生命科学関連特許情報
| タイトル： | 再公表特許(A1)_ヘモグロビン精製法 |
| 出願番号： | 2004019822 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | C07K 14/805,A61K 35/14,A61P 7/06 |
特許情報キャッシュ
武岡 真司 土田 英俊 宗 慶太郎 JP WO2005063814 20050714 JP2004019822 20041227 ヘモグロビン精製法 株式会社 オキシジェニクス 503185437 学校法人早稲田大学 899000068 小林 浩 100092783 片山 英二 100095360 小林 純子 100093676 大森 規雄 100120134 武岡 真司 土田 英俊 宗 慶太郎 JP 2003433548 20031226 C07K 14/805 20060101AFI20071122BHJP A61K 35/14 20060101ALI20071122BHJP A61P 7/06 20060101ALI20071122BHJP JPC07K14/805A61K35/14 BA61P7/06 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW 再公表特許(A1) 20071220 2005516743 12 4C087 4H045 4C087AA01 4C087AA02 4C087AA05 4C087BB36 4C087DA03 4C087DA17 4C087ZA55 4H045AA20 4H045BA52 4H045BA70 4H045CA42 4H045EA24 4H045GA01 4H045GA45 本発明は、赤血球からヘモグロビン（Ｈｂ）を精製する方法において、特にＨｂの変性や劣化を起こさず、高収率で安定してＨｂを確保するために赤血球を凍結、冷凍保管する工程を含む方法に関するものである。 赤血球から単離・精製したヘモグロビン（Ｈｂ）は、赤血球代替物の原料として使用できる。このため、一定規格を満足できるヘモグロビン原料を安定に得る方法が求められている。通常、赤血球は冷蔵保管（４℃）されるが、採血により体外に取出された赤血球は、時間とともに各種化学変化（溶血、膜成分変性、代謝産物生成、Ｈｂ酸化、雑菌繁殖など）の進行により劣化していくため、高純度Ｈｂを得ることが困難になる。 特に、酸素輸送の役割を担うＨｂは、ヘム中心鉄が二価（Ｆｅ２＋）の場合に限り酸素を結合解離できるが、酸素解離に伴う電子移動（自動酸化）、あるいは活性酸素など何らかの外的因子により中心鉄が三価（Ｆｅ３＋、ｍｅｔＨｂ）に酸化されると酸素結合能を消失し、Ｈｂ原料として使用できなくなる（これをメト化という）。赤血球内ではメト化ヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）は還元酵素類により速やかに還元され、その原因となる活性酸素はスーパーオキシドディスミューターゼやカタラーゼなどの酵素により消去されるため、ｍｅｔＨｂ濃度は低値に保持されているが、この機能も冷蔵保存（４℃）中に劣化していき、ｍｅｔＨｂの蓄積が進行する。従って、赤血球からＨｂを精製する方法には、採血後一定期間内に簡単、安価な方法でＨｂを酸化され難い環境に移行する工程が必要となり、この移行までの期間、環境条件設定が不可欠となる。赤血球からＨｂを精製する方法は公知となっているものもある（特開平９−１２５９８号公報、特表２００２−５２０３３８号公報）が、これら方法の前提となる赤血球の取扱いに関する工程は全く含まれておらず、もちろん、その際の条件設定はなされていない。更には、人から採血した血液のうち、保管期限が経過したもの（日本では３週間）を利用する場合には、保管期限の経過後の品質管理はより困難となる。また、赤血球のような細胞構造を有する物質の凍結は、保護剤の添加なしには困難とされていた（特表２００２−５１６２５４号公報）。しかも保護剤の添加や除去は操作が煩雑となるため、大量精製工程には適さない。 このような状況では、得られる精製Ｈｂの性状が、原料として使用する赤血球の保管条件や保管期間に大きく影響を受けるため、その品質が安定しない問題があった。精製Ｈｂを安定的に得るためには、赤血球の状態のまま管理する工程を含めたＨｂ精製法の確立が必要となる。 本発明者らは、上記実状に鑑み、鋭意検討を行なった結果、赤血球を凍結保存させた後に精製すると、赤血球に含まれるＨｂが安定に保持されることを見出した。また、洗浄赤血球についてこの凍結を行うことを条件として、Ｈｂ収量の低下も防止できた。このような工程が含まれるＨｂ精製法によれば、赤血球の使用期限が飛躍的に増大し、かつ安定した性状の精製Ｈｂが得られることが見出され、本発明に到った。 