生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_ＲＮＡ抽出方法 |
| 出願番号： | 2002340942 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
鈴木 雄二 河津 哲 小山 博之 JP 4131562 特許公報(B2) 20080606 2002340942 20021125 ＲＮＡ抽出方法 国立大学法人岐阜大学 304019399 王子製紙株式会社 000122298 金谷 宥 100102369 中本 宏 100078503 井上 昭 100087022 鈴木 雄二 河津 哲 小山 博之 20080813 C12N 15/09 20060101AFI20080724BHJP JPC12N15/00 A C12N 15/00 CAplus(STN) PubMed Methods:A Companion to Methods in Enzymology，１９９８年，Vol.15，p.75-83 6 2004173524 20040624 8 20050615 （出願人による申告）平成１４年度植物利用エネルギー合理化工業原料生産技術の研究開発 長井 啓子 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、生物組織からのＲＮＡ（リボ核酸）の抽出方法に関し、特に、ＲＮＡを高い収率で得ることができる方法に関する。近年、遺伝子工学の進展に伴い、これを応用した形質転換植物の作出が盛んに行われている。遺伝子操作を行うためには、目的とする植物種からのＲＮＡ抽出が不可欠である。従って、本発明によるＲＮＡ抽出方法は、遺伝子工学的技術分野において有用である。【０００２】【従来の技術】今日までに、植物組織からの核酸抽出に適用可能な実験手法が多く提唱されている。代表的なものとしては、▲１▼ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）を含む抽出溶液を用い、フェノール抽出操作及び塩化リチウム処理によりそれぞれタンパク質と糖質を除去するＳＤＳ・塩化リチウム法（非特許文献１参照）、▲２▼臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（以下ＣＴＡＢと略す）を含む抽出溶液を用い、糖質、タンパク質画分をクロロホルム抽出することによって除くＣＴＡＢ法（非特許文献２参照）、▲３▼グアニジウムチオシアネートを含む抽出溶液を用いて試料を破砕した後、塩化セシウムを用いる超遠心分離によりＲＮＡを沈殿させる方法（非特許文献３参照）、▲４▼酸性グアニジンチオイソシアネート溶液、フェノール及びクロロホルムを用い、単一のステップでＲＮＡ画分をその他の画分から分離できるAcid guanidinium-Phenol-Chloroform法（以下ＡＧＰＣ法と略す：非特許文献４参照）などが挙げられる。【０００３】これらの方法の中で、▲４▼のＡＧＰＣ法は非常に簡便な方法であるが、材料とすることができる植物種が非常に限られている。一方、その他の方法においては、材料とすることができる植物種が比較的多いものの、長時間にわたる煩雑な操作が必要とされる。【０００４】このように、従来の方法には広い範囲の植物種から簡便にＲＮＡを抽出することができる方法は存在していなかった。その理由として、植物材料がポリフェノール等の二次代謝産物や多糖類を多く含む場合、これらをＲＮＡ画分から除くためには多くの操作が必要になる、ということが挙げられる。特に、ポリフェノールは核酸抽出時に核酸に結合し（非特許文献５参照）、その分解を引き起こし核酸の収量や質を著しく低下させる可能性が指摘されている（非特許文献６参照）。【０００５】このような状況において、広い範囲にわたる植物種から高品位のＲＮＡを簡便に抽出する方法の開発が望まれていた。さらに、植物に対する育種は地球環境の保全や食料増産の立場からみた場合においても今後益々重要になると考えられ、そのためには従来の交雑育種に加え、遺伝子工学的手法を用いる育種法の応用が不可欠であることは言うまでもない。【０００６】【非特許文献１】Shirzadegan et al., Nucleic Acids Res. 19:6055 (1991)【非特許文献２】Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2097-2100 (1987)【非特許文献３】Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294-5299 (1979)【非特許文献４】Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)【非特許文献５】John, Nucleic Acids Res. 20:2381 (1992)【非特許文献６】Kim et al., Nucleic Acids Res. 25:1085-1086 (1997)【０００７】【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に示した現状に鑑み、生物から高品位のＲＮＡを簡便に得るための抽出方法の提供を目的とする。