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| タイトル： | 公開特許公報(A)_ｐＫａ測定方法及びｐＫａ測定装置 |
| 出願番号： | 2004289142 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | G01N 27/447,G01N 37/00 |
特許情報キャッシュ
荒井 昭博 JP 2006105627 公開特許公報(A) 20060420 2004289142 20040930 ｐＫａ測定方法及びｐＫａ測定装置 株式会社島津製作所 000001993 小林 良平 100095670 荒井 昭博 G01N 27/447 20060101AFI20060324BHJP G01N 37/00 20060101ALI20060324BHJP JPG01N27/26 301ZG01N37/00 101G01N27/26 331EG01N27/26 331K 4 1 ＯＬ 11 本発明は、開発段階の候補薬物等の被検化合物の酸解離定数（pKa）を、ごく微量の試料でハイスループットに測定する方法及びそのための装置に関する。 近年、新薬開発ではコンビナトリアルケミストリーや巨大化合物ライブラリーの充実に伴い、薬効や体内動態等の候補化合物評価のハイスループットスクリーニング化が進んでいる。従来、バッチ処理で行われていた、脂溶性・溶解性などの物理化学的性質の評価においても種々の高速スクリーニング系が開発されつつある。酸解離定数（pKa）の評価方法についても、従来の電位差滴定法に代わり、微小試料量で簡便な測定が行える方法として特許文献１に記載のようなキャピラリ電気泳動を利用する方法が提唱され、特に最近では高速化を念頭に置いたpKa測定手法の開発が盛んに行われている。特開2004-77405号公報 しかし、従来の電位差滴定によるpKa測定の場合は、自動化しようとすると大がかりなものになり、サンプル量も多くなる。また、キャピラリ電気泳動を利用した方法の場合、自動化は容易にできる反面、泳動時間が長く、分析に時間を要するという問題があった。そこで、本発明が解決しようとする課題は、微量のサンプルであってもハイスループットにpKaを測定することのできるpKa測定方法及び測定装置を提供することである。 上記課題を解決するために本願発明者は、内部に流路を備えた平板状のチップデバイスによって電気泳動を行うことでpKaを測定することに想到した。 すなわち、本発明に係るpKaの測定方法は、 電気泳動を利用して被検化合物のpKaを測定する方法であって、 板状部材の内部に流路が形成され、その板状部材の一表面の流路に対応する位置に流路に達する穴がリザーバとして形成されたチップデバイスを使用して、被検化合物と電気浸透流マーカをpHの異なる複数のバッファで繰り返し電気泳動し、各泳動におけるバッファのpHと被検化合物の実効移動度の関係から前記被検化合物のpKaを求めることを特徴とする。 また、本発明に係るpKa測定装置は、上記の方法を用いてpKaを測定するための装置であって、a) 板状部材の内部に流路が形成され、その板状部材の一表面の流路に対応する位置に流路に達する穴がリザーバとして形成されたチップデバイスと、b) pHの異なる複数のバッファを収容するバッファ収容手段と、c) 被検化合物及び電気浸透流マーカを含むサンプル溶液を収容するサンプル溶液収容手段と、d) 前記バッファを前記チップデバイスに供給するバッファ供給手段と、e) 前記サンプル溶液を前記チップデバイスに供給するサンプル溶液供給手段と、f) 前記流路に所定の電圧を加える電圧印加手段と、g) 該電圧によって前記流路内を泳動した被検化合物及び電気浸透流マーカのピークを検出するピーク検出手段と、h) 前記チップデバイスを洗浄するチップ洗浄手段と、i) 前記ピーク検出手段によって検出されたピークの位置から前記被検化合物の実効移動度を求めると共に、該実効移動度と各泳動におけるバッファのpHの関係から前記被検化合物のpKaを算出するデータ処理手段と、 を有することを特徴とする。 なお、上記ピーク検出手段としてはリニアイメージ吸光度検出器を用いることが望ましい。 