生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_マンノースの製造方法 |
| 出願番号： | 2003298881 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12N1/14,C12P19/02 |
特許情報キャッシュ
尾関 健二 峰時 俊貴 金政 真 山岡 加奈 炭谷 順一 川口 剛司 荒井 基夫 JP 2005065563 公開特許公報(A) 20050317 2003298881 20030822 マンノースの製造方法 大関株式会社 000204686 田中 光雄 100081422 松谷 道子 100106518 元山 忠行 100116311 冨田 憲史 100122301 志賀 美苗 100127638 尾関 健二 峰時 俊貴 金政 真 山岡 加奈 炭谷 順一 川口 剛司 荒井 基夫 7C12N1/14C12P19/02 JPC12N1/14 AC12P19/02 2 ＯＬ 8 特許法第３０条第１項適用申請有り 4B064 4B065 4B064AF02 4B064CA05 4B064CB07 4B064CC24 4B064CD19 4B064DA10 4B065AA60X 4B065AB01 4B065AC14 4B065BA01 4B065BB18 4B065CA20 4B065CA41 4B065CA44 本発明は、遺伝子組換えにより得られた新規β−マンノシダーゼ高生産アスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus）株、ならびにそのβ−マンノシダーゼを用いるマンノースの製造方法に関する。 マンノースは単糖の中では高価であり、グルコマンナンを酸加水分解、酵素分解することにより製造されている。また、モリブデン酸塩を触媒としてグルコースから製造する方法も知られている。さらに、フルクトースを原料にしてマンノースイソメラーゼを作用させ、マンノース含有液を取得した後、精製することによりマンノースを製造する方法も報告されている（特許文献１〜３等参照）。これらのうち、マンノースイソメラーゼを用いる方法は、安価なフルクトースを原料とすることで優れた製造方法ではあるが、反応の平衡が原料のフルクトース側に偏っているため、マンノースの収量が低いという欠点がある。一方、工業的な製造方法について検討したものではないが、マンノースの原料としてコプラミールが利用できるという報告がある（非特許文献１等参照）。この報告では、コプラミールを脱脂、弱酸処理した後、苛性ソーダ処理によりマンナンを抽出し、さらに洗浄、溶媒沈殿をおこなうことによりコプラマンナンを調製し、これにアスペルギルス・ニガー由来の分泌型のマンナナーゼを作用させることにより、マンノースが調製できるとされている。マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンまたはマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンを含有する天然物を原料として、加水分解反応によりマンノースを製造するために、アスペルギルス・ニガーのエンド型マンナナーゼ、エキソ型マンノシダーゼなどが入った市販セルラーゼ剤を用いて、コプラミールからマンノースを製造できると報告されている（特許文献４等参照）。また、遺伝子組換え法によるアスペルギルス・オリゼ株におけるβ−マンノシダーゼの生産も報告されている（非特許文献２等参照）が、使用菌株が生産するβ−マンノシダーゼ量が十分とはいえず、マンノース収率の点においてさらなる改良が必要であった。特開平4-218370号公報特開平6-292578号公報特開平8-9986号公報特開2001-231592号公報座間ら；熱帯農業29巻、4号、221-225、1985年S. Kanamasa et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 92, No. 2, 131-137, 2001 上記事情に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）やアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のプロモーターを用いるβ−マンノシダーゼ発現系で形質転換したアスペルギルス・アクレアータス株が生産するβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させると、特異的にマンノースが非常に高い収率で得られることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち本発明は、 （１）アスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus）（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６）、および （２）上の（１）に記載のアスペルギルス・アクレアータス株由来のβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させることを特徴とするマンノースの製造方法を提供するものである。 