すなわち、本発明は、赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、赤血球を凍結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法である。 また、前記方法は、凍結保存工程が、採血された赤血球を４℃〜１０℃で保存する工程、赤血球を洗浄する工程、洗浄赤血球を凍結する工程及び凍結された赤血球を冷凍保存する工程を含んでいてもよい。 赤血球を採血してから凍結する工程までの日数は、例えば１〜６０日である。 さらに、凍結する工程及び冷凍保存する工程における温度は、例えば−６０℃以下である。 本発明により、赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、赤血球を凍結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法が提供される。本発明のヘモグロビンの精製方法により、赤血球の使用期限が飛躍的に増大し、かつ安定した性状の精製Ｈｂが得られる。 以下に、本発明を詳細に説明する。 本発明において、赤血球は各種動物（ヒト、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられるが、限定されるものではない）由来の血液より得られ、好ましくは、採血後に遠心分離、限外濾過、膜濾過、またその組み合わせにより白血球、血小板、血漿成分の大部分が除去された赤血球分散液が用いられる。献血によって得られた血液から遠心分離によって血漿成分を除去し、安定化剤としてＭＡＰ液を添加した濃厚赤血球製剤である赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．のうち、その保管期限（採血後２１日間）が経過したものが使用される。ここで、ＭＡＰ液とは、主としてマンニトール、アデニン、結晶リン酸二水素ナトリウムを含む溶液であり、赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．とは、赤血球生存率の向上を図るため、濃厚赤血球液中の抗凝固剤であるＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を除いてこのＭＡＰ液に置換したものである。 赤血球を冷蔵保管する工程は４〜１０℃が好ましく、通常の冷蔵庫、血液保冷庫、保管庫などの何れを用いてもよい。４℃より低温で保管して凍結した場合、還元酵素機能不能によるｍｅｔＨｂ（メト化ヘモグロビン）の蓄積、また、赤血球溶血により次の洗浄工程でのＨｂ収率低下などの問題が生じ、また１０℃より温度が上昇した場合は、ｍｅｔＨｂ生成、各種代謝産物の生成、雑菌の繁殖など、劣化が加速されるので好ましくない。 赤血球を洗浄する工程は、赤血球と残存する白血球、血小板、血漿成分、また保存中に生成した水溶性物質を分離できる何れの方法を用いてもよく、例えば遠心分離、限外濾過、膜濾過、またその組み合わせが挙げられる。洗浄後の赤血球は、遠心分離により得られる赤血球ペレットあるいは晶質浸透圧を赤血球と同等にした溶液に分散させてもよいが、ヘモグロビン精製工程で除去が困難な添加物は避けるべきである。赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．の場合には、期限が経過した後に、各血液センターや病院にて、採血バッグに生理食塩水を注入後分散させてバッグ毎高速遠心分離を行うことにより、バフィーコート（白血球と血小板の層）を含めた上清を除去する操作を２回から４回繰り返し、最終的には濃厚赤血球の状態とするのが好ましい。 洗浄赤血球を−６０℃以下で凍結する工程は、適当な冷媒中への浸漬、冷媒噴霧、冷凍庫、保冷庫などの何れを用いてもよく、特に急速凍結には液体窒素や−８０℃の冷凍庫、噴霧凍結などが有効である。赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．の場合はバッグ毎に凍結させればよい。本発明においては、赤血球を採血してから凍結する工程までの日数は、例えば１〜６０日である。 冷凍保管は適当な冷媒中への浸漬、冷媒噴霧、冷凍庫など何れの方法を用いてもよい。凍結によりＨｂの高次構造が変化した状態で、結合水が凍結していない場合には、ｍｅｔＨｂの生成が促進される場合があるので、−６０℃以下で実施することが好ましい。赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．の場合には、凍結させた状態でヘモグロビンを精製する箇所に収集させてもよい。 ヘモグロビン精製法は、何れの方法を用いてもよく、例えば常法によって溶血し、遠心分離や限外濾過によりストローマ成分のみを除去したストローマフリーヘモグロビン溶液、ヘモグロビンを単離した精製ヘモグロビン溶液として得られる。 上記精製法において、限外濾過は、例えば限外分子量７０ｋ〜１０００ｋＤａ、好ましくは５００ｋＤａの限外濾過膜を用いることができる。