生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_新規大腸菌及びタウロピンデヒドロゲナーゼの製法 |
| 出願番号： | 2005286946 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | C12N 1/21,C12N 15/09,C12N 9/06 |
特許情報キャッシュ
菅野 信弘 長久 英三 横山 雄彦 佐藤 實 木村 朋寛 山口 敏康 中野 俊樹 JP 2007089538 公開特許公報(A) 20070412 2005286946 20050930 新規大腸菌及びタウロピンデヒドロゲナーゼの製法 学校法人北里学園 598041566 国立大学法人東北大学 504157024 鈴木 定子 100078042 岡田 希子 100107799 菅野 信弘 長久 英三 横山 雄彦 佐藤 實 木村 朋寛 山口 敏康 中野 俊樹 C12N 1/21 20060101AFI20070316BHJP C12N 15/09 20060101ALI20070316BHJP C12N 9/06 20060101ALI20070316BHJP JPC12N1/21C12N15/00 AC12N9/06 Z 5 ＯＬ 8 特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年４月１日 ２００５（平成１７）年度日本水産学会大会独立行政法人水産総合研究センター中央水産研究所発行の「２００５年（平成１７年）度 日本水産学会大会『日本農学大会水産部会』 講演要旨集」に発表 4B024 4B050 4B065 4B024AA03 4B024BA08 4B024CA04 4B024CA20 4B024DA06 4B024EA04 4B050CC03 4B050DD11 4B050EE02 4B050EE03 4B050LL01 4B065AA26X 4B065AA90Y 4B065AB01 4B065AC15 4B065BA02 4B065BB15 4B065BB37 4B065BC03 4B065BD01 4B065CA28 4B065CA44 本発明は、タウロピンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組込んだ組換えベクタープラスミド遺伝子を含む新規な遺伝子組換え大腸菌及びこの大腸菌を用いたタウロピンデヒドロゲナーゼの製法に関する。 タウロピンは、海産無脊椎動物から得られるイミノ酸であり、タウリンとピルビン酸からタウロピンデヒドロゲナーゼの作用により生体内で生成されている。タウリンは、日本薬局方に掲載されている医薬品であり、その効果としては、(1) 血圧降下作用、(2) 総コレステロール値の低下、善玉コレステロール値の増加、(3) 肝臓病の予防及び治療、(4) 心不全の治療、(5) 気管支喘息に有効、などが挙げられる。タウリンを多く含有する食品としては、カキ、ハマグリ、シジミ、タコ、イカ、アサリ等が挙げられる。 タウロピンは、ピルビン酸と他のアミノ酸又はタウリンがアミノ基を共有する形で結合したオピン類に属する。オピンとしては、タウロピンの他、アルギニンと結合したオクトピン、グリシンと結合したストロンビン、アラニンと結合したアラノピン、β−アラニンと結合したβ−アラノピンが知られている。これらは海産無脊椎動物の嫌気的呼吸の産物であると推測されている。非特許文献１には、セグロイソメのタウロピンデヒドロゲナーゼの全塩基配列が記載されている。Marine Biotechnology 6,493-502(2004) タウリンは上記の通り、海産無脊椎動物に多く含まれる健康機能性物質であるが、その定量にあたってはアミノ酸分析計で測定している現状であり、簡便な方法がない。更に、タウロピンデヒドロゲナーゼの調製には、天然物より蛋白質を抽出、精製する方法があるが、この方法では大量の天然物を必要とし、抽出、精製中に活性を失いがちであり、効率的に大量に抽出することが困難であった。 そこで、本発明者らはタウロピンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌のプラスミドに組込むことを試みた。組込むにあたり、ｐＴＶ１１８Ｎベクター（タカラバイオ社製）を用いたため、遺伝子を多少改変する必要が生じた。 又、大腸菌等の宿主内で外来蛋白質を大量に生産する場合には、分子シャペロンなどによる翻訳産物の折りたたみが正常に機能しないため、外来蛋白質の不活性体の塊、いわゆる封入体が形成されることが多い。封入体は目的物の三次元構造が変化したものであり、目的物本来の活性に悪影響が現れる。したがって、このような封入体が形成されない製造方法が求められる。 