本発明のpKa測定方法によれば、チップデバイス上で電気泳動を行うことにより、従来よりバッファとサンプルの消費量がわずかで済むと共に、測定時間を短縮することができる。また、上記構成からなる本発明のpKa測定装置によれば、上記チップデバイスへのサンプル溶液及び複数種のpHを有するバッファの供給や、泳動後のチップデバイスの洗浄を自動で行うことができるため、pKa測定のスループットを従来よりも大幅に向上させることができる。 また、上記ピーク検出手段としてリニアイメージ吸光度検出器を用いた場合、分離流路のほぼ全体の吸光度検出を一挙に行うことができるので、従来のキャピラリ電気泳動によるpKa測定のようにポイント検出方式（分離流路末端部の所定の一点でピーク検出を行う方式）の検出器を用いた場合と違って全ピークが流路の末端に到達するまで泳動を行う必要がないため、更に測定時間を短縮することができる。また、泳動を停止させた状態でデータスキャンを繰り返し、積算平均化処理することにより、ノイズレベルを低減させることができると共に、リニアイメージ吸光検出方式により計測される泳動距離軸−泳動時間軸−吸光度軸の3次元データから泳動で移動しないピークを除去し、泳動中のデータからサンプル成分のみを抽出することも可能である。 本発明のpKa測定法は、平板状のチップデバイスに設けられた微細流路上で電気泳動分離を行うものである。本発明における分離原理は、流路を形成する材料と流路内の液体との固液界面において電気二重層が形成され、電場をかけることによって発生する電気浸透流を利用するものであり、被検化合物が解離していない（イオン化されていない）場合は、該被検化合物は電気浸透流と同じ速度で移動するが、被検化合物が解離している場合は、その解離の度合いに応じて該被検化合物と電気浸透流との移動速度に差が生じる。 被検化合物の解離の度合いは、試料を泳動する際のpHに応じて変化するため、被検化合物と測定するpHレンジで電荷を持たない電気浸透流マーカ（例えばDMSO，mesityloxideなど）の２成分を混合したもの（以下、サンプル溶液と呼ぶ）を、様々なpH条件下で繰り返し電気泳動し、pHと該被検化合物の実効移動度の関係をプロットすることにより得られた曲線の変曲点、又は曲線近似した理論式のパラメータからpKaを測定することができる。 以下、電気泳動を利用した酸解離定数の導出方法について説明する。１．pKaの定義上式のような弱酸の熱力学的解離定数（Kath）は、で表される。両辺の対数をとって移項すると、ここで、（活量）＝濃度×活量係数γであるので、両辺の対数をとって移項すると、両辺にマイナスをかけて、又は、となる。 Debye-Huckel理論によれば、活量係数γは次式で与えられる。以上のように、熱力学的pKa値を測定によって得られたpKa'値から求める場合には、バッファのイオン強度Iによる補正を行う必要がある。２．移動度とpKathの関係 各イオン固有の移動度μeff（effective mobility、実効移動度）は次式で表される。また、弱酸の解離によって与えられる移動度は次のように表される。従って、(1)式に(4)式を代入して、Hendersson-Haselbalch式が得られる。また、(1)'式に(4)式を代入して、指数の形に置き換えると、となる。 従って、pHを変化させて測定したμeffをプロットすることにより、S字状の滴定曲線が得られ、該曲線にこれらの式を当てはめることにより、パラメータとしてのpKa'とμaを求めることができる。 また、次式のような弱塩基の熱力学的解離定数（Kath）はで表される。両辺の対数をとって移項すると、であり、上記と同様に、となる。両辺の対数をとって移項すると、両辺にマイナスをかけて、又は、となる。また、弱塩基の解離によって与えられる移動度は、と表すことができるので、(2)式に(5)式を代入して、Hendersson-Haselbalch式が得られる。また、(2)'式に(5)式を代入して、指数の形に置き換えると、となる。よりプロトン化した成分の移動度をμ、より脱プロトン化した成分の移動度をμ0（完全に脱プロトン化された弱塩基：μ0＝0）とすると、となる。これはBoltzmannモデルの一般式、と一致するので、上記弱酸の場合と同様に、S字状の曲線近似でpKa'が求められる。 