生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_タンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法及びアルコール検出キット |
| 出願番号： | 2005062646 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | C12Q 1/00,C12Q 1/26,C12Q 1/28 |
特許情報キャッシュ
菅 辰彦 JP 2006238851 公開特許公報(A) 20060914 2005062646 20050307 タンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法及びアルコール検出キット コンビ株式会社 391003912 松井 茂 100086689 菅 辰彦 C12Q 1/00 20060101AFI20060818BHJP C12Q 1/26 20060101ALI20060818BHJP C12Q 1/28 20060101ALI20060818BHJP JPC12Q1/00 CC12Q1/26C12Q1/28 12 ＯＬ 9 4B063 4B063QA01 4B063QQ03 4B063QQ16 4B063QQ61 4B063QR01 4B063QR02 4B063QR41 4B063QS20 4B063QS28 4B063QX01 本発明は、タンパク夾雑物を多く含む試料中のアルコールを正確に検出できる方法及びアルコール検出キットに関するものである。 近年、女性の社会進出に伴なって女性の飲酒はごく一般的になり、飲酒習慣のある女性も多くなっている。飲酒等により体内に摂取されたアルコールは、胃腸で速やかに吸収されて血中に移行し、血中のアルコール濃度はアルコール摂取後３０分〜１時間と比較的短時間で最高値に達する。血中のアルコールのごく一部は、呼気、汗、尿等とともにそのまま排出されるが、大部分は主に肝臓で分解されて炭酸ガスと水になって排出される。通常、１合（１８０ｍＬ）の日本酒、あるいはビール大瓶１本に含まれるアルコールが完全に分解されるまでに約３時間かかると言われている。 また、飲酒習慣のある女性が出産した場合、体内に吸収されたアルコールは血中とほぼ同じ濃度で母乳中にも出てくることが分かっている。 従来より、簡便に血中のアルコール濃度を測定するために、呼気や唾液に含まれるアルコール濃度と血中のアルコール濃度との相関関係を利用した簡易式のアルコールチェッカーや使い捨ての検査キットが市販されている。 また、下記特許文献１には、汗中のアルコール濃度と血液中のアルコール濃度との相関関係を利用して血液中のアルコール濃度を測定するアルコール濃度測定装置が開示されている。 下記特許文献２には、ヒトの唾液中のアルコールを検出する方法であって、アルコールオキシダーゼ、過酸化活性物質及び唾液中に通常存在する還元剤による還元に抵抗するのに十分に低い酸化電位を有する酸化還元指示薬を含む試薬系に、唾液を接触させることを特徴とする方法が開示されている。特開２００１−２１５６７号公報特開平５−２６０９９４号公報 しかしながら、上記のようなアルコールチェッカーや検査キットは主に飲酒運転の危険を防止するために用いられるものであるため、例えば、市販の唾液用アルコール検査キットを用いて母乳等のタンパク夾雑物を多く含む試料中のアルコールを検出しようとした場合、検出感度が低下して正確に検出できないことが分かった。 また、これまで母乳等のタンパク夾雑物を多く含む試料中のアルコール濃度を簡便に測定できる検査キットは開発されていないため、母親が飲酒後に授乳する場合、母乳中にどれだけのアルコールが含まれるかを知る術がなく、母乳を通して乳児にアルコールを与えてしまうおそれがあった。 したがって、本発明の目的は、簡便な操作で母乳等のタンパク質を含む試料中のアルコールを正確に検出することができる方法及びアルコール検出キットを提供することにある。 上記目的を達成するため、本発明の一つは、タンパク質を含有する試料液と除タンパク液とを混合し、該混合液をアルコール検出紙に接触させることを特徴とするタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法を提供するものである。 本発明のアルコールの検出方法によれば、タンパク質を含有する試料液を予め除タンパク液で処理してからアルコール検出紙に接触させることにより、測定の阻害となるタンパク質の影響を受けることなく簡便かつ正確にアルコールを検出することができる。 本発明のアルコールの検出方法においては、前記アルコール検出紙を濾紙で包んで前記混合液に接触させることが好ましく、前記濾紙としてティッシュペーパーを用いることがより好ましい。これらによれば、タンパク質の影響を更に低減することができ、検出時間の短縮及び検出感度の向上を図ることができる。 また、前記除タンパク液は第１の液と第２の液とからなり、前記試料液を前記第１の液と混合し、該混合液を前記第２の液と混合し、その混合液を前記アルコール検出紙に接触させることが好ましく、前記除タンパク液として、カレッツ（Carrez）試薬を用いることがより好ましい。