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| タイトル： | 公開特許公報(A)_脱色活性を有するペルオキシターゼ、当該ペルオキシターゼをコードするＤＮＡ、当該ペルオキシターゼが発現可能な形態で導入された微生物、および、脱色剤の製造方法 |
| 出願番号： | 2004246751 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | C12N 9/02,C02F 1/00,C12N 1/21,C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
澤 嘉弘 石川 孝博 芦田 裕之 柴田 均 JP 2006061063 公開特許公報(A) 20060309 2004246751 20040826 脱色活性を有するペルオキシターゼ、当該ペルオキシターゼをコードするＤＮＡ、当該ペルオキシターゼが発現可能な形態で導入された微生物、および、脱色剤の製造方法 国立大学法人島根大学 504155293 田邊 義博 100116861 澤 嘉弘 石川 孝博 芦田 裕之 柴田 均 C12N 9/02 20060101AFI20060210BHJP C02F 1/00 20060101ALI20060210BHJP C12N 1/21 20060101ALI20060210BHJP C12N 15/09 20060101ALI20060210BHJP JPC12N9/02C02F1/00 FC02F1/00 PC12N1/21C12N15/00 A 6 ＯＬ 10 特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年３月２９日 社団法人日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００４年度（平成１６年度）大会」において文書をもって発表 4B024 4B050 4B065 4B024AA17 4B024BA08 4B024CA03 4B024CA04 4B024DA06 4B024EA04 4B024GA11 4B024HA12 4B050CC01 4B050CC03 4B050DD20 4B050EE02 4B050FF11 4B050FF12 4B050LL04 4B050LL10 4B065AA26X 4B065AB01 4B065AC14 4B065BB12 4B065CA28 4B065CA54 4B065CA60 本発明は、ペルオキシターゼに関し、特に、バクテリア由来の脱色活性を有するペルオキシターゼに関する。 ペルオキシダーゼは過酸化水素を用いて物質の酸化反応を触媒するヘム酵素であり、高等生物から微生物に至るまで生物界に広く分布している。生体内における役割としては、代謝過程で生じる過酸化水素の除去が知られ、たとえば光合成により多量の過酸化水素が発生する植物細胞中では葉緑体に存在するアスコルビン酸ペルオキシダーゼがこれを分解・無毒化することがよく知れている。また、リグニンの生合成や分解、さらに、チロキシンその他の特定のホルモンの生合成にも関与していることも知られている。 また、ペルオキシダーゼは、試薬としても非常によく用いられており、たとえば、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素標識免疫吸着測定法）用の標識酵素や、グルコースやコレステロールなどの生体成分の定量用酵素としても用いられている。 さらに、近年ではペルオキシターゼの産業用酵素としての用途開発が進んでいる。たとえば、糸状菌由来のペルオキシターゼは洗剤用色移り防止酵素や着色排水の脱色酵素として大きな注目を集めてきている。特に、アゾ系、アントラキノン系、インジゴ系などの有機合成染料は、褪せないことが条件であるため、難分解性化合物とならざるを得ないところ、できるだけ環境負荷のかからない、低コスト低投入エネルギーの脱色分解方法としてペルオキシターゼの利用が注目されつつある。再公表特許ＷＯ００／５０５８２号 しかしながら、従来のペルオキシターゼでは以下の不具合があった。 現在最も脱色能力（分解能力）が高いと報告されている糸状菌Geotrichum candidium Dec 1由来のペルオキシターゼ（以降において適宜ＤｙＰと表示することとする）は、カビ由来すなわち真核生物由来であり、かつ、糖タンパクであるので、大腸菌により効率よく生産することは極めて困難であるという問題点があった。