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| タイトル： | 特許公報(B2)_チオール末端核酸の組成物 |
| 出願番号： | 2004019270 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | G01N 33/531,C12N 15/09,C12Q 1/68,G01N 21/21,G01N 21/27,G01N 33/53,G01N 33/543 |
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京 基樹 稲森 和紀 JP 4228299 特許公報(B2) 20081212 2004019270 20040128 チオール末端核酸の組成物 東洋紡績株式会社 000003160 京 基樹 稲森 和紀 20090225 G01N 33/531 20060101AFI20090205BHJP C12N 15/09 20060101ALI20090205BHJP C12Q 1/68 20060101ALI20090205BHJP G01N 21/21 20060101ALI20090205BHJP G01N 21/27 20060101ALI20090205BHJP G01N 33/53 20060101ALI20090205BHJP G01N 33/543 20060101ALI20090205BHJP JPG01N33/531 BC12N15/00 FC12Q1/68 AG01N21/21 ZG01N21/27 CG01N33/53 MG01N33/543 595 Ｇ０１Ｎ ３３／４８−９８ 国際公開第９８／０２００２０（ＷＯ，Ａ１） 特開平０２−１１１７５７（ＪＰ，Ａ） 国際公開第０３／００８５３９（ＷＯ，Ａ１） 特表２００３−５３６０７３（ＪＰ，Ａ） 国際公開第２００４／００５３１９（ＷＯ，Ａ１） 特表２００２−５１９６６８（ＪＰ，Ａ） 3 2005214690 20050811 9 20060206 海野 佳子 本発明は、チオール末端核酸のチオール基を酸化させない組成物。さらにはチオール末端核酸を効率的に固体表面に固定化し、相互作用を測定する方法に関する。 核酸を固体表面に固定化し、相互作用を測定する方法はＤＮＡチップの分野で広く使われている。ＤＮＡチップの分野では、相互作用の対象が核酸に限られるため、ＤＮＡを固定化する方法として、さまざまな方法が選択可能である。例えば、（１）正電荷をもつ物質を表面に導入しておき陰電荷を有するＤＮＡと静電的に表面に結合する方法、（２）表面にアルデヒド基を導入した表面を形成させ、シフベースによってアミノ基末端ＤＮＡと可逆的に結合させる方法などが取られてきた。 上記の方法は、相互作用の対象が核酸の場合は、測定可能であるが、蛋白質などの立体障害が問題となる物質が対象である場合は、採用できないことが多い。すなわち、（１）の方法ではチップ上のＤＮＡが固体表面に寝そべる形となりやすく、蛋白質などの測定対象物質が相互作用できないことが想定される。（２）の場合は核酸が有するアミノ基と表面の官能基が反応する可能性があるため、必ずしも末端で表面に固定化されない。その場合、固定化されたＤＮＡの測定対象物質に対する結合部位が破壊され、結合能を失う危険性が生じる。 これらの問題点を克服するために、核酸が有さない官能基を、核酸の末端に導入し、表面に固定化する方法が取られてきた。それらの官能基が導入された核酸としてビオチン末端ＤＮＡが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）と水晶発振子の分野で広く用いられている。ここではストレプトアビジンあるいはアビジンを固相化し、ビオチン末端ＤＮＡを表面に導入する方法が取られる。しかし、ストレプトアビジンやアビジンの固相化は多くのステップが必要であったり、均一な固定化が困難あったりする問題点がある。また、ビオチン−アビジンの結合は強固ではあるものの、水素結合であり、純水、高イオン性溶液、有機溶媒によって結合が解離する危険性がある。また、アビジンは蛋白質であるため、長期安定性も問題となる。 そこで、Ｂｒｏｃｋｍａｎらは５’チオール末端のＤＮＡを金表面に導入したマレイミド基と反応させて固相化し、ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ結合性蛋白（ＳＳＢ）の相互作用をＳＰＲイメージング法によって観察した（特許文献１）。この方法は非常に優れており、必ずＤＮＡは末端で表面に固定化される。しかし、チオール末端ＤＮＡは酸化されやすく、酸化されるとジスルフィドとなりマレイミド基への反応性を失う。チオール末端のＤＮＡは保護基をない状態でも供給される場合があるが、その場合、すぐに酸化され、固定化効率が非常に悪い。 チオール末端ＤＮＡはジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール基を有する還元剤を含む組成物として供給される場合もある。この場合はＤＴＴと表面に導入されたマレイミド基が反応するため、ＤＮＡの固定化効率は極度に低下する。