生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_コレステロールエステル量の測定方法 |
| 出願番号： | 2003315723 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12Q1/26,C12Q1/28,C12Q1/44,G01N21/77,G01N21/78,G01N33/92 |
特許情報キャッシュ
溝口 俊美 枝野 敏行 古志 朋之 JP 2005080559 公開特許公報(A) 20050331 2003315723 20030908 コレステロールエステル量の測定方法 興和株式会社 000163006 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 浅野 康隆 100089048 的場 ひろみ 100101317 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 溝口 俊美 枝野 敏行 古志 朋之 7C12Q1/26C12Q1/28C12Q1/44G01N21/77G01N21/78G01N33/92 JPC12Q1/26C12Q1/28C12Q1/44G01N21/77 ZG01N21/78 CG01N21/78 ZG01N33/92 A 6 ＯＬ 11 2G045 2G054 4B063 2G045AA13 2G045BB01 2G045BB51 2G045CA26 2G045DA69 2G045FA11 2G045FB01 2G045FB11 2G045GC10 2G045GC15 2G054AA08 2G054AB03 2G054CE02 2G054EA03 2G054EA04 4B063QA01 4B063QQ08 4B063QQ76 4B063QR02 4B063QR03 4B063QR12 4B063QR66 4B063QS28 4B063QS36 4B063QX01 4B063QX02 本発明は、操作が簡便で測定精度が向上したコレステロールエステル量の直接測定法に関する。 コレステロールは、動物界に広く分布し脳神経組織、副腎、その他臓器に多量に含まれている。また細胞膜、オルガネラ膜、ミエリン鞘などの構成成分を成すとともに、胆汁、性腺ホルモン、副腎皮質ホルモン、ビタミンDなどの前駆体となる重要な脂質として知られている。通常生体内では遊離型とエステル型の２種類が存在し、これらを合わせて総コレステロール（ＴＣ）と言う。 遊離型コレステロール（ＦＣ）は主に細胞膜の構成成分や胆汁酸の原料として重要な役割をもっている。一方、コレステロールエステル（ＣＥ）は貯蔵型で不活性であり、内皮下マクロファージや平滑筋細胞によって蓄積され、泡沫細胞を形成すると考えられている。そのため、動脈硬化症等の基礎研究において、動物組織中あるいは培養細胞中のコレステロールエステル量を測定することは重要な意味を持つ。 現在、コレステロールエステル量の測定は一般に総コレステロール量と遊離型コレステロール量とをそれぞれ測定し、総コレステロール量から遊離型コレステロール量を引き算することによって間接的に求められている。 ここで総コレステロール量の測定は、総コレステロール中に存在するコレステロールエステルをコレステロールエステラーゼで遊離型コレステロールと脂肪酸に分解し、得られた遊離型コレステロールと元から存在する遊離型コレステロールとをコレステロールオキシダーゼによりΔ4−コレステノンに酸化し、その際に副生する過酸化水素を発色試薬（例えば４−アミノアンチピリン／３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）、あるいはＮ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン等）の存在下、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を作用させ、吸光度又は蛍光強度を測定することにより行われている。 また、総コレステロール中に存在する遊離型コレステロール量の測定は、遊離型コレステロールとコレステロールエステルを含む試料にコレステロールオキシダーゼを作用させて、遊離型コレステロールをΔ4−コレステノンとし、その際に副生する過酸化水素を発色試薬（例えば４−アミノアンチピリン／３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）、あるいはＮ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン等）の存在下、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を作用させ、吸光度又は蛍光強度を測定することにより行われている。 しかし、上記方法でコレステロールエステル量を算出する場合、測定を二回行う必要があることから作業が煩雑であり、またそれぞれの過程で測定誤差を伴うために精度について満足する結果が得られない場合がある。特に総コレステロール中に含まれる遊離型コレステロール量が多い場合、誤差の影響が大きく、信頼性という面で大きな問題を抱えていた。 そこで、一回の測定で総コレステロール中のコレステロールエステル量を直接測定可能な簡便で精度の高い測定方法の開発が望まれていた。 本発明の目的は、コレステロール及びコレステロールエステルを含有する生物試料中のコレステロールエステル量を簡便な方法で高精度に測定できる直接測定法に関する。 