本発明によれば、β−マンノシダーゼを著量生産するアスペルギルス・アクレアータス株が提供され、そのβ−マンノシダーゼを用いてマンノース多糖体から高収率でマンノースを得ることができる。 アスペルギルス・アクレアータスが高いセルラーゼ分泌生産能を有することが知られており、その酵素的性質が研究されてきたが、発現制御機能等の遺伝子レベルでの解析は進んでいない。また、アスペルギルス・アクレアータスが優れた異種蛋白質生産宿主としても期待されているが、その形質転換系は確立されていない。 本発明者らは、今回、薬剤耐性およびウリジン要求性をマーカーとして、以下のようにアルペルギルス・アクレアータスの安定な形質転換法を確立した。 土壌から単離されたアスペルギルス・アクレアータスNo.F-50株（G. Takada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(1), 206-209, 1999）に対し常法に従って紫外線照射を行ない、次いで、５−フルオロオロチン酸およびウリジンを添加した最少培地にて培養を行なってスクリーニングを行ない、アスペルギルス・アクレアータスNo.F-50株のウリジン要求性変異株を得る。このうち、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするpyrG遺伝子を含むプラスミドを用いた形質転換によりウリジン資化能が回復するものをpyrG遺伝子破壊株として選択する。この形質転換は常法に従ってプロトプラスト−PEG法により行ない、pyrG遺伝子破壊株の選択は最少培地を用いて容易に行い得る。 得られたアスペルギルス・アクレアータスPyrG遺伝子破壊変異株を、β−マンノシダーゼ遺伝子manB（G. Takada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(1), 206-309, 1999）およびpyrGマーカーを含むプラスミド（特許第３３４３５６９号、第３３７２０８７号公報）にて形質転換して、β−マンノシダーゼを菌体外に著量分泌する株をスクリーニングする。形質転換は常法に従ってプロトプラスト−PEG法により行なう。スクリーニングは、１次スクリーニングとしては、紫外線照射により蛍光を発する４−メチルウンベルフェリルβ−Ｄ−マンノピラノシドを培地表面に塗布し、紫外線照射して強い蛍光を発する株を選択する。さらに、１次スクリーニングにて選択した株を常法に従って培養し、培養液中の菌体外β−マンノシダーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−マンノピラノシドを基質として比色法にて測定するこにより２次スクリーニングを行なってβ−マンノシダーゼ活性を確認し、最終的にβ−マンノシダーゼ高生産菌株を選択する。これらの実験手順の詳細は実施例にて説明する。 このようにして得られたβ−マンノシダーゼ高生産菌株は、平成１５年８月５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６の下に寄託してある。 上記のごとく得られたβ−マンノシダーゼ高生産菌株のβ−マンノシダーゼを実際にマンノース多糖体に作用させてマンノースを得る方法について述べる。 かかるβ−マンノシダーゼとしては上記菌株の培養液を使用することができ、また、常法により酵素を精製・単離してもよい。培養は液体培地でも、固体培地でも行なうことができる。培地組成、培養温度、培養時間、ｐＨ、撹拌あるいは通気等の条件は当業者が適宜選択して培養を行なうことができる。液体培地としては、例えば、スターチ、グルコース、麦芽エキス、酵母エキス等の天然成分を配合した培地、デキストリン・ペプトン培地、あるいは合成培地などを用いることができる。液体培養の場合は菌体を除去してから培養液を酵素として使用するのが一般的である。固体培地としては、小麦フスマ培地、蒸し米などを用いることができる。固体培養の場合には、菌体が十分に生育してから水あるいは適当な緩衝液にて抽出し、その抽出液を酵素として使用することができる。得られた培養液あるいは抽出液をそのまま用いてもよいが、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知の手法により精製したものを酵素として用いてもよい。 また、培養で得られた菌体を磨砕等に付して、菌体内に生産されるβ−マンノシダーゼを抽出して使用してもよい。 さらに、菌体の培養時にマンノース多糖体を適量添加してβ−マンノシダーゼ酵素を誘導してさらに著量の酵素を得てもよい。 β−マンノシダーゼ基質としてのマンノース多糖体は、マンノースを含有する多糖類を含むものであればいずれのものであってもよく、天然基質、合成基質、半合成基質いずれであってもよい。なかでも価格が安く大量に得られる点から天然基質が好ましい。かかる天然基質としては、木材、こんにゃく、あるいはコプラミール等のマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンを多く含有するものが適当であり、これらを適宜、部分分解や脱リグニン等の公知の前処理に付してから酵素反応に供するのが好ましい。 