従って、大量生産できず、また、製造単価が極めて高くなるという問題点があった。 本発明は上記に鑑みてなされたものであって、大腸菌を用いた大量生産可能な、脱色活性を有する新規ペルオキシターゼを提供することを目的とする。 上記の目的を達成するために、請求項１に記載の蛋白質は、次の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質であることを特徴とする。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシターゼ活性および脱色活性を有するタンパク質。 また、請求項２に記載の蛋白質は、次の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシターゼ活性および脱色活性を有するタンパク質。 また、請求項３に記載の微生物は、請求項１に記載のタンパク質または請求項２に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質が発現可能な形態で導入された微生物であることを特徴とする。 また、請求項４に記載の微生物は、請求項３に記載の微生物において、微生物として大腸菌を用い、当該大腸菌を膜透過性付与大腸菌に調製したことを特徴とする。 また、請求項５に記載の脱色剤の製造方法は、請求項３または４に記載の微生物を培地で培養し、培養物中に脱色活性を有するペルオキシターゼを生成蓄積させ、該培養物より脱色活性を有するペルオキシターゼを採取することを特徴とする。 また、請求項６に記載の脱色剤の製造方法は、請求項３または４に記載の微生物を、５−アミノレブリン酸を添加した培地で培養し、培養物中に脱色活性を有するペルオキシターゼを生成蓄積させ、該培養物より脱色活性を有するペルオキシターゼを採取することを特徴とする。 本発明によれば、大腸菌を用いた大量生産可能な、脱色活性を有する新規ペルオキシターゼないし脱色剤を得ることができる。なお、バクテリア由来のペルオキシターゼは無いとされていたところ、本発明は数少ない例外報告例となる。 以下、本発明の実施例を詳細に説明する。（大腸菌の形質転換） まず、Anabaena PCC7120のゲノミックＤＮＡを抽出した。続いて、ＰＣＲ法を用いて、alr1585遺伝子を増幅した。このとき用いたプライマーの配列を配列番号３および配列番号４に示す。増幅に際しては、余分なＰＣＲ断片が増幅しないように、あらかじめゲノミックＤＮＡを制限酵素（Hpa I,Cla I）処理し、Taq polymeraseとしてTaKaRa Ex Taqを用いた。なお、アニーリング温度は４０℃と設定した。ＰＣＲ産物の電気泳動像を図１に示す。ここで、目的のサイズである約１５００ｂｐの単一バンドが確認できた。 続いて、ＰＣＲにより増幅させたＤＮＡ断片を、発現用ベクターであるpUC18のEcoRIサイト並びにPstIサイトへ挿入した。これを、大腸菌 MV1184株にトランスフォーメーションした。形質転換した大腸菌中のプラスミドの塩基配列を実際に確認して、目的のalr1585の挿入を確認した。確認には、ABI PRSM 3100 Genetic Analyzerを用いた。また、別途制限酵素処理によっても挿入を確認した。このときの電気泳動図を図２に示す。（Anabaena PCC7120alr1585由来タンパク質の発現確認および精製） 次に、タンパク質を精製すると共に発現を確認した。具体的には、まず、形質転換された大腸菌を、ＬＢ培地中で３７℃で１晩培養した。このとき、培地へIPTG（isopropyl-thio-β-D-galactoside）を添加して、目的タンパク質を誘導した。目的タンパク質以外にも大腸菌由来の夾雑タンパク質が多く存在するため、精製により発現を確認することとした。 精製に関しては、まず、リコンビナント大腸菌をフレンチプレスにより破砕し、DEAE-Toyopearlイオン交換クロマトグラフィー（東ソー株式会社製）、Butyl-Toyopearl疎水性クロマトグラフィー（東ソー株式会社製）、Superdex200ゲル濾過クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）をおこなうことにより、均一にまで精製した。図３は、SDS-PAGE電気泳動法により精製を確認した図である。また、SDS-PAGEの結果より、分子量マーカーからキャリブレーションカーブを作成したところ、分子量が約５４ｋＤａであった（図４参照）。