本発明者らはかかる事情に鑑み、鋭意検討の結果、コレステロール及びコレステロールエステルを含有する試料にコレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを作用させて遊離型コレステロール由来の過酸化水素を水に還元させ、次いでこれにコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させて試料中のコレステロールエステル由来の過酸化水素だけを発生させ、当該過酸化水素量を測定すれば、コレステロールエステルだけを高精度で直接的かつ簡便に測定できることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、コレステロール及びコレステロールエステルを含有する試料に、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを作用させる第一工程、及び第一工程後にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素量を測定する第二工程を有することを特徴とするコレステロールエステル量の測定方法を提供するものである。 また、本発明は、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ及びコレステロールエステラーゼを含有するコレステロール及びコレステロールエステルを含有する試料中のコレステロールエステル量の測定試薬を提供するものである。 本発明によれば、コレステロールエステル量を１回の測定で求めることができ、従来法に比べ作業が簡便で測定誤差が小さいという利点を有する。 本発明の測定法は次の反応式で示すことができる。 本発明方法の第一工程は、コレステロール及びコレステロールエステルを含む試料における総コレステロール中の遊離型コレステロールをコレステロールオキシダーゼによりコレステノンと過酸化水素に分解し、発生した過酸化水素をカタラーゼで水に還元する工程である。この第一工程により、試料中の遊離型コレステロールはΔ4−コレステノンと水になり、第二工程に何ら影響を及ぼさない。 本発明方法に用いられる試料としては、コレステロール及びコレステロールエステルを含む試料であり、例えばヒト及び動物における血液、組織等が挙げられる。血液の場合には、血清又は血漿が好ましい。組織としては、肝臓、血管、副腎、腸管、骨格筋、脾臓、精巣、脳、培養細胞等が挙げられる。 コレステロールオキシダーゼとしては、シュードモナス属、ストレプトミセス属等の微生物由来のもの、遺伝子組換体が挙げられる。またカタラーゼとしては、ウシ肝臓、イヌ肝臓、ネズミ肝臓、ヒト赤血球、アスペルギルス属由来のもの等が挙げられる。 第一工程は、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを含む緩衝液を試料に添加し、２０〜４０℃で１〜６０分行えばよい。ここで、緩衝液としては、pH５〜８に調整できるものであればよく、例えばＭＥＳ（２−Ｎ−モルフォリノ−エタンスルフォン酸）緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。 本発明方法の第二工程は、試料中のコレステロールエステルをコレステロールエステラーゼで遊離型コレステロールと脂肪酸に分解し、続いてコレステロールオキシダーゼで過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素量を測定する工程である。第一工程により、遊離型コレステロールは、Δ4−コレステノンと水に分解されているので、第二工程で生じた過酸化水素はすべてコレステロールエステル由来であるから、生じた過酸化水素量を測定すれば、コレステロールエステル量が測定できることになる。 生じた過酸化水素量の測定は、常法に従って行えばよく、例えばＰｔ電極、Ａｇ電極及びＨ2Ｏ2透過性膜からなる過酸化水素電極を用いる方法；カタラーゼを共役させる方法；ペルオキシダーゼと発色試薬を用いる方法；ミクロペルオキシダーゼと化学発光物質のルミノール等を組み合せた化学発光による方法等で行うことができる。このうち、ペルオキシダーゼと発色試薬を用いる方法が、簡便性及び検出感度の点で特に好ましい。 発色試薬としては、ｏ−ジアニシジン系、４−アミノアンチピリン−アニリン誘導体系、４−アミノアンチピリン−フェノール誘導体系、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン−フェリン誘導体系等の比色系発色試薬；Ｎ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ホモバニリン酸等の蛍光試薬が挙げられる。ここで、アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム、Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等が挙げられる。フェノール誘導体としてはフェノール、ｐ−クロロフェノール等が挙げられる。また、ペルオキシダーゼとしては、西洋わさび由来、大豆由来、アルスロミセス属由来が挙げられる。これらの発色試薬を用いた場合には、生じる色素に対応する波長の吸光度又は蛍光強度を測定することにより過酸化水素量が測定できる。 第二工程で用いられるコレステロールエステラーゼとしては、シュードモナス属、ウシ膵臓、ブタ膵臓由来のものが挙げられる。コレステロールオキシダーゼとしては、前記と同じものが挙げられる。 第二工程は、例えば第一工程終了後の反応液に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び発色試薬を含有する緩衝液を添加し、２０〜４０℃、１〜６０分反応後に、吸光度又は蛍光強度を測定すればよい。ここで緩衝液は、第一工程と同様のものが使用できる。 