これによれば、効率よく試料液中のタンパク質を除去することができ、検出感度をより向上することができる。 更に、前記アルコール検出紙として、基材上にアルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）とを固定化したものを用いることが好ましい。これによれば、試料液にアルコールが含まれている場合は該アルコール検出紙の色が青色に変わるので簡単にアルコールを検出することができる。 また、本発明のもう一つは、除タンパク液と、スポイトと、アルコール検出紙との組み合わせからなるタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キットを提供するものである。 本発明のアルコール検出キットによれば、簡単な操作でタンパク質を含有する試料中のアルコールを正確に検出できる。 本発明のアルコール検出キットにおいては、更に前記アルコール検出紙を包む濾紙を含むことが好ましい。これによれば、濾紙代わりのティッシュペーパー等がない場合でも試料中のアルコールを検出することができる。 また、前記除タンパク液は予め計量されて開閉可能な容器に封入されていることが好ましい。これによれば、除タンパク処理する際に試薬をいちいち計量する必要がないので、操作ミスが少なく、誰でも簡単に試料中のアルコールを検出することができる。 更に、前記除タンパク液は第１の液と第２の液とからなることが好ましく、前記除タンパク液はカレッツ（Carrez）試薬であることが好ましい。 更にまた、前記アルコール検出紙は、基材上にアルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）とを固定化したものであることが好ましい。 本発明によれば、試料中のタンパク質に影響されることなく試料に含まれるアルコールを正確に検出できる方法及びアルコール検出キットを提供できる。本発明のアルコール検出キットは非常に操作が簡単であり、誰でも簡単に利用することができる。 以下、本発明のアルコールの検出方法について説明する。 まず、タンパク質を含有する試料液と除タンパク液とを混合し、除タンパク処理を行う。除タンパク処理は、例えば、塩析法（硫安塩析法、カレッツ（Carrez）試薬法）、酸沈殿法（乳酸処理法）、酸化還元法（過塩素酸法）等の公知の除タンパク方法にしたがって行うことができるが、使用する除タンパク液がアルコール検出紙の反応を阻害しないような方法を選択する必要がある。本発明においては、検出感度等に影響を与えない点等から、カレッツ（Carrez）試薬法が好ましく採用される。カレッツ（Carrez）試薬は２つの液からなり、カレッツ（Carrez）試薬Ｉは、K4[Fe(CN)6・3H2O] ３．６ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍＬにメスアップしたものであり、カレッツ（Carrez）試薬ＩＩは、ZnSO4 ７．２ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍＬにメスアップしたものである。 具体的には、タンパク質を含有する試料液に、その０．０５〜０．５倍容量のカレッツ（Carrez）試薬Ｉ、カレッツ（Carrez）試薬ＩＩを順次加えてよく混合して室温（１５〜３５℃で１〜５分間静置すればよい。 上記のようにして除タンパク処理した試料液をアルコール検出紙に接触させた後、室温（１５〜３５℃）で３〜７分間放置して該アルコール検出紙の色を観察する。この時、アルコール検出紙をそのまま除タンパク処理した試料液に接触させると、凝固したタンパク質の影響で検出に時間がかかったり、検出感度の低下が起こるため、予めフィルター等で除タンパク処理した試料液を濾過して沈殿物を除去しておく、あるいは除タンパク処理した試料液中の沈殿物がアルコール検出紙と接触しないように、アルコール検出紙を濾紙に包んで接触させることが好ましい。本発明においては、簡便さ等の点から後者の方法が好ましい。なお、アルコール検出紙を包む濾紙は、除タンパク処理した試料液中の沈殿物が通過しない程度のものでよく、通常の濾紙、ティッシュペーパー、ガーゼ、サラシ布等を用いることができる。中でもティッシュペーパーは、ほとんどの家庭にあり、また、コストも安いことから好ましく用いられる。 アルコール検出紙は、市販の唾液用アルコール検出キットに使用されているものと同様のものを用いることができる。本発明においては、簡便さやコスト等の点から、濾紙等の基材上にアルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）とを固定化したものが好ましく用いられる。固定化は濾紙等の基材に上記各成分を吸着させることにより行うことができる。また、上記各成分を固定化したアルコール検出紙として、例えば、商品名「ALCO SCREEN 02」（CHEMATICS社製）等を用いることもできる。 アルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）を用いたアルコール検出の原理を図１に示す。