一般的にチオール末端ＤＮＡは保護基をつけた状態で供給され、使用前に脱保護し、ＨＰＬＣまたはゲルろ過によって精製する必要が生じる。これらの操作は非常に煩雑である。また、脱保護したチオール末端ＤＮＡの保存はせいぜい１ヶ月程度である。 金−硫黄結合を利用して直接、チオール末端ＤＮＡを固相化する方法も提案されている（非特許文献１、２）。この場合、チオール基が酸化されてジスルフィドとなっても、金への結合能を有するため、ＤＮＡの固相化は可能である。この場合、チオール末端ＤＮＡとヒドロキシ基末端アルカンチオールを混合して自己組織化表面（ＳＡＭ）を形成させる。しかし、ＤＮＡのジスルフィドは金に結合したときにＤＮＡ同士の立体障害のために、ＳＡＭに欠陥を生じる可能性が高い。欠陥のあるＳＡＭは非特異的吸着が多い問題が生じる。この場合も、酸化されていないチオール末端ＤＮＡを採用した方が無難である。よって前述のチオール末端ＤＮＡの保存安定性の問題を共通に有している。 このように、チオール末端核酸を酸化されない状態で保存する方法が必要とされている。また、その場合に、表面に固定化される際に影響の与える物質を加えると問題が生じるため好ましくない。本発明はチオール基を有さない還元剤を含む溶液中でチオール末端核酸を保存する組成物についての技術を開示する。米国特許第６１２７１２９号明細書Ｈｅｒｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９巻、８９１６−８９２０頁 （１９９７年）Ｂｏｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０巻、２８２−２８６頁 （２００２年） 本発明の課題は、チオール末端核酸を酸化させることなく保存することが可能であり、かつ、保存後もチオール末端核酸を効率的に固相化することが可能な組成物を提供するものであり、また、その組成物を用いて、チオール末端核酸を効率的に固相化し、固定化した核酸と測定対象物質の相互作用を測定する方法することにある。本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。１．表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて２種以上の核酸と測定対象物質の相互作用を測定するために金表面に固定化するチオール末端核酸を保存する方法であって、該チオール末端核酸の組成物の溶液中に、還元剤としてホスフィン系物質を含むことを特徴とする保存方法。２．ホスフィン系物質がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩であることを特徴とする１に記載の保存方法。３．冷凍にて保存することを特徴とする１又は２に記載の保存方法。 本発明により、チオール末端核酸を酸化されることなく保存することができ、表面への固定化反応に対する阻害物質が含まれることがないため、高い効率で固相化することができ、固定化した核酸と測定対象物質の相互作用を観察することが非常に容易となる。 以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、チオール末端ＤＮＡを酸化されずに保存する組成物、前記組成物を用いて、チオール末端ＤＮＡを固相化し相互作用を観察する方法を開示している。 本発明における組成物には、チオール末端の核酸が含まれる。核酸は特に限定されるものではなく、ＤＮＡやＲＮＡ、さらには非天然核酸が挙げられる。末端の方向も特に限定されるものではなく、５’側でも３’側でも構わない。また、核酸は一本鎖であっても二重鎖であっても三重鎖であってもよい。 組成物は常温（２５℃）では液体であり、上記のチオール末端の核酸が溶解した溶液である。溶液の溶媒は水系、有機溶媒等、特に限定されるものではないが、常識的には水系の緩衝液が使用される場合が多い。組成物は冷却されて固体状態で保存されてもよい。組成物中のチオール末端核酸の濃度は特に限定されるものではないが、一般的には１μＭから１ｍＭの範囲で保存される。また、使用前に緩衝液等で希釈し、使用してもよい。 組成物には核酸の末端のチオールの酸化を防止し、長期保存を可能にするため、還元剤が含まれるが、還元剤としてはチオール基を有さない物質が選択される。従って、ＤＴＴなどのチオールを有する還元剤を含む組成物は本発明には含まれない。チオールを有さない還元剤は、一般に還元剤、酸化防止剤、抗酸化剤などとしての機能を有するもので、チオール基を有さないもので有れば、特に限定される物ではない。なお、本発明では還元剤、酸化防止剤、抗酸化剤などとしての機能を有するものを総称して還元剤と言う。また、チオール基を有さない還元剤は、非チオール系還元剤、ノンチオール系還元剤、などとも称される。 