以下、本発明に係るpKa測定装置について説明する。 本発明のpKa測定装置は、微細な流路を備えたチップデバイス、電気泳動に使用する複数種類のバッファを収容するためのバッファ収容手段、サンプル溶液を収容するためのサンプル溶液収容手段、前記バッファ収容手段からバッファを吸引し前記チップデバイスに順次注入するバッファ供給手段、前記サンプル溶液収容手段からサンプル溶液を吸引し前記チップデバイスに注入するサンプル溶液供給手段、前記チップデバイス上の流路に電圧を印加するための電圧印加手段、電気泳動によるピークを検出するためのピーク検出手段、泳動後に前記チップデバイスを洗浄するためのチップ洗浄手段、及びピークの位置から前記被検化合物の実効移動度を求めると共に、該実効移動度と各泳動におけるバッファのpHの関係から前記被検化合物のpKaを算出するデータ処理手段を備えたものである。 上記チップデバイスは平板状の基材に微細加工によって流路及びリザーバ、電極などが設けられたものであり、該基材の材質は特に限定するものではないが、石英、ガラス、樹脂などを用いることができる。流路の形状は任意であるが、例えば、図２に示すようなものとすることができる。該チップデバイスは一対の透明平板１１、１５から構成されており、下側の透明平板１１の上表面には、それぞれ溝状のサンプル導入流路１２と分離流路１３とが互いに交差する（これを「交差部１４」とする）ように形成され、上側の透明平板１５には両流路１２、１３の各端部に対応する位置にそれぞれ各流路の出口及び入口（リザーバ１６〜１９）として貫通孔が穿孔されている。更に、各リザーバ１６〜１９には、そこに収容している泳動液に電圧を印加するための電極（図示略）がそれぞれ設けられている。この電極は、例えば一方の透明平板のリザーバ周辺に各々スパッタ成膜されたAuもしくはPt電極が形成されているものとすることができる。なお、上記一対の平板は同程度の厚みを有するものであってもよいが、あるいは上側の透明平板としてフィルム状のものを使用し、該フィルムによって下側の透明平板表面の流路を閉塞した構成としてもよい。 また、本発明に用いられるチップデバイスは上記のように一対の平板から成り、表面に溝を備えた平板と該溝の端と対応する位置に貫通孔を備えた平板とを該溝を内側にして貼り合わせることにより該溝に対応する流路が形成されたものとしてもよいが、これに限定されるものではなく、一枚の平板から成るものとしてもよい。この場合は該一枚の平板の内部に液体が流れる溝を形成すると共に、その平板の一表面の溝に対応する位置に流路に達する穴をリザーバとして形成する。 また、本発明のpKa測定装置に使用されるチップデバイスは、図３のように１つのサンプル導入流路１２及び分離流路１３に対してバッファ注入用のリザーバ１８を複数設け、並行処理が可能なものとしてもよい。あるいは、本発明のpKa測定装置を複数のチップデバイスを備えたものとし、該複数のチップデバイスで並行して電気泳動を行うことができるようにしてもよい。 更に、チップデバイスの流路表面に適当な化学的修飾を施すことにより、低pH条件下での迅速なサンプル導入や泳動分離が行えるようにしてもよい。 また、上記ピーク検出手段としては、蛍光検出器や吸光度検出器等を用いることができるが、後者の方がサンプルやバッファ成分の蛍光標識化が不要であるためより望ましい。また、吸光度検出器としては、チップデバイスの分離流路の下方に該分離流路にそって配置されるアレイ状の受光素子と、該チップデバイスの反対側に設けられ分離流路の所定の範囲に光を照射するための光照射手段とを備え、流路を通過した光を該受光素子によって検出することによって流路全体のイメージを取得するリニアイメージ吸光度検出器を使用することが望ましい。リニアイメージ吸光度検出器を用いた場合、上述のように短時間で電気泳動を完了することができる（流路表面を化学的に修飾しない場合であっても10数秒で分離が完結する）と共に、ノイズの除去が容易となる。また、低pHで電気浸透流が遅い場合であっても、クロス部の吸光度をモニタすることにより、サンプル導入に必要な時間を割り出すことが可能である。 以下、図面を用いて本発明に係るpKa測定方法及びpKa測定装置の実施例について詳細な説明を行う。図１は本発明に係るpKa測定装置の要部の構成を示すブロック図である。 