本発明の構成は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６０９として受領された新規大腸菌であり、セグロイソメ（Arabella iricolor ) 由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を加工し、タウロピンデヒドロゲナーゼ生成能を阻害することなく、プラスミドに挿入した組換えベクタープラスミド遺伝子を有する大腸菌であり、この大腸菌は配列表１に記載するタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する。また、セグロイソメ（Arabella iricolor ) 由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を、ｐＴＶ１１８Ｎベクター（タカラバイオ社製）に組込んで、大腸菌ＪＭ１０９に挿入した遺伝子組換え大腸菌であり、この大腸菌を培養し、得られた培養物からタウロピンデヒドロゲナーゼを採取して、精製することを特徴とする。 本発明は、タウリンとピルビン酸からタウロピンを合成する酵素であるタウロピンデヒドロゲナーゼ、すなわち環形動物のセグロイソメ（Arabella iricolor ) のタウロピンデヒドロゲナーゼ（以下、Ａｉｒ ｔａｄｈとする）を大量に製造できる技術である。Ａｉｒ ｔａｄｈをコードしたアミノ酸配列を維持した状態で、ｐＴＶ１１８Ｎベクター（タカラバイオ社製）に組込むことにより、Ａｉｒ ｔａｄｈを大量に製造する技術を完成した。このＡｉｒ ｔａｄｈを用いると生体成分中のタウリン或いはピルビン酸を簡単に測定することができる。すなわち、タウリンとピルビン酸のみが特異的にタウロピンになるため、これを定量することは容易である。この大腸菌はＦＥＲＭ ＡＰ−２０６０９として受領してある。 本発明により、タウロピンデヒドロゲナーゼを大量に製造することが可能になった。タウリンは種々の生物活性を有する健康機能性物質であり、タウロピンデヒドロゲナーゼを使用することによりタウリンを簡易な方法で定量することができる。 更に、タウロピンは天然物ではその量が微量であったため、その生理活性が充分に研究されていなかったが、本発明によりその有効性を究明できる可能性がある。 タウロピンデヒドロゲナーゼを使用するタウリンの定量方法は以下の通りである。タウリン、ピルビン酸、本発明のＡｉｒ ｔａｄｈ、補酵素ＮＡＤＨを０．１〜０．５Ｍのリン酸緩衝液に溶解する。補酵素ＮＡＤＨは３４０ｎｍの紫外部を吸光する。Ａｉｒ ｔａｄｈによるタウリンとピルビン酸の反応により補酵素ＮＡＤＨは酸化されてＮＡＤとなり、３４０ｎｍの吸光度が低下する。この低下の程度を測定してタウリン又はピルビン酸の含有量に換算することができる。これはタウリンとピルビン酸のみに特徴的な反応であるため、煩瑣な前処理や長時間を要するアミノ酸分析計による従来の測定法を顕著に改良する。 本発明は、環形動物のセグロイソメ（Arabella iricolor ) のＡｉｒ ｔａｄｈをコードする遺伝子を、適切な制限酵素で切断した発現用ベクター中に連結することによって調製する。 組換えプラスミドに挿入した実際の遺伝子配列は配列表に示す通りである。配列表における１番目から４４番目迄及び１２４５番目から最後迄は本発明の発現ベクターの部分である。 本発明における組換えベクタープラスミド遺伝子としては、プラスミド、コスミド、人工染色体又はファージ等が挙げられる。更に、本発明における組換えベクタープラスミド遺伝子は、本発明の遺伝子で形質転換された大腸菌を選択できるような１以上の選択マーカーを含むもであってもよい。このような選択マーカーの例として、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等の構成物質が挙げられる。 本発明において、組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現させるプロモーター又は他の制御配列が本発明の遺伝子に連結されていることが好ましい。他の制御配列としては、例えば、細菌発現用のリボゾーム結合部位、転写終止配列、上流制御領域、エンハンサー、オペレーターである。このようなプロモーター又は他の制御配列は、本発明の遺伝子を発現させるものであれば特に制限されることなく、当該分野において既知のものが使用できる。具体的には、Ｔ７プロモーター、Ｔａｃプロモーター等が挙げられる。組換えベクターは、上記制御配列に加えて、蛋白質の発現を調節できる調節配列を含むことが好ましい。 Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子が挿入されたプラスミドの調製方法としては、周知の方法を利用することができる。本発明の遺伝子は通常知られている方法により合成することができる。