次に、適当に前処理されたマンノース多糖体に本発明の菌株由来のβ−マンノシダーゼ酵素を作用させることによりマンノースを得る。酵素反応は本発明の菌株のβ−マンノシダーゼの至適ｐＨ、至適温度にて行なうのが好ましく、例えばｐＨ４〜６、反応温度２５℃〜４５℃であってもよく、好ましくはｐＨ４．５ないし５．５、反応温度約３０℃ないし４０℃、さらに好ましくはｐＨ約４．５ないし５．５、反応温度３３℃ないし３８℃である。反応時間は基質量、酵素量等の要因により左右されるが、あまり短いと反応が不十分であり収率が低下し、あまり長いと酵素の失活が問題となる。また、基質と酵素の均質な分散を図るために反応液を撹拌あるいは振盪してもよい。当業者はマンノースを効率よく製造するために、これらの反応条件を適宜選択することができる。 得られた反応液を精製して純度の高いマンノースを得てもよい。例えば、得られた反応液を静置または濾過して上清を得て、エチルエーテル等の有機溶媒で脱脂し、イオン交換クロマトグラフィー（アニオン交換樹脂、例えばダウエックスＳＡＲ（ＯＨ−型）；カチオン交換樹脂、例えばダウエックスＨＣＷ２（Ｈ＋型）などを用いる）、エタノール沈殿等の手法により、反応液中のマンノースを精製してもよい。これらの精製手法の選択は当業者が容易に成すところである。 以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明する。 アスペルギルス・アクレアータスNo.F-50が一面に生えているプレート1枚あたり、10mlの0.9％NaCl、0.01％Tween80を加えて抽出した胞子懸濁液を撹拌しながら１分間紫外線(253.7nm)照射を行い、0.12％の5−フルオロオロチン酸および20mMウリジンを含むツァペック・ドックス培地で30℃、4日間培養してスクリーニングを行い、アスペルギルス・アクレアータスのウリジン要求性変異株を取得した。この変異株を宿主としてアスペルギルス・ニドランス由来のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするpyrG 遺伝子を含むプラスミド、40μg DNAを200ml 培養から得たプロトプラストに混合した（プロトプラスト調製は0.3％ Yatalase（タカラバイオ社製）および0.2% Lysing enzymes（Sigma社製）を30℃で2時間反応させた）。形質転換はプロトプラスト−PEG法により導入し、pyrG遺伝子欠損を相補されたアスペルギルス・アクレアータス形質転換系をはじめて完成するに至った。形質転換効率は染色体への組込型ベクターで0.5cfu（colony forming unit）／μgDNA、AMA1（autonomously replicating plasmid）プラスミド型ベクターで100cfu／μgDNAであった。従って、アスペルギルス・アクレアータス宿主において、アスペルギルス・ニドランスのpyrG遺伝子、AMA1配列を有するプラスミド型遺伝子がそれぞれ機能することをはじめて確認することが可能となった。 アスペルギルス・アクレアータスNo.F-50株からβ−マンノシダーゼ遺伝子（manB）を取得した（Biosci. Biotechnol. Biochem.,63(1),206-209,1999）。アスペルギルス・ニガー由来のNo.8プロモーター（特許3372087号公報）に、アスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系酵素遺伝子に共通するエンハンサー配列（regionIII）を12個導入（特許3343569号公報）し、プロモーター活性を強化した、No.8142プロモーターの下流にmanB遺伝子を挿入し、上記pyrG遺伝子マーカーを持つpPL-Bmnベクター（9.6kb）を構築した。このpPL-Bmnベクターをプロトプラスト−PEG法により、アスペルギルス・アクレアータスPyrG変異株に導入し、菌体外に分泌するβ−マンノシダーゼ高生産形質転換株を一次スクリーニングした。スクリーニング系は形質転換株の生産するβ−マンノシダーゼを、マンノビオースの基質アナログであり、分解されると紫外線照射により蛍光を発する4−メチルウンベルフェリルβ−D−マンノピラノシドを含むプレート（プレート1枚あたり20μlの1％の4−メチルウンベルフェリルβ−D−マンノピラノシドを培地表面に塗布した）を用い、紫外線照射下で蛍光を強く発する株を数株スクリーニングした。β−マンノシダーゼ活性は、p−ニトロフェニルβ−D−マンノピラノシドを基質として100ｍM酢酸緩衝液（pH5.0）で、酵素液と37℃で5分間反応させ、1M炭酸ナトリウムにより反応を停止後、420nmの吸光度を測定した。β−マンノシダーゼ1unitは1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離する酵素量と定義した。一次スクリーニングで選択した数株を、炭素源が2％グルコース、窒素源が1％ポリペプトンと0.3％酒石酸アンモニウムを含むツァペック・ドックス培地（pH6.5）で、30℃、6日間培養後の菌体外に分泌するβ−マンノシダーゼ活性を測定した。