チオール基を有さない還元剤の例としては、＞Ｃ＝Ｏ ←→ ＝Ｃ（ＯＨ）−の酸化還元系、＝Ｎ− ←→ ―ＮＨ―の酸化還元系、ポリエンの酸化機構を利用する系、リンの酸化作用を利用する系などが挙げられ、ビタミンC、E、Bおよびこれらの誘導体類、ポリフェノール類（具体例として、プロアントシアニジン,フラボノイド、プロアントシアニジン、プロシアニシン、プロアント、シアニドリック・オリゴマー類、ピクノジエノール類、カテキン類、等）、キノール〔還元型キノン〕類（具体例として、ユビキノ−ル、トコキノール、プラストキノール、メナキノール（ビタミンQ）、等）、クロマノール類（具体例として、ユビクロマノール、等）、フェノールカルボン酸類（具体例として、没食子酸、等）、フェノール誘導体（具体例として、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、エリソルビン酸類（具体例として、エリソルビン酸，エリソルビン酸ナトリウム、等）、カロチノイド（具体例として、α−カロチン、ルテイン、リコピン、リコペン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カプサイシン β-カロテン、等）、リンの酸化作用による還元剤としては、ホスフィン系の物質などが挙げられる。 これらの還元剤は複数を組み合わせて用いることができる。 中でも、還元剤としてはホスフィン系の物質が好ましく、アリルジフェニルホスフィン、ベンジルジフェニルホスフィン、（２−ビフェニル）ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などが挙げられる。中でも、水溶性で容易に入手可能なトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩が特に好ましい。 チオール基を含まない還元剤の組成物中の濃度は特に限定されるものではなくが、１０μＭから１０ｍＭの範囲で使用されることが推奨され、１００μＭから１ｍＭの範囲が特に推奨される。 なお、チオール基を含む還元剤も少量で有れば含まれていても良いが、チオール末端核酸のチオール基に対して、還元剤のチオール基は当量で０．２以下であることが好ましく、さらには０．１以下、特には０．０５以下が好ましい。また、全還元剤中チオール基を含む還元剤は２０モル％以下、さらには１０モル％以下、特には５モル％以下であることが好ましい。しかしながら、チオール基を含む還元剤は含まれないことが好ましい。 組成物中に含まれるチオール末端核酸は固体表面に固定化され、固定化された核酸と測定対象物質との相互作用を測定されるのが好ましい。固定化される際に、組成物は特別な精製は必要ではなく、そのまま、または水、水系の緩衝液、有機溶媒、またはこれらの混合物で希釈されて固定化に使用されるのが好ましい。固体表面としては金属表面が好ましく、金表面が特に好ましい。金表面はアルカンチオールを用い金−硫黄結合によって表面の改質が非常に容易であるだけではなく、数々のラベルフリーな相互作用検出方法が適応できるからである。 相互作用の検出方法としては蛋白質の相互作用にも適応可能である、ラベルフリーな方法が好ましく、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、局在化プラズモン共鳴、エリプソメトリ、和周波発生、偏波二波共鳴法、水晶発振子が挙げられる。中でもＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法はアレイフォーマットでの相互作用解析が可能であり、特に好ましい。 固体表面に固定化される方法は特に限定されるものではなく、固体表面に導入されたマレイミド基やエポキシ基などのチオール反応性官能基と核酸末端のチオール基を反応させて共有結合で固定化する方法、金−硫黄結合により、金表面に直接導入する方法などが挙げられる。 固定化されたチオール末端核酸と相互作用が測定される、測定対象物質（アナライト）は特に限定されるものではなく、核酸、蛋白質、ペプチド、低分子化合物などが挙げられる。 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。［実施例］ ４０塩基のオリゴＤＮＡを受託合成した（キアゲン社）。オリゴＤＮＡのデザインは５’側にスペーサーとして１５塩基のチミンを導入し、５’末端にチオール基を導入した。また、チオール基には保護基をつけない状態で入手した。このオリゴＤＮＡをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に１ｍＭの濃度で溶解し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（東京化成製）を１ｍＭの濃度で添加した組成物を用意した。また、比較としてホスフィン化合物を加えない組成物も用意した。さらに比較として、１ｍＭジチオスレイトールで還元し、ゲル濾過処理と濃縮処理を行ったサンプルも用意した。アレイを作製したオリゴＤＮＡの種類はＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ及びＸ，Ｙ，Ｚの７種類であるが、比較に用いたのは以下のＡ，Ｂの二種類のＤＮＡである。 