ベクターに組込むため、適切な制限酵素の切断部位を両末端に配置させて、プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅することが好ましい。ＰＣＲ反応の条件は、当業者が適宜決定することができるが、９８℃で３０秒間の変成、５７℃で１５秒間のアニーリング、７４℃で３０秒間の重合を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅された遺伝子を得ることができる。 本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を組換えベクターに挿入するためには、上記のベクターに適切な制限酵素を作用させる。制限酵素としては、挿入されるＤＮＡ断片とライゲーションし得るものであれば、いずれも用いられる。制限酵素による消化反応の反応温度、反応時間等の条件は選択した酵素に応じて設定することができる。また、これらのベクターを必要とあればボイル法、アルカリＳＤＳ法などの精製手段により精製し、更に、エタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。 前記処理工程において、挿入ＤＮＡ断片とベクターを消化するための制限酵素の組合わせは、この技術分野でのそれ自体公知の組合わせを適宜使用することができる。 次いで、増幅された本発明の遺伝子と前記ベクターを混合し、これにリガーゼを作用させて組換えベクタープラスミド遺伝子を得ることができる。リガーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌由来ＤＮＡリガーゼを挙げることができる。 次いで、本発明の遺伝子を発現させるため、得られた遺伝子を含む組換えベクタープラスミド遺伝子を用いてコンピテントセルを形質転換させる。本発明におけるコンピテントセルとしては、形質転換効率の高いものであれば使用することができる。例えば、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルは形質転換効率も高く、好ましく使用できる。本発明の遺伝子を含む組換えベクタープラスミド遺伝子によるコンピテントセルの形質転換は、通常用いられるケミカルコンピテントセル法、エレクトレポレーション法等を用いることができる。 本発明の遺伝子により形質転換した大腸菌は、そのベクタープラスミド遺伝子が有するマーカー遺伝子により、アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質を含むＬＢ培地寒天プレート上でコロニーを形成するので選択が容易である。しかし、クローニングされた大腸菌が、本発明遺伝子により形質転換されているか否かを確認するため、一部を用いてＰＣＲ法によるインサートの増幅確認、又はシーケンサーを用いたダイデオキシ法による配列解析を行うことが好ましい。 上記方法で得られる本発明により形質転換された大腸菌は、適切な培地で培養し、組換えベクタープラスミド遺伝子を大量に得ることができる。培地としては、通常用いられるＬＢ液体培地、Ｍ９培地等を用いることができる。又、周知の方法を用いて組換えベクタープラスミド遺伝子を回収することができる。中でも、プラスミド回収キット、例えばＷｉｚａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて規定の条件で組換えベクタープラスミド遺伝子を得ることができる。 形質転換体である大腸菌の培地形態は、大腸菌の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培地で行う。工業的にはジャーファーメンター等による通気撹拌培養を行うのが有利である。 培地の栄養源としては、大腸菌の培養に通常用いられているものであれば広く使用することができる。炭素源としては資化可能な炭素化合物であり、グリセリン等のポリオール、ピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。窒素源も利用可能な窒素化合物であり、ペプトン、肉エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、アンモニア若しくはアンモニウム塩等を使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤等も必要に応じて使用できる。又、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等の蛋白質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加することが好ましい。 培養時間は条件によって異なるが、細胞の増殖が定常に達した時点で細胞回収を行うのが好ましい。通常３７℃、１．５〜３．