本実施例のpKa測定装置は、石英製のマイクロチップ１０と、該マイクロチップ１０に設けられた電極に電圧を印加する電源２０、該マイクロチップ１０の上方に設けられた光照射部３１及びマイクロチップ１０の下方に設けられたアレイ状受光素子から成る検出部３２を備えたリニアイメージUV検出器３０と、該リニアイメージUV検出器３０によって得られたデータを基に被検化合物のpKa値を算出するデータ処理部４０を備えている。更に、本実施例のpKa測定装置は、サンプル溶液及びバッファを収容するためのマイクロプレート５０と、チップ洗浄用の洗浄液を収容する洗浄液容器６０と、該マイクロプレート５０上のサンプル及びバッファを吸引するための吸引部７１、マイクロチップ１０のリザーバへのサンプル溶液とバッファの注入、及び洗浄液によるマイクロチップ１０の洗浄を行うための注入/吸引部７２を備えており、該注入/吸引部７２は前記吸引部７１及び洗浄液容器６０と配管７３で接続されている。サンプル溶液、バッファ、及び洗浄液はシリンジ７４によって送液され、配管７３上に設けられた電磁弁７５で流路の切り替えが行われる。また、使用済みのバッファや洗浄液などは該注入/吸引部７２によって吸引されて装置外に排出される。また、更に本発明のpKa測定装置には、上記各部を制御するための制御部（図示略）が設けられている。 上記マイクロプレート５０としては、縦8ウェル×横12ウェルの96ウェルタイプのものが好適に用いられる。この場合、例えば12種類のサンプルに対して、それぞれpHの異なる12種類のバッファを用いて電気泳動を行うのであれば、図４に示すように、横1列に各サンプル溶液を収容し、他の横6列に前記12種類のバッファを6セット収容する。本発明のpKa測定方法においては、サンプル及びバッファの使用量が僅かですむため1つのウェルに収容されたバッファで2回の電気泳動を行うことができ、前記6セットのバッファで前記12サンプルの分析に対応することができる。また、残りの横1列には0.1N-NaOHを収容しておき、該NaOHで適宜マイクロチップ１０を洗浄することで、流路表面を活性化できるようにすることが望ましい。 本発明のpKa測定装置によって分析を行う際には、制御部によって吸引部７１、注入/吸引部７２、シリンジ７４、及び電磁弁７５を制御してマイクロプレート５０に収容されたバッファセットの中から１種類のバッファをマイクロチップ１０に充填する。次に、上記と同様にしてマイクロチップ１０のサンプル導入流路１２に設けられたリザーバ１６にサンプル溶液が注入され、電源２０によってサンプル導入流路１２の両端のリザーバ１６、１７に設けられた電極間に所定時間だけ高電圧が印加される。これにより、被検化合物及び電気浸透流マーカがサンプル導入流路中に分散される。次に、分離流路１３の両端のリザーバ１８、１９に設けられた電極間に泳動電圧が印加される。これにより、交差部１４に存在する試料が分離流路１３内を泳動し、リニアイメージUV検出器３０によって分離流路のほぼ全域（図２の網掛けで示した領域）の吸光度が取得される。泳動終了毎に洗浄液でマイクロチップ１０の流路及びリザーバを洗浄しながら、1種類のサンプルについて上記複数のバッファで繰り返し電気泳動を行い、バッファセットに含まれる全種類のバッファでの分析が終了したら、次のサンプルの分析を開始する。全サンプルについての分析が完了したら、リニアイメージUV検出器３０で得られたピーク検出位置のデータを基にデータ処理部４０で被検化合物の実効移動度を計算し、各pHに対してプロットして曲線のパラメータ解析によりpKaを算出する。 なお、上記実施例では１枚のマイクロプレートにサンプル溶液とバッファを収容し、同一の機構を用いてサンプル溶液及びバッファをマイクロプレートに注入する構成としたが、サンプル溶液収容手段とバッファ収容手段、及びサンプル溶液供給手段とバッファ供給手段をそれぞれ個別に設けた構成としてもよい。 以下、本発明のpKa測定方法を用いた測定例について説明する。 電気浸透流マーカとしてメシチルオキシド（mesityl oxide）を使用し、pH 11.44, 10.61, 9.78, 8.90, 8.00, 7.09, 6.32, 5.54, 4.72, 3.83, 3.10, 2.23の12種類のバッファを用いて石英製マイクロチップ上で2-アミノピリジン（2-aminopyridine）のpKa測定を行った。