MALDI-TOF−Massスペクトル解析による分子量は５３．３ｋＤａであった（図５参照）。これらの値は、アミノ酸配列（配列番号２参照）から求めた計算分子量５３，４９９Ｄａとよく一致した。以上から、目的タンパク質が得られたことが確認できた。 一方、ゲル濾過により、ネイティブ分子量の測定を行ったところ、２１０ＫＤａであり、このタンパク質は、四量体構造であることが確認できた。なお、以降ではこのタンパク質をalr1585タンパク質と称することとする。（alr1585タンパク質の性質） 次に、精製されたalr1585タンパク質のペルオキシダーゼとしての基質特異性を調べた。図６に、alr1585タンパク質の基質特異性を測定した結果を示す。なお、植物由来のペルオキシターゼとしてよく知られているＨＲＰ（Horseradish roots peroxidase：西洋わさびペルオキシターゼ）と比較した。測定に際して使用した過酸化水素水濃度は、０．２〜０．６ｍＭであり、酵素を添加することで反応を開始させた。また、反応温度は、３７℃とした。なお、ｐＨは４．０に調整した。 図から明らかなようにalr1585タンパク質は、ペルオキシターゼ活性を示し、ＨＲＰと比較して、Ascorbate(AsA）、D-iso-AsA、NADH、NADPH、4-aminoantipyrine、および、Reactive Blue5に対して良好な反応性を示すことがわかった。 なお、alr1585タンパク質がカタラーゼ活性を有するか、すなわち、ペルオキシターゼであるのか、それとも、カタラーゼペルオキシターゼであるのかを検討した。図７に、各精製過程におけるカタラーゼ活性とペルオキシターゼ活性とを測定した結果を示した。図から明らかなように、精製するにつけカタラーゼ活性は低くなり、ペルオキシターゼ活性が大きくなっていく様子が確認できる。すなわち、alr1585タンパク質は、カタラーゼ活性を持たない、バクテリア由来（原核生物由来）の新規なペルオキシターゼであることが確認できた。 図８は、alr1585タンパク質の吸収スペクトルを示した図である。波長λ＝４０４ｎｍにヘム特有の吸収が確認されたことから、alr1585タンパク質は、ヘムタンパク質であることが確認できた。ヘムタンパク質である事実に基づいて、大腸菌をトランスフォーメーションする際に、培地に、ヘムの原料物質である５―アミノレブリン酸を添加したところ、alr1585タンパク質の発現量が２０〜３０％増大することが確認できた。なお、吸収スペクトルのＲｚ（λ408／λ280）値を比較したところ、alr1585タンパク質は、Ｒｚ＝１．３であり、ＨＲＰのＲｚ値３．０とも大きく相違し、この点からもalr1585タンパク質は新規なペルオキシターゼであることが確認できた。（alr1585タンパク質の性質：脱色活性） 続いて、alr1585タンパク質の脱色活性を調べることとした。色素としては、Reactive Blue 5（ＲＢ５）を用いることとした。反応組成を図９に示す。脱色活性の評価は、３７℃における６００ｎｍの吸光度の減少から算出することとし、１ユニットを、１分で１μｍｏｌのＲＢ５を脱色した酵素量として定義することとした。図１０に、ユニット計算式を示す。 まず、至適ｐＨを検討した。図１１は、alr1585タンパク質とＨＲＰの至適ｐＨを検討した結果を示した図である。図から明らかなように、alr1585タンパク質は、至適ｐＨが４．０で、ＨＲＰの至適ｐＨである３．８と比較して中性寄りであり、かつ、広いレンジにわたって活性が高いことが確認できた。 次に、２５℃〜４５℃の範囲の活性を調べることにより最適温度を測定した。図１２は、最適温度を調べた結果を示した図である。図からalr1585タンパク質の最適温度は、３７℃付近であることが確認できた。また、検討した２５℃〜４５℃の範囲でも、ＨＲＰと比較しても同等程度の活性を有することが確認できた。 次に、alr1585タンパク質の温度安定性を測定した。これは、alr1585タンパク質を３０分間所定温度に保った後、３７℃、ｐＨ３．８雰囲気下の活性を測定することにより検討した。検討結果を図１３に示す。図示したように、３０℃または４０℃では、活性が長期間にわたり損なわれないことが確認できたが、５０℃を超えると１時間程度で活性が半減してしまうことが分かった。 次に、過酸化水素水耐性を検討した。これは、alr1585タンパク質およびＨＲＰを３７℃ｐＨ３．