ストローマ成分を除去した溶液は、必要により脱気および一酸化炭素ガス通気を行い、９８％以上カルボニルＨｂに変換させることが好ましい。その後、Ｈｂ溶液を恒温槽中で攪拌し、次いで所定の遠心速度で遠心分離し、沈殿した変性夾雑蛋白質を除去する。得られた溶液を限外濾過することにより、透過液として精製ヘモグロビン溶液を得ることができる。 以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．の保存形態の比較 日本赤十字血液センターより提供された保管期限が経過した赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．２００ｍｌバッグ（採血後２７日経過）から約１４０ｍＬを取り出して遠沈菅に入れ、４℃にて遠心分離（２，０００×ｇ、１５分）を行い、バフィーコートを含めた上清を除去した。更に生理食塩水７０ｍＬを添加して攪拌した後、遠心分離を行い洗浄した。この操作を四回繰り返して濃厚赤血球を得た。この濃厚赤血球をポリエチレン容器に３ｍＬずつ分注して、冷蔵庫（４℃）、冷凍庫（−２０℃）、あるいはディープフリーザー内（−８０℃）で保存した。その後、所定日数が経過した試料を４℃の冷蔵庫内で解凍して、シアノメトヘモグロビン法によりメトヘモグロビン含有率（メト化率）を測定した。得られた結果を表１に示す。冷蔵庫（４℃）および冷凍庫（−２０℃）で保存した場合には、日数経過に伴いメト化率の上昇が認められ、特に−２０℃では凍結から１４日後に３７．１％という著しい上昇が認められた。他方、ディープフリーザー（−８０℃）内で保存した場合には３ヶ月経過後でもメト化率の上昇は認められなかった。 赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．の冷蔵保存温度 日本赤十字血液センターより提供された保管期限が経過した赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．を４℃にて冷蔵保存し、採血日から数えて２７日経過した時点で分注し、４、１０、１５、あるいは２０℃の保冷庫内で保存した。採血日から数えて５８日経過した試料について、シアノメトヘモグロビン法によりメトヘモグロビン含有率（メト化率）を測定した。４および１０℃で保存した場合のメト化率は各々２．８および６．４％であったが、１５および２０℃の場合は、１３．２および１８．３％まで上昇が認められた。１０℃以下で保存した場合は、少なくとも採血後６０日までのメト化率は１０％以下に留まった。 赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．の冷蔵保存期間 日本赤十字血液センターより提供された保管期限が経過した赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．を４℃にてバッグのまま冷蔵保存し、採血日から数えて２７、４１、５８、あるいは８７日経過した時点で約１４０ｍＬずつ取り出し、遠沈菅に移して遠心分離（２，０００×ｇ、１５分）を行い、バフィーコートを含めた上清を除去した。更に生理食塩水７０ｍＬを添加して攪拌した後、遠心分離により洗浄した。この操作を三回繰り返して濃厚赤血球を得た。この濃厚赤血球をポリエチレン容器に３ｍＬずつ分注して、ディープフリーザー内（−８０℃）で保存した。その後、所定日数が経過した試料を４℃の冷蔵庫内で解凍して、シアノメトヘモグロビン法によりメトヘモグロビン含有率（メト化率）を測定した。得られた結果を表２に示す。４℃では、保存期間が長くなるにつれて凍結解凍後のメト化率は上昇することが明らかになった。これにより、解凍時のメト化率の上限を１０％程度とした場合、採血してから凍結するまでの日数は６０日以内が適していると判断された。 凍結赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．からのＨｂ精製方法 日本赤十字血液センターより提供された赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．（採血後２８日経過）４００ｍＬバッグを液体窒素に１０分間浸漬して凍結させ、次いで冷凍庫（−８０℃）にて６０日間保存した後、冷蔵庫内（４℃）で解凍した。この解凍赤血球について、４℃にて遠心分離（２，０００×ｇ、１５分）を行ったところ、上清は濃赤色を呈しており、凍結融解操作による赤血球の溶血が認められた。バフィーコートを含めた上清を除去した後、更に生理食塩水１４０ｍＬをバッグに添加して攪拌後、遠心分離して洗浄した。この操作を四回繰り返して濃厚赤血球を得た。このとき、シアノメトヘモグロビン法により求めたメト化率は１．３％で、ヘモグロビン収率は６３％であった。 