サンプル導入は400V/cm, 25秒、泳動分離は240V/cm, 10秒、プルバック電場は500V/cm）で行った。このときの紫外線吸収のデータを図５に、該データから求められた被検化合物の実効移動度とバッファのpHをプロットして得られた曲線を図６に、該曲線のパラメータ解析を行って算出された被検化合物のpKa値を図７に示す。また、同様に4-ジメチルアミノピリジン（4-dimethylaminopyridine）、アセチルサリチル酸（Acechilsalichilic acid）、及びサリチル酸（Salicylic acid）を被検化合物としてpKa測定を行ったところ、図７に示すように、いずれにおいても本発明のpKa測定によって得られたpKa値は文献値と±0.2の差でほぼ一致しており、以上の結果から、本発明のpKa測定方法によって信頼性の高いpKa値が得られることが確かめられた。本発明の実施例であるpKa測定装置の要部の構成を示すブロック図。同実施例のpKa測定装置におけるマイクロチップの流路配置を示す(a)上面図、(b)(a)のA-A'矢視断面図。本発明のpKa測定装置におけるチップデバイスの流路配置の別の例を示す上面図。同実施例のpKa測定装置におけるマイクロプレートの割り当ての例を示す上面図。本発明のpKa測定方法を用いた測定例において得られた紫外線吸収のデータを示す図。同測定例における被検化合物の実効移動度とバッファのpHをプロットしたグラフ。同測定例における各被検化合物のpKa値を示す表。符号の説明１０…マイクロチップ１１…透明平板１２…サンプル導入流路１３…分離流路１４…交差部１５…透明平板１６〜１９…リザーバ２０…電源３０…リニアイメージUV検出器３１…光照射部３２…検出部４０…データ処理部５０…マイクロプレート６０…洗浄液容器７１…吸引部７２…注入/吸引部７３…配管７４…シリンジ７５…電磁弁 電気泳動を利用して被検化合物のpKaを測定する方法であって、 板状部材の内部に流路が形成され、その板状部材の一表面の流路に対応する位置に流路に達する穴がリザーバとして形成されたチップデバイスを使用して、被検化合物と電気浸透流マーカをpHの異なる複数のバッファで繰り返し電気泳動し、各泳動におけるバッファのpHと被検化合物の実効移動度の関係から前記被検化合物のpKaを求めることを特徴とするpKa測定方法。 請求項１に記載の方法を用いてpKaを測定するための装置であって、a) 板状部材の内部に流路が形成され、その板状部材の一表面の流路に対応する位置に流路に達する穴がリザーバとして形成されたチップデバイスと、b) pHの異なる複数のバッファを収容するバッファ収容手段と、c) 被検化合物及び電気浸透流マーカを含むサンプル溶液を収容するサンプル溶液収容手段と、d) 前記バッファを前記チップデバイスに供給するバッファ供給手段と、e) 前記サンプル溶液を前記チップデバイスに供給するサンプル溶液供給手段と、f) 前記流路に所定の電圧を加える電圧印加手段と、g) 該電圧によって前記流路内を泳動した被検化合物及び電気浸透流マーカのピークを検出するピーク検出手段と、h) 前記チップデバイスを洗浄するチップ洗浄手段と、i) 前記ピーク検出手段によって検出されたピークの位置から前記被検化合物の実効移動度を求めると共に、該実効移動度と各泳動におけるバッファのpHの関係から前記被検化合物のpKaを算出するデータ処理手段と、 を有することを特徴とするpKa測定装置。 上記ピーク検出手段としてリニアイメージ吸光度検出器を用いることを特徴とする請求項２に記載のpKa測定装置。 上記ピーク検出手段として蛍光検出器を用いることを特徴とする請求項２に記載のpKa測定装置。 【課題】 微量のサンプルであっても全自動でハイスループットにpKaを測定することのできるpKa測定装置及び測定方法を提供する 【解決手段】 微細流路を備えたマイクロチップを使用して、被検化合物と電気浸透流マーカをpHの異なる複数のバッファで繰り返し電気泳動し、その際のバッファのpHと被検化合物の実効移動度の関係から前記被検化合物のpKaを求める。【選択図】 図１