このうち最高のβ−マンノシダーゼ活性を示した株を平成１５年８月５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６を与えられた。このβ−マンノシダーゼ高生産株は実に2.6g/Lの生産量と著量のβ−マンノシダーゼ高生産株を取得するに至った。この培養条件で菌体外に分泌する培地中のβ−マンノシダーゼとmanB遺伝子を挿入していない空のベクター（PLベクター）の形質転換株をコントロールとして同条件下で培養したときの培地それぞれ10μlのSDS-PAGEを図１に示す。図１よりコントロールではこの条件ではタンパク質のバンドが認められないのに対して、β−マンノシダーゼ高生産株の培養液のタンパク質は分子量130kDaのβ−マンノシダーゼが純度が高く、著量分泌生産していることが分かった。この生産量はアスペルギルス・オリゼを宿主としたときのβ−マンノシダーゼ高生産株が同様な培養条件で0.27g/Lであった（J. Biosci. Bioeng.,92(2),131-137,2001）のに対して、実に9倍の生産量であった。今回取得したアスペルギルス・アクレアータス宿主でのβ−マンノシダーゼ高生産株のコピー数は、1コピー株であることが分かった。従って、この高生産株の培地組成の検討や培養方法などの最適化により、あるいは数コピー株の形質転換株を取得できれば、更なる生産性向上が期待できると推察される。１．基質（脱リグニンヤシ）の調製（亜塩素酸法） マンノース多糖体である脱脂ヤシ残渣を細かく切って砕き、ソックスレー抽出器を用いてベンゼン−エタノール混液（2 : 1）で24時間抽出し、続いてエタノールで24時間同様に抽出したのち室温で風乾した。この乾燥物10 gに対して水500 ml加えよく撹拌し、水浴で75℃に保った。これに氷酢酸（0.6 ml）と亜塩素酸ナトリウム（7.5 g）をこの順序に加えて撹拌を続けた。1時間毎に両試薬を初回と同量加えることを繰り返し3時間処理すると混液のpHは4.2〜4.7になった。すばやく25℃にまで冷却し、布で濾過し酸がなくなるまで水洗した。次にエタノールで洗い風乾した。２．基質の酵素分解反応 脱リグニンヤシを1%になるよう50 mM酢酸緩衝液（pH 5.0）に懸濁したものを基質とした。基質懸濁液10 mlに酵素液0.1 mlを加え、37℃でゆっくりと振盪し反応させ、一定時間毎にサンプリングし還元糖量および分解産物の経時変化をそれぞれSomogyi-Nelson法とTLC（展開溶媒組成：n-BuOH:EtOH:水=5:5:3）で分析した。３．結果 図２に示すように、アスペルギルス・アクレアータスのβ−マンノシダーゼ高生産株の培養6日目の菌体外に分泌する粗酵素液は、37℃で4日間反応させることにより、分解率がほぼ100％となった。一方、親株単独の同じ条件下での分解率は、40％程度であった。また、両粗酵素液による分解産物はTLCで分析すると全てマンノースのみからなっていた。 従って、遺伝子組換えにより育種したアスペルギルス・アクレアータスのβ−マンノシダーゼ高生産株は、共存するマンナナーゼ活性とβ−マンノシダーゼ高活性により、マンノース多糖体から効率よくマンノースを製造できることが分かった。 本発明の菌株およびマンノースの製造方法はマンノースの工業的生産にも利用できる。培地中の蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターンを示す図である。図中、ＰＬ（control）のレーンはｍａｎＢ遺伝子を挿入していない空のベクター（ＰＬベクター）での形質転換株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６）の培地を示し、ＢＭＮ（manB）のレーンはｐＰＬ−Ｂｍｎベクターでの形質転換株の培地を示す。脱リグニンヤシを基質とした場合の、マンノース高生産株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６）と親株との基質分解の経時変化を示す図である。黒丸はマンノース高生産株による基質分解を示し、白丸は親株による基質分解を示す。 アスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus）（ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６）。 請求項１記載のアスペルギルス・アクレアータス株由来のβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させることを特徴とするマンノースの製造方法。 【課題】β−マンノシダーゼ高生産菌株を得て、マンノースを高収率で製造する。【解決手段】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４６６として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているアスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus）β−マンノシダーゼ高生産株、ならびに前記菌株由来のβ−マンノシダーゼをマンノース多糖体に作用させることを特徴とするマンノースの製造方法。【選択図】なし