得られた吸光度又は蛍光強度からコレステロールエステル量の定量は、予め作成した検量線から求めることができる。 本発明の測定法を行うには、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ及びコレステロールエステラーゼを含む試薬を用いることができる。さらに、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色試薬を含有する試薬とするのが好ましい。特には、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを含む第一試薬と、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色試薬を含む第二試薬とを含有するキットとするのが好ましい。 以下に具体的な実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例１．試薬の調製実施例１−１．ＣＥ標準溶液の調製 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０％含むイソプロピルアルコール１mL中にコレステロールオレイン酸エステルを遊離型コレステロールに換算して１mg含む溶液を調製し、ＣＥ標準溶液とした。実施例１−２．ＦＣ標準溶液の調製 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０％含むイソプロピルアルコール１mL中に遊離型コレステロール１mgを含む溶液を調製し、ＦＣ標準溶液とした。実施例１−３．ＦＣ分解液の調製 終濃度でコレステロールオキシダーゼ（起源：Pseudomonas sp.）１Ｕ／mL及びカタラーゼ（起源：ウシ肝臓）４５Ｕ／mLを含む５０mM ＭＥＳ（（２−Ｎ−モルフォリノ−エタンスルフォン酸），pH６．１）緩衝液を調製し、ＦＣ分解液とした。実施例１−４．比色法で使用するＣＥ測定試薬の調製 終濃度で４−アミノアンチピリン０．２mM、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）１mM、コレステロールオキシダーゼ０．５Ｕ／mL、コレステロールエステラーゼ（起源：Pseudomonas sp.）４Ｕ／mL及びペルオキシダーゼ（起源：西洋ワサビ）４Ｕ／mLを含む５０mM ＭＥＳ（pH６．１）緩衝液を調製し、比色ＣＥ測定試薬とした。実施例１−５．蛍光法で使用するCE測定試薬の調製 終濃度でＮ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン２０μｇ／mL、コレステロールオキシダーゼ０．５Ｕ／mL、コレステロールエステラーゼ４Ｕ／mL及びペルオキシダーゼ４Ｕ／mLを含む５０mM ＭＥＳ（pH６．１）緩衝液を調製し、蛍光ＣＥ測定試薬とした。実施例２．コレステロールエステルの測定実施例２−１．比色法によるコレステロールエステルの測定 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０％含むイソプロピルアルコールを用いＣＥ標準溶液を種々の濃度に希釈したＣＥ溶液２５μｌ又は試料溶液２５μｌにＦＣ分解液１５０μｌを加え、３７℃で１５分間反応した。この反応液に比色ＣＥ測定試薬７５μｌを加え、３７℃で１５分間反応後６００nmの波長で吸光度を測定した。なお、種々の濃度に希釈したＣＥ溶液を比色法によって測定した結果を比色法によるＣＥ測定の標準曲線として図５に示す。実施例２−２．蛍光法によるコレステロールエステルの測定 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０％含むイソプロピルアルコールを用いＣＥ標準溶液を種々の濃度に希釈したＣＥ溶液２５μｌ又は試料溶液２５μｌにＦＣ分解液１５０μｌを加え、３７℃で１５分間反応した。この反応液に蛍光ＣＥ測定試薬７５μｌを加え、３７℃で１５分間反応後励起波長５３０nm、蛍光波長５８０nmで測定した。なお、種々の濃度に希釈したＣＥ溶液を蛍光法で測定した結果を蛍光法によるＣＥ測定の標準曲線として図６に示す。実施例３．試薬の検討実施例３−１．コレステロールオキシダーゼ濃度の検討 ＦＣ標準溶液を２００μｇ／mLに希釈した溶液を用い、ＦＣ分解液中のコレステロールオキシダーゼ濃度について検討した結果を図１に示す。コレステロールオキシダーゼ濃度が０．５Ｕ／mL以上であれば２００μｇ／mLのＦＣは完全に分解された。この結果より、ＦＣ分解液のコレステロールオキシダーゼ濃度は、１Ｕ／mLに設定した。実施例３−２．カタラーゼ濃度の検討 ＦＣ標準溶液を２００μｇ／mLに希釈した溶液を用い、ＦＣ分解液中のカタラーゼ濃度について検討した結果を図２に示す。カタラーゼ濃度が７Ｕ／mL以上であれば２００μｇ／mLのＦＣから生成される過酸化水素は完全に分解された。次に、カタラーゼはコレステロールエステル由来の過酸化水素をも分解することから、それが与える発色率への影響について２００μｇ／mL ＣＥ溶液を用いて検討した結果を図３に示す。コントロールと比較し、カタラーゼを４５Ｕ／mLの濃度で含む系では約９５％、同４５０Ｕ／mLの濃度では約８０％の発色率であった。これらの結果より、ＦＣ分解液のカタラーゼ濃度は、４５Ｕ／mLに設定した。実施例３−３．遊離型コレステロール分解量の検討 遊離型コレステロールを種々の濃度で含有する２００μｇ／mL ＣＥ溶液をそれぞれ調製し、これらについて反応を行い、遊離型コレステロールの分解量を検討した。結果は図４に示す。これらの結果より、本測定方法ではＦＣ ８００μｇ／mLまでは完全に分解されることが判明した。実施例４．試料溶液の測定実施例４−１．