０時間培養、ＩＰＴＧ添加３７℃、２０時間程度の培養である。 培養物中のＡｉｒ ｔａｄｈを回収する方法としては、得られた培養物からろ過、遠心分離等の手段により菌体を採取する。次いで、この菌体を機械的方法、リゾチーム等の酵素を用いた酵素的方法、界面活性剤を用いた化学的処理により破壊して採取することができる。必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤等を添加してＡｉｒ ｔａｄｈを可溶化し、水溶液として採取することもできる。 かくして得られた粗酵素液からＡｉｒ ｔａｄｈを更に精製するには、通常の蛋白質精製法を用いることができる。具体的には、硫安分画法、有機溶媒沈殿法、イオン交換体等による吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動法等の処理を単独又は組合わせて用いることができる。発現用ベクターの作成 Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子は配列決定用ベクターZeroBlunt ＴＯＰＯ（商品名、Invitrogen社製）に組込まれている。 ＮｃｏＩ切断部位を１か所除去するため、配列表２に記載するＰＣＲプライマー、Air m1F と、配列表３に記載するＰＣＲプライマー、Air m1R を合成した。 Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子の組込まれたプラスミドを、テンプレートとしてＰＣＲを行った。上記プライマーには制限酵素Ｃｌａ 1切断部位を含ませており、ＰＣＲ産物の両端をＣｌａ 1で切断後セルフライゲーションを行うことで、アミノ酸配列は変化せず、ＮｃｏＩ切断部位が１か所除去された。 この際のＰＣＲ反応は、９４℃で２分間インキュベートした後、サイクル（９４℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で４分３０秒間）で３０回インキュベートし、最後に４０℃でインキュベートした。 上記配列の本発明の遺伝子、すなわち、Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子を組換えベクターに組込むために、配列表４に記載する制限酵素、ＡｉｒＮｃｏＩを合成し追加した。 変異型Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子をテンプレートとしてＰＣＲを行った。上記ＡｉｒＮｃｏＩプライマーには制限酵素ＮｃｏＩ切断部位を含ませており、テンプレートのプラスミドにはＥｃｏＲ Ｉ切断部位があり、ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲ Ｉで切断することにより、変異型Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子は二つの部分に切断される。二つの中の長い方の断片は両端にＮｃｏＩ切断部位を持ち、短い方の断片は片方にＮｃｏＩ、もう片方にＥｃｏＲ Ｉ切断部位を持つ。ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲ Ｉで切断した組換えベクター（ｐＴＶ１１８Ｎ、タカラバイオ社製）にまず短い方の断片を連結し、ＮｃｏＩで再切断した後、長い方の断片を連結して発現用ベクターを完成させた。 この際のＰＣＲ反応は、９４℃で２分間インキュベートした後、サイクル（９４℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で１分１５秒間）で３０回インキュベートし、最後に４℃でインキュベートした。 上記ＰＣＲ産物、及びＮｃｏＩ、ＥｃｏＲ Ｉで切断したＰＣＲを通常知られている電気泳動法により解析した結果、変異型Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子に相当する断片が存在すること及び二つに切断された変異型Ａｉｒ ｔａｄｈに相当する断片を確認した。変異型大腸菌の作成 上記変異型Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子を大腸菌に発現させるために、ｐＴＶ１１８Ｎベクターにサブクローニングした。 上記で得られた変異型Ａｉｒ ｔａｄｈ遺伝子を組込んだｐＴＶ１１８Ｎベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。その後、ＬＢ培地に塗布し３７℃で１晩インキュベートした。 上記において形成されたコロニーを任意に採取し、ＬＢ液体培地で１晩培養し、プラスミドを回収した。プラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、目的の断片が正しく挿入されていることを確認した。