特に、本発明は、植物からＲＮＡを抽出する際のＲＮＡの収率を向上させることができる方法を提供することを課題とする。【０００８】【課題を解決するための手段】上記課題を解決することができる本発明は、以下の各発明を包含する。（１）生物組織を緩衝液と混合してＲＮＡを溶出させる工程を含むＲＮＡ抽出方法において、該緩衝液がイソアスコルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とするＲＮＡの抽出方法。（２）前記ＲＮＡの抽出方法は、(a)生物組織からＲＮＡを含む成分を溶出させる工程、(b)溶出物から、タンパク、ＤＮＡ等を含む相とＲＮＡと多糖類を含む相とを分離する工程及び(c)ＲＮＡと多糖類を含む相からＲＮＡを分離する工程を含むことを特徴とする（１）記載のＲＮＡの抽出方法。【０００９】（３）前記ＲＮＡを溶出させる工程は、生物組織と緩衝液の混合物を磨砕する処理を含むことを特徴とする（１）又は（２）に記載のＲＮＡの抽出方法。【００１０】（４）前記緩衝液は、イソアスコルビン酸ナトリウムの他に、緩衝剤、有機溶媒及び界面活性剤を含有するものである（１）〜（３）のいずれか１項に記載のＲＮＡの抽出方法。【００１１】（５）イソアスコルビン酸ナトリウムは緩衝液中に５００〜７４０ｍＭの濃度範囲で含まれていることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１項に記載のＲＮＡの抽出方法。【００１２】（６）生物は植物であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＲＮＡの抽出方法。【００１３】【発明の実施の形態】本発明の生物からＲＮＡを抽出する方法は、特に生物組織が二次代謝物や多糖類を含み、抽出に困難性を伴う場合のＲＮＡの抽出方法として有効である。具体的には、植物、菌を主な対象とするものであるが、以下、植物を例として本発明を説明する。【００１４】植物としては、特に限定されるものではないが、例えばユーカリ、アカシア、パラゴムノキ、コーヒー、キンモクセイ、チャ等の常緑広葉樹、ポプラ、コナラ、クヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹、ミカン、レモン、サクラ、モモ、リンゴ、ナシ、アボガド、キウイフルーツ、カキ、クルミ、ブドウ、イチヂク、アーモンド、マンゴウ等の果樹類、バラ、ツバキ、ウメ等の花木類等、マツ類、スギ類、ヒノキ類等の針葉樹、イネ、コムギ、ソバ、ダイズ、ニガウリ等の草本性の作物などを挙げることができる。さらに、実際に用いるこれら植物の組織としては、茎頂部、あるいは胚軸、葉、樹幹、根等が挙げられる。【００１５】次に、本発明のＲＮＡの抽出方法を具体的に説明する。本発明で言う「ＲＮＡ抽出方法」とは、(a)植物組織からＲＮＡ（リボ核酸）を含む成分を溶出させる工程、(b)溶出物から、タンパク、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等を含む相とＲＮＡと多糖類を含む相とを分離する工程、(c)ＲＮＡと多糖類を含む相からＲＮＡを分離する工程、を含む全行程を意味する。【００１６】上記の溶出させる(a)工程は、緩衝液により行なわれる。緩衝液とは、水に緩衝剤、界面活性剤を含有する液であり、本発明では、その中にイソアスコルビン酸ナトリウムを含有することが特徴である。緩衝剤は有機酸の塩であり、例えば、生化学研究に有用なグッド緩衝液があり、より好ましくはトリス−塩酸緩衝液が例示される。イソアスコルビン酸ナトリウムは、緩衝液中で１００ｍＭ以上であり、２５０ｍＭ以上であることが好ましく、より好ましくは５００〜７４０ｍＭである。１００ｍＭ未満では効果がはっきりせず、約８００ｍＭは、常温におけるイソアスコルビン酸の水に対する飽和濃度であり、これを越えて配合しても効果は向上しない。【００１７】前記の溶出工程は、例えば粉砕した植物組織を緩衝液中で攪拌することで行なわれ得る。しかし、より良く溶出させるためには、磨砕することが好ましい。磨砕は、植物組織と緩衝液を混合し、すり鉢、乳鉢などで行なうか、媒体攪拌ミルなどを使用して行なう。【００１８】緩衝液中には、必要により、Ｍｇ++イオンやＭｎ++イオンを必要とするＲＮＡ分解酵素から保護する目的で、キレート剤を含有しても良い。キレート剤としては、例えばＥＤＴＡ（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, tetrasodium salt, tetrahydrate）、ＥＧＴＡ〔O,O'-Bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraacetic acid〕、クエン酸ナトリウム、サリチル酸（及びその塩）などが例示される。