバルビタール過剰投与でウサギを屠殺し、眼球摘出を行い、組織標本を作製した。 眼圧、ＥＲＧの値はｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔにて検定し、投与前の値と比較した。 結果を、図５〜７に示す。 ＥＲＧは各波の潜時と振幅を計測することで網膜障害を鋭敏に判定できる。ウサギＥＲＧａ波はヒトと同様に視細胞に発生母体を有し、視細胞活動を反映する。ｂ波はグリア細胞の活動を主に反映するとされ、さらに双極細胞の電気活動関与も考えられている。今回の実験ではすべての薬剤においてＥＲＧａ波、ｂ波の潜時、振幅に変化はなく、網膜機能障害を認めなかった（図５、６）。 眼圧はトリアムシノロンアセトニドでは投与前後で変化はなかった。ブリンゾラミドとアセタゾラミドでは投与後６時間で投与前より有意に眼圧下降を認め、さらに術後１日以降の眼圧が安定していることを認めた。その他の測定時点では有意差はなかった（図７）。 眼底検査では、すべての薬剤において投与後に網膜、視神経、脈絡膜に異常はなく、眼内の炎症所見等の異常所見はみられなかった。眼組織を光学顕微鏡にて観察したところ、毛様体や網膜に細胞の変性や壊死、炎症細胞の遊走などの異常所見はなかった。 これらの結果から今回の条件での炭酸脱水素酵素阻害剤の眼組織における安全性が確認できた。さらに硝子体可視化剤として使用した炭酸脱水素酵素阻害剤が術後高眼圧を抑制する可能性が示された。硝子体切除術の模式図である。ａはトリアムシノロンアセトニド投与前を示し、ｂは投与後を示す。ブタ硝子体を示す図である。ａは、ブリンゾラミド投与前を示し、ｂは投与後を示す。ＡＰＲＥ−１９細胞の細胞生存率（炭酸脱水素酵素阻害剤）を示す図である。ＡＰＲＥ−１９細胞の細胞生存率（トリアムシノロンアセトニド）を示す図である。ＥＲＧａ波の潜時及び振幅を示す図である。図中、各４組の棒グラフは、左から順に生理食塩水、トリアムシノロンアセトニド３０ｍｇ／ｍｌ、ブリンゾラミド３ｍｇ／ｍｌ、アセタゾラミド１０ｍｇ／ｍｌを示す。ＥＲＧｂ波の潜時及び振幅を示す図である。棒グラフの表示は図５と同様。眼圧を示す図である。棒グラフの表示は図５と同様。 炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物を含有する硝子体可視化剤。 液剤である請求項１記載の硝子体可視化剤。 散剤又は顆粒剤である請求項１記載の硝子体可視化剤。 炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物がブリンゾラミド、アセタゾラミド又はその塩である請求項１〜３いずれか１項に記載の硝子体可視化剤。 糖尿病網膜症、網膜剥離、増殖硝子体網膜症、硝子体出血、黄斑円孔、加齢黄斑変性、黄斑上膜、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、外傷性眼疾患、眼内炎、眼内異物、前部硝子体切除術、白内障手術、緑内障手術、眼内レンズ挿入術、又は眼内レンズ逢着術の手術時に用いられる請求項１〜４いずれか１項に記載の硝子体可視化剤。 請求項３記載の硝子体可視化剤、及び水性媒体を別々の容器に含んでなる、硝子体可視化用キット。 硝子体可視化剤を製造するための炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物の使用。 炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物を含有する、眼疾患の改善のための硝子体内注射用組成物。 眼疾患が眼圧上昇又は黄斑浮腫である請求項８記載の注射用組成物。 請求項１〜５いずれか１項に記載の硝子体可視化剤、及び当該硝子体可視化剤を硝子体を可視化するために使用することができること、又は使用すべきであることを記載した当該硝子体可視化剤に関する記載物を含む商業用パッケージ。 請求項８又は９記載の組成物、及び当該組成物を眼疾患の改善に使用することができること、又は使用すべきであることを記載した当該組成物に関する記載物を含む商業用パッケージ。 【課題】眼疾患治療時に用いる、安全で副作用のない硝子体可視化剤および可視化方法を提供することである。【解決手段】炭酸脱水素酵素阻害作用を有する化合物を含有する硝子体可視化剤および可視化方法。【選択図】なし

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