図１の反応式（Ｉ）に示すように、試料液中のアルコール（エタノール）はアルコールオキシダーゼによって酸化されて過酸化水素を生成する。そして、同図反応式（ＩＩ）に示すように、過酸化水素存在下でTMBZがペルオキシダーゼによって酸化されて青色に呈色する。したがって、試料液中にアルコールが含まれているとアルコール検出紙が青色に呈色するので、誰でも容易に判断することができる。 本発明のアルコールの検出方法は、タンパク質を含有する試料液であれば特に制限はなく適用することができ、例えば、母乳、各種飲料、ケフィア、味噌、しょう油等が挙げられる。特にタンパク質含量が０．５質量％以上の試料液中のアルコールの検出に好ましく適用することができる。 次に、本発明のアルコール検出キットについて説明する。 図２には、本発明のアルコール検出キットの一実施態様が示されている。このアルコール検出キットは、上記のアルコールの検出方法を誰でも簡単に行うことができるように構成されたものであり、アルコール検出紙１、除タンパク液２、３、スポイト４、濾紙５とから構成されている。 アルコール検出紙１は、短冊状に成型されたプラスチック等の基材の一端に、アルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）とを固定化した濾紙１ａが貼り付けられたものである。 除タンパク液２、３は、それぞれカレッツ（Carrez）試薬Ｉ、カレッツ（Carrez）試薬ＩＩであり、所定量の各試薬が予め計量されてエッペンドルフチューブ等の開閉可能な容器にそれぞれ封入されている。なお、各試薬は複数回分の量を容器に封入して、スポイト４で計量して使用してもよいが、例えば、各試薬をそれぞれ１回分の使用量（０．０５〜０．５ｍＬ）ごとに容器に封入しておけば、試薬の計量の手間が省けるだけでなく、その容器中で除タンパク処理を行うことができるので好ましい。 スポイト４は、本体部に目盛りが刻まれており、試料液や除タンパク液を計量できるようになっている。このスポイト４は、試料液と除タンパク液を混合する際にも用いられる。 濾紙５は、除タンパク処理した試料液にアルコール検出紙１を接触させる際に用いられ、中にアルコール検出紙１が入るように袋状に成型されている。 まず、所定量の試料液をスポイト４で計り取り、予め１回分の使用量のカレッツ（Carrez）試薬Ｉが封入された除タンパク液２の容器に入れてよく混合した後、この混合液をスポイト４を用いて、予め１回分の使用量のカレッツ（Carrez）試薬ＩＩが封入された除タンパク液３の容器に入れてよく混合する。そして、濾紙５の中にアルコール検出紙１を入れて除タンパク処理した試料液と接触させた後、所定時間（３〜７分間）放置してアルコール検出紙１の濾紙１ａが青色になるかどうかを観察すればよい。 アルコール検出紙として商品名「ALCO SCREEN 02」（CHEMATICS社製）を用い、以下の方法でミルク中のアルコールの検出を行った。 市販の調製粉乳を水に溶かして濃度１３質量％のミルクを調製した。このミルクに９９．８％のエタノールを添加して、アルコール濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬのサンプルを調製した。 そして、サンプル０．４５ｍＬを小試験管に取り、カレッツ（Carrez）試薬Ｉを０．０２５ｍＬ添加してよく混合した後、カレッツ（Carrez）試薬ＩＩを０．０２５ｍＬ添加してよく混合して１分間放置して除タンパク処理した。 除タンパク処理したサンプルをフィルターで濾過した後、アルコール検出紙を浸し、５分後にアルコール検出紙の状態を観察した。また、同様のサンプルを用いて、硫安塩析法、乳酸処理法、酸化還元法等の除タンパク処理を行い、フィルターで濾過した後、アルコール検出紙を浸し、５分後に状態を観察した。それらの結果を表１に示す。 表１から、除タンパク処理しない場合、検出限界がアルコール濃度０．５ｍｇ／ｍＬであるのに対して、カレッツ試薬法で除タンパク処理を行った場合、アルコール検出紙として用いた商品名「ALCO SCREEN 02」（CHEMATICS社製）の検出限界（アルコール濃度０．２ｍｇ／ｍＬ）に近い濃度（０．２５ｍｇ／ｍＬ）まで検出できることが分かる。ちなみに、このアルコール濃度は、大ビール１本飲んだ程度の「爽快期」の血中アルコール濃度（０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬ）と同じであり、母乳中のアルコールを検出するためには十分な感度であると考えられる。 一方、硫安塩析法は、多量の試薬を用いる必要があるためサンプルが薄まってしまい、低濃度のアルコールは検出には適していない。また、乳酸処理法及び酸化還元法では、アルコール検出紙の反応が阻害されてしまい、全くアルコールを検出できないことが分かる。 実施例１の結果に基いて、除タンパク方法としてカレッツ試薬法を採用し、更に検出条件の検討を行った。 市販の調製粉乳を水に溶かして濃度１３質量％のミルクを調製した。このミルクに９９．８％のエタノールを添加して、アルコール濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０ｍｇ／ｍＬのサンプルを調製した。 