また、緩衝液中には、様々なタンパク質を変性させる目的で、有機溶媒を含有しても良く、有機溶媒としては、例えばクロロホルム、フェノール、クロロホルム・フェノール混合液などが挙げられる。【００１９】次に、溶出された液からＲＮＡと多糖類を含む相とタンパク質やＤＮＡを含む相を分離すること〔(b)工程〕が必要である。そのためには、クロロホルム、フェノール、クロロホルム・フェノール混合液などを使用する公知の方法（前記した▲１▼〜▲４▼などに記載されている方法）が適用できる。【００２０】最後に、(c)工程、即ちＲＮＡと多糖類を含む水相からＲＮＡを分離する方法としては、前記水相に対して遠心分離を行ないＲＮＡのみを沈殿する方法が挙げられる。このような分離方法には、塩化リチウムの使用（前記した▲１▼に記載されている方法）やイソプロピルアルコール、クエン酸三ナトリウム、及び塩化ナトリウムの混合物の使用〔Chomczynski and Mackey Biotechniques 19:942-945 (1995)参照〕などが挙げられるが、これらに限定されない。【００２１】【実施例】＜実施例１＞抽出方法については、特に詳しく説明しない箇所は、Molecular Cloning （Sambrook, et.al. Molecular cloning : a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記載されている方法に従った。供試試料はEucalyptus camaldulensis（播種後２ヶ月）の葉組織を採取し、抽出操作直前まで超低温冷凍庫（−８０℃）において保存した。【００２２】(1)０．５ｇの凍結試料を液体窒素下で乳鉢及び乳棒を用い破砕した後、２．５ｍｌのＲＮＡ抽出溶液〔５００ｍＭイソアスコルビン酸ナトリウム、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８)、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｈ８．０）〕を加え、ヘアドライヤーで凍結した溶液を融解させつつよく磨砕して磨砕液を調製した。【００２３】(2)０．５ｍｌの磨砕液を１．５ｍｌのポリプロピレンチューブに移し、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール溶液を添加し充分に混合した。混合後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、室温）により上清を回収した。【００２４】(3)上清に５０％容の６６．７％（ｗ／ｖ）グアニジンチオイソシアネート溶液、１５％容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）、及び等量の水飽和フェノール溶液を加え、撹拌し均一な溶液とし、室温にて３分間放置した。【００２５】(4)その後、加えたフェノールの２０％容のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて撹拌し、氷上で１５分間放置した後に遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により上清を回収した。サンプルが懸濁されている酸性グアニジンチオイソシアネート及びフェノールの混合物に対してこの操作を行うことで、ＲＮＡ画分からタンパク質及びＤＮＡを除くことができた〔Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)参照〕。【００２６】(5)上清に１／３容の１．２Ｍ 塩化ナトリウム及び０．８Ｍ クエン酸三ナトリウム混合溶液、２／３容のイソプロピルアルコールを加え室温で１０分間放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行った。このような塩の混合溶液とイソプロピルアルコールを用いることで、サンプル中のＲＮＡを多糖類が混入することなく沈殿させることができた〔Chomczynski and Mackey Biotechniques 19:942-945 (1995)参照〕。【００２７】(6)沈殿を７５％エタノール溶液で２回洗浄した後に滅菌水に溶解させ、全ＲＮＡ画分とした。ＲＮＡ収量は１２６０ μｇ／ｇ新鮮重であった。ＲＮＡ収率その他の測定結果を表１にまとめて示す。【００２８】＜実施例２〜４、比較例１＞ＲＮＡ抽出溶液に添加したイソアスコルビン酸ナトリウムの濃度を表中に示すように変えてＲＮＡ抽出溶液を調製し、実施例１と同様にユーカリ組織を材料としＲＮＡを抽出した結果を表１に示した。【００２９】【表１】【００３０】なお、表１における数値の意味は以下の注釈に示す。