Ａ：ＨＳ−（Ｔ）15−ＣＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＴＴＡＣＴＣ Ｂ：ＨＳ−（Ｔ）15−ＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＡＣＴＣＧＧＣＡＴＴＡＣＴＣ 上記二つの組成物を１週間おきに解凍し、１時間放置後に再冷凍を繰り返し、６ヵ月後に基板への固定化を試みた。固定化する前に、還元処理を行うものと、行わないものを用意した。 Ａ，Ｂ：処理なし Ａｐ，Ｂｐ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を1ｍＭの濃度で添加 Ａｔ，Ｂｔ：1ｍＭジチオスレイトールで還元処理し、ゲル濾過及び濃縮処理 これらのオリゴＤＮＡの相補的ＤＮＡ（２５塩基）を用意し、アニールさせて二本鎖ＤＮＡとする操作を行った。×５ＳＳＣ溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に５’チオール末端ＤＮＡが２５μＭ、その相補的ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、沸騰浴中にて５分、０℃に急冷し１５分、その後３７℃で三時間インキュベートし、ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。 ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ ＮＨ2チップ（東洋紡績製）に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（Ｎｅｋｔａｒ社製）をリン酸緩衝液に溶解した溶液３００μｌを反応させ、チップ表面にマレイミド基を導入した。このチップにＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター（東洋紡績製）を用いてアニールさせた組成物をチップ上にスポットし、１５時間反応させてｄｓＤＮＡを表面に固定化した。 このチップをＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ ＳＰＲ装置（東洋紡績製）にセットし、リン酸緩衝液を通液した。 この場合のＳＰＲイメージング像を図１に示す。その下にはスポットの配列表を示す。ＤＮＡが固定化されている部分は白く映り、固定化が不十分なスポットは暗く映る傾向となる。この測定はＤＮＡが固定化されているスポットがＳＰＲ現象を起こす共鳴角よりも約１度小さい角度で測定を行っている。ＤＮＡが固定化されている部分は周囲と比べて厚みがあり、ＳＰＲ角は周囲よりも大きい状態にあるために、反射光強度が高いためである。 このアレイの配置図を図２に示す。ここでのＡ，Ｂ，Ａｐ，Ｂｐ，Ａｔ，ＢｔのＳＰＲイメージング像における明るさの評価を行った。図１のスポットの明るさを評価するため、図１をコンピュータソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ製）に取り込み、Ａｎａｌｙｚｅ − Ｐｌｏｔ Ｐｒｏｆｉｌｅコマンドによりスポットの明るさを数値解析した。還元処理していないチオール末端ＤＮＡであるＡとＢの評価結果を図３に示す。横軸は画面上のピクセル数、縦軸は色の明るさを示す。Ａｐ、Ｂｐに関する同様の評価結果を図４に、Ａｔ、Ｂｔの結果を図５に示す。スポット部分のシグナルを周囲（バックグラウンド）の明るさとの差で求めた。 それぞれのスポット部分のシグナル（バックグラウンドとの差）をまとめたものを表１に示す。この結果から、処理なしＤＮＡのスポットのシグナル量は１２．０であり、ホスフィン処理、ＤＴＴ処理と比べてシグナルが低い傾向である。チオールが酸化されてジスルフィドとなったために、マレイミド基と反応することができず、固定化されたＤＮＡの量は少なかったと考えられる。 このようにホスフィン処理はＤＴＴ処理と同等の固定化効率を示し、酸化されたチオールを還元することが可能であったと結論づけられる。しかも、ＤＴＴ処理のようにゲル濾過は必要ではなく、操作は非常に容易である。 本発明により、チオール末端核酸を酸化されることなく保存することができ、表面への固定化反応に対する阻害がないため、高い効率で固相化することができ、固定化した核酸と測定対象物質の相互作用を観察することが非常に容易となる。ＤＮＡアレイのＳＰＲイメージング像図１におけるＤＮＡアレイの配置図処理なしチオール末端ＤＮＡを固定化したスポットの明るさ評価ホスフィン処理チオール末端ＤＮＡを固定化したスポットの明るさ評価ＤＴＴ処理（ゲル濾過あり）チオール末端ＤＮＡを固定化したスポットの明るさ評価表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて２種以上の核酸と測定対象物質の相互作用を測定するために金表面に固定化するチオール末端核酸を保存する方法であって、該チオール末端核酸の組成物の溶液中に、還元剤としてホスフィン系物質を含むことを特徴とする保存方法。ホスフィン系物質がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の保存方法。冷凍にて保存することを特徴とする請求項１又は２に記載の保存方法。