次に、濃厚赤血球をポリエチレンの容器に移し、等容量の注射用水を添加して赤血球を低張溶血させ、限外濾過（限外分子量：１０００ｋＤａ）を行い、ストローマ成分を除去した。この溶液に脱気および一酸化炭素ガス通気を５回繰り返し、９８％以上カルボニルＨｂに変換させた。このカルボニルＨｂ溶液を６０℃の恒温槽中で１２時間攪拌し、次いで遠心分離（３，０００×ｇ、３０分）により沈殿した変性夾雑蛋白質を除去した。得られた溶液を限外濾過（限外分子量：１０００ｋＤａ）を行うことにより、透過液として精製ヘモグロビン溶液を得た。この方法で得られたＨｂ溶液の性状を表３に示す。 凍結洗浄赤血球からのＨｂ精製方法 日本赤十字血液センターより提供された赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．４００ｍｌバッグを４℃にて保存し、採血日から数えて３０日目に生理食塩水１４０ｍＬを添加してバッグのまま４℃にて遠心分離（２，０００×ｇ）を行い、バフィーコートを含む上層を除去した。この場合には赤血球の溶血は認められなかった。更に生理食塩水１４０ｍＬをバッグに添加して遠心分離する操作を三回繰り返して濃厚赤血球を得た。次に、バッグのまま液体窒素に浸漬して凍結させ、冷凍庫（−８０℃）にて６０日間保存した後、この凍結濃厚赤血球を冷蔵庫内（４℃）で解凍した。このとき、シアンメト法により求めたメト化率は０．９％、ヘモグロビン収率は９０％であった。 次に、解凍した濃厚赤血球をバッグからポリエチレン容器に移した後、等容量の注射用水を添加して赤血球を低張溶血させ、限外濾過（限外分子量：１０００ｋＤａ）を行うことによりストローマ成分を除去した。次に、この溶液に脱気および一酸化炭素ガス通気を５回繰り返して、９８％以上カルボニルＨｂに変換させた。このカルボニルＨｂ溶液を６０℃の恒温槽中で１２時間攪拌し、次いで遠心分離（２，０００×ｇ、３０分）を行い、沈殿した変性夾雑蛋白質を除去した。得られた溶液を限外濾過（限外分子量：１０００ｋＤａ）により、透過液として精製ヘモグロビン溶液を得た。この方法で得られたＨｂ溶液の性状を表４に示す。 凍結洗浄赤血球からのＨｂ精製方法 日本赤十字血液センターより提供された赤血球Ｍ．Ａ．Ｐ．を４℃にて保存し、採血日から数えて３６日目にバッグからポリエチレン容器に移した１０Ｌを４℃にて遠心分離（２，０００×ｇ）して、バフィーコートを含めた上清を除去した。この場合、左程赤血球の溶血は認められなかった。更に生理食塩水５Ｌを添加して攪拌した後、遠心分離を行うことにより洗浄した。この操作を四回繰り返して濃厚赤血球を得た。次に、濃厚赤血球を冷凍庫（−８０℃）にて凍結させ、そのまま３０日間保存した後、この凍結洗浄赤血球を冷蔵庫内（４℃）で解凍した。このとき、シアンメト法により求めたメト化率は０．７％、ヘモグロビン収率は９３％であった。 次に、濃厚赤血球に等容量の注射用水を添加して赤血球を低張溶血させ、限外濾過（限外分子量：１０００ｋＤａ）にてストローマ成分を除去した。次に、この溶液に脱気および一酸化炭素ガス通気を５回繰り返し、９８％以上カルボニルＨｂに変換させた。このカルボニルＨｂ溶液を６０℃の恒温槽中で１２時間攪拌し、次いで遠心分離（２，０００×ｇ、３０分）を行うことにより、沈殿した変性夾雑蛋白質を除去した。この溶液に０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を添加し、溶液ｐＨを７．４に調節した。得られた溶液を限外濾過（限外分子量：１０００ｋＤａ）し、透過液として精製ヘモグロビン溶液を得た。この溶液を限外濾過（限外分子量：８ｋＤａ）することにより、濃厚Ｈｂ溶液を得た。この方法で得られたＨｂ溶液の性状を表５に示す。 本発明により、ヘモグロビンの精製法が提供される。本発明の方法によれば赤血球を凍結保存させた後に精製すると、赤血球に含まれるＨｂが安定に保持されるため、赤血球の使用期限が飛躍的に増大する。従って、本発明は救急医療分野等において極めて有用である。 赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、赤血球を凍結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法。 凍結保存工程が、採血された赤血球を４℃〜１０℃で保存する工程、赤血球を洗浄する工程、洗浄赤血球を凍結する工程及び凍結された赤血球を冷凍保存する工程を含む請求項１記載の方法。 赤血球を採血してから凍結する工程までの日数が１〜６０日である請求項２記載の方法。 凍結する工程及び冷凍保存する工程における温度が−６０℃以下である請求項２又は３記載の方法。 本発明は、赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、赤血球を凍結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法を提供する。