タウロピンデヒドロゲナーゼの製造 ここで構築された組換え大腸菌をｐＴＶＡｉｒＪＭ１０９と称し、これを以下の方法により培養し、組換え蛋白質、すなわちタウロピンデヒドロゲナーゼを得た。 ２×ＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で前培養を行う。前培養液５０μｌを５ｍｌの２×ＹＴ（アンピシリンを含む）培地に接種し、３７℃で３時間培養した。これに５μｌの１Ｍ ＩＰＴＧを加えて３７℃、一晩誘導する。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃）により集菌した。超音波によりリン酸緩衝液中で細胞を破壊し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃）で上清を回収した。これを精製することにより本発明酵素を得ることができた。タウリンの定量０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２） ２ｍｌ１．４ｍＭ ＮＡＤＨ ０．５ｍｌ０．０８Ｍ ピルビン酸（ｐＨ７．２） ０．１ｍｌ０．４Ｍ タウリン（ｐＨ７．２） ０．１ｍｌ酵素（Ａｉｒ ｔａｄｈ） ０．３ｍｌ 上記処方の測定液を用い、３０℃でインキュベート、３４０ｎｍの吸光度を測定した。 別に、試料の生イカ１０ｇを磨り潰し、精製水４０ｍｌを加え５分間９０℃以上に加熱した。冷却後、精製水を加えて５０ｍｌとした。この検体の上清０．１ｍｌを上記処方のタウリンに代えて測定液を調製し、３０℃でインキュベートし、３４０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度より試料のタウリン含有量は７５０ｍｇ／１００ｇであった。 上記試料のタウリン含有量を従来方法で測定した。すなわち、磨り潰した試料から高分子化合物を予め除去し、次いでイオン交換樹脂カラムを用いたアミノ酸分析計で各種アミノ酸を分離しながら測定したところ、タウリン含有量は７８０ｍｇ／１００ｇであった。 以上の結果より、本発明により得られるタウロピンデヒドロゲナーゼを用いることによりタウリンの迅速簡易、且つ正確な測定値を得ることができる。又、タウリンの量を一定にすれば、ピルビン酸の定量も容易である。 更に、タウロピンは希少な物質であるため、その薬理作用が未だ解明されていない。今後、タウロピンデヒドロゲナーゼを用いてタウロピンの製造が容易になり、タウロピンの有用な薬理効果が解明されることが期待される。ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６０９として受領された、新規大腸菌。セグロイソメ（Arabella iricolor ) 由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を加工して、タウロピンデヒドロゲナーゼ生成能を阻害することなく、プラスミドに挿入した組換えベクタープラスミド遺伝子を有する大腸菌。配列表１に記載するタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する大腸菌。セグロイソメ（Arabella iricolor ) 由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を、ｐＴＶ１１８Ｎベクター（タカラバイオ社製）に組込んで、大腸菌ＪＭ１０９に挿入した遺伝子組換え大腸菌。請求項１ないし請求項４に記載する大腸菌を培養し、得られた培養物からタウロピンデヒドロゲナーゼを採取、精製することを特徴とするタウロピンデヒドロゲナーゼの製法。 【課題】 タウロピンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組込んだ組換えベクタープラスミド遺伝子を含む新規な遺伝子組換え大腸菌及びこの大腸菌を用いたタウロピンデヒドロゲナーゼの製法を提供する。【解決手段】 ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６０９として受領された新規大腸菌であり、セグロイソメ（Arabella iricolor )由来のタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を加工し、タウロピンデヒドロゲナーゼ生成能を阻害することなく、プラスミドに挿入した組換えベクタープラスミド遺伝子を有する大腸菌であり、この大腸菌は特定の配列からなるタウロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する。この大腸菌を培養し、得られた培養物からタウロピンデヒドロゲナーゼを採取、精製する。【選択図】 なし配列表