＊１ 実施例１における収量の絶対値は１２６０μｇ／ｇ新鮮重であり、他の実施例・比較例では、これを１００とした時の相対値を記載する。＊２ ２６０ｎｍにおける吸光度と２８０ｎｍにおける吸光度の比。ＲＮＡ画分へのタンパク質の混入度合の指標となる。混入が少ない場合、この値は１．８−２．０程度となり、混入が増加するほど値は低くなる。＊３ ２６０ｎｍにおける吸光度と２３０ｎｍにおける吸光度の比。ＲＮＡ画分への多糖類の混入度合の指標となる。混入が少ない場合、この値は２．０−２．４程度となり、混入が増加するほど値は低くなる。【００３１】イソアスコルビン酸ナトリウムを添加しない区（比較例１）においてはＲＮＡの収量が著しく低かった。イソアスコルビン酸ナトリウムを１００ｍＭ添加した区（実施例２）においてはＲＮＡの収量は比較例より少し向上している。２５０ｍＭ添加した区（実施例３）においてはかなり改善が認められ、５００ｍＭ添加した区（実施例１）においては、すべての実験区の中で収量が最大となり、７４０ｍＭ（飽和濃度）添加した区（実施例４）においては５００ｍＭ添加した区とほぼ同様の結果が得られた。【００３２】イソアスコルビン酸ナトリウムを加えない区及び１００から２５０ｍＭ添加した区においてはＲＮＡ画分にタンパク質や多糖類の混入が認められたが、５００ｍＭ及び７４０ｍＭ添加した区においては混入はほとんど認められなかった。このことから、イソアスコルビン酸ナトリウムを添加することはＲＮＡ画分の純度を向上させる作用を持つということも同時に明らかになった。なお、７４０ｍＭ添加時には、収量及び質ともに５００ｍＭ添加時と差異が認められないことから、常温においては、５００ｍＭ前後の添加量が最も有効であると言える。また、５００ｍＭ添加した区のＲＮＡ画分には電気泳動的に分解がほとんど認められず、逆転写反応に利用可能であることも確認された。【００３３】＜比較例２＞ＲＮＡ抽出溶液のうち５００ｍＭイソアスコルビン酸ナトリウムの代わりに５００ｍＭアスコルビン酸を加えたものを用い、実施例１と同様にユーカリ組織を材料としＲＮＡを抽出したところ、収量が１／５に低下し、同時にタンパク質及び多糖の著しい混入が生じた。したがって、本研究における効果はイソアスコルビン酸ナトリウムに特に起因するものであることが明らかとなった。【００３４】＜実施例５〜１０＞以下に挙げる木本性植物及び草本性植物の葉から、実施例１と同様の方法でＲＮＡを抽出した。ただし、葉の磨砕直後に行うクロロホルム抽出は２回行った。ウメ（実施例５）、キンモクセイ（実施例６）、チャ（実施例７）、ダイズ（実施例８）、ソバ（実施例９）、イネ（実施例１０）。ウメ、キンモクセイ、チャの場合は成木の成熟した葉を用い、ダイズ、イネ、ソバの場合は開花後の個体の成熟した葉を用いた。結果は表２に示した。【００３５】【表２】＊４ 吸光度比１及び２は表１に準じる。【００３６】上記の材料とした植物種から量、質ともに充分なＲＮＡを抽出することができた。このＲＮＡ画分には電気泳動的に分解がほとんど認められず、逆転写反応に利用可能であることも確認された。したがって、本発明は木本性植物、草本性植物を問わずに広い範囲にわたる種に適用可能であることが明らかになった。本発明を用いることで、多くの植物種における遺伝子工学的育種の進展がより容易になることが強く期待される。【００３７】【発明の効果】本発明により、イソアスコルビン酸ナトリウムの新規の効果として、植物より簡便に高品位のＲＮＡを高効率で抽出することを可能にするという効果が明らかとなった。 生物組織を緩衝液と混合してＲＮＡ（リボ核酸）を溶出させる工程を含むＲＮＡ抽出方法において、該緩衝液がイソアスコルビン酸ナトリウムを１００〜８００ｍＭの濃度範囲で含有することを特徴とするＲＮＡの抽出方法。 前記ＲＮＡの抽出方法は、（ａ）生物組織からＲＮＡを含む成分を溶出させる工程、（ｂ）溶出物から、タンパク、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等を含む相とＲＮＡと多糖類を含む相とを分離する工程及び(ｃ)ＲＮＡと多糖類を含む相からＲＮＡを分離する工程を含むことを特徴とする請求項１記載のＲＮＡの抽出方法。 前記ＲＮＡを溶出させる工程は、生物組織と緩衝液の混合物を磨砕する処理を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のＲＮＡの抽出方法。 前記緩衝液は、イソアスコルビン酸ナトリウムの他に、緩衝剤、有機溶媒及び界面活性剤を含有するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡの抽出方法。 イソアスコルビン酸ナトリウムは緩衝液中に５００〜７４０ｍＭの濃度範囲で含まれていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡの抽出方法。 生物は植物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡの抽出方法。