そして、サンプル０．８ｍＬを小試験管に取り、カレッツ（Carrez）試薬Ｉを０．１ｍＬ添加してよく混合した後、カレッツ（Carrez）試薬ＩＩを０．１ｍＬ添加してよく混合して１分間放置して除タンパク処理した。 そして、除タンパク処理したサンプルをフィルターで濾過しなかった場合と、濾過した場合のそれぞれについて、アルコール検出紙（商品名「ALCO SCREEN 02」、CHEMATICS社製）を浸し、経時的にアルコール検出紙の状態を観察した。その結果を表２に示す。 表２から、カレッツ試薬法で除タンパク処理した後、処理液を濾過してからアルコール検出紙を接触させた方が短時間で感度よくアルコールを検出できることが分かる。なお、除タンパク処理したサンプル（未濾過）に、ティッシュペーパーで包んだアルコール検出紙を接触させた場合も同様に短時間で感度よくアルコールを検出できることを確認した。 本発明のアルコールの検出方法及びアルコール検出キットは、母乳等のタンパク質を多く含む試料中に含まれるアルコールを検出する際に好適に用いることができる。アルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）を用いたアルコール検出の原理を示す図である。本発明のアルコール検出キットの一実施態様を示す図である。符号の説明１．アルコール検出紙２、３．除タンパク液４．スポイト５．濾紙 タンパク質を含有する試料液と除タンパク液とを混合し、該混合液をアルコール検出紙に接触させることを特徴とするタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法。 前記アルコール検出紙を濾紙で包んで前記混合液に接触させる請求項１記載のタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法。 前記濾紙としてティッシュペーパーを用いる請求項２記載のタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法。 前記除タンパク液は第１の液と第２の液とからなり、前記試料液を前記第１の液と混合し、該混合液を前記第２の液と混合し、その混合液を前記アルコール検出紙に接触させる請求項１〜３のいずれか一つに記載のタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法。 前記除タンパク液として、カレッツ（Carrez）試薬を用いる請求項４記載のタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法。 前記アルコール検出紙として、基材上にアルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）とを固定化したものを用いる請求項１〜５のいずれか一つに記載のタンパク質を含有する試料中のアルコールの検出方法。 除タンパク液と、スポイトと、アルコール検出紙との組み合わせからなるタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キット。 更に前記アルコール検出紙を包む濾紙を含む請求項７記載のタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キット。 前記除タンパク液は予め計量されて開閉可能な容器に封入されている請求項７又は８記載のタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キット。 前記除タンパク液は第１の液と第２の液とからなる請求項７〜９のいずれか一つに記載のタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キット。 前記除タンパク液はカレッツ（Carrez）試薬である請求項１０記載のタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キット。 前記アルコール検出紙は、基材上にアルコールオキシダーゼとペルオキシダーゼとTMBZ（Tetramethylbenzidine）とを固定化したものである請求項７〜１１のいずれか一つに記載のタンパク質を含有する試料中のアルコール検出キット。 【課題】 簡便な操作で母乳等のタンパク質を含む試料中のアルコールを正確に検出することができる方法及びアルコール検出キットを提供する。【解決手段】 アルコール検出キットを、除タンパク液とスポイドとアルコール検出紙で構成する。このアルコール検出キットは、更に前記アルコール検出紙を包む濾紙を含むことが好ましい。また、前記除タンパク液は予め計量されて開閉可能な容器に封入されていることが好ましい。更に、前記除タンパク液は第１の液と第２の液とからなることが好ましく、前記除タンパク液はカレッツ（Carrez）試薬であることが好ましい。そして、タンパク質を含有する試料液と除タンパク液とを混合し、該混合液をアルコール検出紙に接触させることにより、試料中のアルコールの検出する。前記アルコール検出紙を濾紙で包んで前記混合液に接触させることが好ましく、前記濾紙としてティッシュペーパーを用いることがより好ましい。【選択図】 なし