ヒト血漿中コレステロールエステルの測定 健常人よりヘパリン採血した血漿を用い、従来法（遊離コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業（株））及びコレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業（株））を用いて測定）と本法によりコレステロールエステル量を測定した結果を表１に示す。従来法と本法によるコレステロールエステル量の測定値（平均値±標準偏差）は、それぞれ１１０±６．５mg／ｄｌ及び１１３±１．９mg／ｄｌであった。実施例４−２．ラット肝臓中コレステロールエステルの測定 ４週齢のSprauge−Dauley（ＳＤ）系雄性ラットをペントバルビタールナトリウムにより麻酔し肝臓を摘出した。肝臓１ｇ当たり２０mLのクロロホルム−メタノール（２：１）で抽出した溶液を濃縮乾固後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０％含むイソプロピルアルコールに溶解した試料液について従来法と本法によりコレステロールエステル量を測定した結果を表２に示す。従来法と本法によるコレステロールエステル量の測定値（平均値±標準偏差）は、それぞれ０．３５５±０．０８８mg／ｇ及び０．３９０±０．０２３mg／ｇであった。実施例４−３．THP-1細胞による泡沫化作用の測定 ＴＨＰ−１細胞（human monocytic leukemia cell line）を９６well培養プレートに藩種（１×１０5／well）し、ＦＢＳ（fetal bovine serum)を１０％、ＰＭＡ（phorbol １２−myristate １３−acetate）を２０ng／mL、penicillinを５０Ｕ／mL、streptomycinを５０μｇ／mLの濃度で含むＲＰＭＩ １６４０培地で７２時間培養した。培養終了後、細胞を上記培地２００μｌで１回洗浄し、続いて上記培地組成にＡｃ−ＬＤＬ（acetylated low density lipoprotein）を５０μｇ／mLの濃度となるように添加した新たな培地を用いてさらに４８時間培養して泡沫化した。培養終了後、培地を除去し、細胞を生理食塩水２００μｌで２回洗浄した。これにｎ−ヘキサン１００μｌを加え室温で１０分間放置し、細胞内のコレステロールエステルを抽出した。同様の方法により再度抽出した後、室温で２４時間放置して溶媒を除去した。残渣をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０％含むイソプロピルアルコール２５μｌ中に溶解させ、この試料溶液についてコレステロールエステル量を実施例２−２の方法で測定した。また、コレステロールエステルを抽出した細胞に１Ｎ ＮａＯＨ ２５μｌを加え、細胞内の蛋白質を抽出した後ＢＣＡ法により蛋白質量を測定した。細胞内のコレステロールエステルは、細胞内蛋白質１mg当たりの量に換算し、泡沫化の指標とした。ＴＨＰ−１細胞をＡｃ−ＬＤＬで泡沫化した結果を図７に示す。ＦＣ分解液中におけるコレステロールオキシダーゼ濃度を検討した結果を示す図である。ＦＣ分解液中におけるカタラーゼ濃度を検討した結果を示す図である。カタラーゼとペルオキシダーゼが共存する状態において、カタラーゼによる過酸化水素の分解が発色率に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。遊離型コレステロールの分解量を検討した結果を示す図である。ＣＥ標準溶液について比色法により測定した結果を示す図である。ＣＥ標準溶液について蛍光法により測定した結果を示す図である。ＴＨＰ−１細胞をＡｃ−ＬＤＬで泡沫化した結果を示す図である。 コレステロール及びコレステロールエステルを含有する試料に、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを作用させる第一工程、及び第一工程後にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素量を測定する第二工程を有することを特徴とするコレステロールエステル量の測定方法。 過酸化水素量の測定が、第二工程において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼに加えて、ペルオキシダーゼ及び発色試薬を作用させ、その吸光度又は蛍光強度を測定するものである請求項１記載のコレステロールエステルの測定方法。 発色試薬として４−アミノアンチピリン−アニリン誘導体系発色試薬又は４−アミノアンチピリン−フェノール誘導体系発色試薬を用いるものである請求項２記載のコレステロールエステル量の測定方法。 発色試薬としてＮ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンを用いるものである請求項２記載のコレステロールエステル量の測定方法。 コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ及びコレステロールエステラーゼを含有するコレステロール及びコレステロールエステルを含有する試料中のコレステロールエステル量の測定試薬。 さらに、ペルオキシダーゼ及び発色試薬を含有するものである請求項５記載の測定試薬。 【課題】 一回の測定で総コレステロール中のコレステロールエステル量を直接測定する方法の提供。【解決手段】 コレステロール及びコレステロールエステルを含有する試料に、コレステロールオキシダーゼ及びカタラーゼを作用させる第一工程、及び第一工程後にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素量を測定する第二工程を有することを特徴とするコレステロールエステル量の測定方法。【選択図】 なし