８雰囲気下で所定濃度の過酸化水素水に３０分さらした後の活性を測定することによりおこなった。測定結果を図１４に示す。図示したように、ＨＲＰに比して、過酸化水素水耐性が高いことが確認できた。 次に、ＲＢ５を基準として各種色素に対して、脱色活性を測定した。測定結果を図１５に示す。図示したように、種々の色素に対して脱色活性が見られた。従って、alr1585タンパク質は、脱色酵素として使用でき、脱色活性を有するペルオキシターゼであることが確認できた。 なお、過酸化水素水に対するＫｍ値を測定したところ、ＨＲＰやＤｙＰの値がそれぞれ２６μＭ、３６μＭであったのに対し、alr1585タンパク質の値は５．８μＭであり、過酸化水素水との親和性が非常に高いことが確認できた。また、ＲＢ５に対するＫｍ値を測定したところ、ＨＲＰやＤｙＰ（参考文献１記載のペルオキシターゼ）の値がそれぞれ５４μＭ、５８μＭであったのに対し、alr1585タンパク質の値は３．６μＭであり、ＲＢ５に対しても非常に親和性が高いことが確認できた。 本発明によれば、染料工場廃水を脱色することができる。また、髪の脱色剤としての応用も可能となる。なお、廃水の脱色に際しては、精製まで至らない大腸菌を用いることもできる。このとき、膜透過性を付与した大腸菌が好ましく、廃液に投入して使用可能である。なお、膜透過性付与大腸菌はトルエン処理することにより得られる。ＰＣＲ産物の電気泳動像を示した図である。ＤＮＡ断片がpUC18へ組み込まれたことを確認する電気泳動図である。SDS-PAGE電気泳動法により精製を確認した図である。SDS-PAGEの結果より、分子量マーカーからキャリブレーションカーブを作成した様子を示した図である。TOF−Massスペクトルを示した図である。alr1585タンパク質の基質特異性を調べた結果を示した図である。alr1585タンパク質の各精製過程におけるカタラーゼ活性とペルオキシターゼ活性とを測定した結果を示した図である。alr1585タンパク質の吸収スペクトルを示した図である。ＲＢ５を用いた脱色活性を測定する際の反応組成を示した図である。脱色活性を判定するユニットの計算式を示した図である。alr1585タンパク質とＨＲＰの至適ｐＨを検討した結果を示した図である。alr1585タンパク質の最適温度を調べた結果を示した図である。alr1585タンパク質の温度安定性を測定した結果を示した図である。alr1585タンパク質の過酸化水素水耐性を検討した結果を示した図である。alr1585タンパク質の各種色素に対する脱色活性をＲＢ５を基準として比較した測定図である。 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシターゼ活性および脱色活性を有するタンパク質。 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシターゼ活性および脱色活性を有するタンパク質。 請求項１に記載のタンパク質または請求項２に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質が発現可能な形態で導入された微生物。 微生物として大腸菌を用い、当該大腸菌を膜透過性付与大腸菌に調製したことを特徴とする請求項３に記載の微生物。 請求項３または４に記載の微生物を培地で培養し、培養物中に脱色活性を有するペルオキシターゼを生成蓄積させ、該培養物より脱色活性を有するペルオキシターゼを採取することを特徴とする脱色剤の製造方法。 請求項３または４に記載の微生物を、５−アミノレブリン酸を添加した培地で培養し、培養物中に脱色活性を有するペルオキシターゼを生成蓄積させ、該培養物より脱色活性を有するペルオキシターゼを採取することを特徴とする脱色剤の製造方法。 【課題】 大腸菌を用いた大量生産可能な、脱色活性を有する新規ペルオキシターゼを提供すること。【解決手段】 （Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。（Ａ）Ａｎａｂａｅｎａ Ｐｃｃ７１２０のゲノミックＤＮＡ由来の特定なアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）Ａｎａｂａｅｎａ Ｐｃｃ７１２０のゲノミックＤＮＡ由来の特定なアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペルオキシターゼ活性および脱色活性を有するタンパク質。【選択図】なし配列表