生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_黄色ブドウ球菌の迅速検出法 |
| 出願番号： | 2002289534 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | C12Q 1/14 |
特許情報キャッシュ
外山 一吉 福渡 康夫 矢野 陽一郎 清瀧 兼司 中川 稔 狩野 健一郎 佐々木 一枝 JP 3895658 特許公報(B2) 20061222 2002289534 20021002 黄色ブドウ球菌の迅速検出法 森永乳業株式会社 000006127 遠山 勉 100089244 松倉 秀実 100090516 川口 嘉之 100100549 外山 一吉 福渡 康夫 矢野 陽一郎 清瀧 兼司 中川 稔 狩野 健一郎 佐々木 一枝 JP 2001306247 20011002 20070322 C12Q 1/14 20060101AFI20070301BHJP JPC12Q1/14 C12Q 1/00-1/70 C12N 1/00-1/38 PubMed JSTPlus(JDream2) JMEDPlus(JDream2) JST7580(JDream2) BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) JICST-EPLUS/CA(STN) 特開２００１−１３６９９８（ＪＰ，Ａ） Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene Abteilung I Originale, Medizinische Hygienische Bakteriologie Virusforschung und Parasitologie, (1971) Vol.216, No.4, p.466-471 駒形和男 編，微生物の化学分類実験法，学会出版センター，１９８２年 ６月３０日，初版，ｐ．１８５ 長谷川武治 編，微生物の分類と同定，東京大学出版会，１９７５年 ６月２０日，初版，ｐ．２２０−２２１ 樫田良精 編，日本医師会 臨床検査指針による臨床検査法，南山堂，１９６６年１１月 １日，増訂第３版発行，ｐ．３４８−３５４ 3 2003174899 20030624 11 20030320 清水 晋治 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、食品衛生、医薬検査、研究などの各分野における、黄色ブドウ球菌［スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）］の検出に用いる培養検出法に関する。【０００２】更に詳しくは、本発明は、卵黄を含有する培地上に観察される上記微生物の卵黄反応の有無を迅速に検出する方法に関するものである。【０００３】尚、本発明における卵黄反応とは、卵黄を含有する平板培地において、卵黄反応陽性の微生物の集落の周囲に白濁環（培地によっては透明環）を形成する反応をいう。【０００４】【従来の技術】黄色ブドウ球菌による食中毒は、日本国において一定の頻度で発生する食中毒であり、食品衛生検査上重要な細菌とされている。食品衛生検査に使用される黄色ブドウ球菌用の卵黄を含む選択分離平板培地としては、卵黄加マンニット食塩寒天培地（非特許文献１を参照）、食塩卵寒天培地（日水製薬社製等）、ベアード・パーカー（Baird-Parker）寒天培地（非特許文献２を参照、又はメルク社製等）、エッグヨーク食塩寒天培地（栄研化学社製等）等が知られている。従来、食品衛生検査において、黄色ブドウ球菌の検出は、これらの培地に、検体を接種し、３５〜３７℃、２４〜４８時間培養後、卵黄反応陽性の黄色ブドウ球菌と疑わしい集落を計測することにより行われている（非特許文献３を参照）。【０００５】また、非特許文献４には、食肉製品の黄色ブドウ球菌試験法として、「試料液０．１ｍｌそれぞれについて卵黄加マンニット食塩寒天培地２枚に接種し、３５．０℃±１．０℃の温度で４８±３時間培養し、集落の周囲に真珠色かやや乳黄色の白濁環を伴った黄色ブドウ球菌の定型的集落のすべてを数え菌数を算定する」と具体的に規定されている。【０００６】尚、黄色ブドウ球菌の増殖が認められる温度域は５〜４７．８℃であり、至適温度は３０〜３７℃である（非特許文献５を参照）。しかしながら、これらの従来技術には、次に記載するとおりの課題があった。【０００７】【非特許文献１】日本薬学会編、「乳製品試験法・注解」、金原出版株式会社、第113ページ、昭和59年3月20日等【非特許文献２】坂崎他著、「新 細菌培地学講座・下II」、第２版、近代出版、第62ページ、1990年【非特許文献３】厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、第１６２ページ、１９９０年１２月２５日【非特許文献４】「食品衛生法施行規則及び食品，添加物等の規格基準の一部改正について」に関する厚生省生活衛生局長から各都道府県知事他宛ての通知（平成５年３月１７日衛乳第５４号）の別紙１第３試験法、１微生物（４）黄色ブドウ球菌試験法の項【非特許文献５】坂井千三編、厚生省生活衛生局食品保健課監修、「食中毒菌の制御」、中央法規出版株式会社、第１４ページ、昭和63年6月10日【０００８】【発明が解決しようとする課題】即ち、検体培養後の黄色ブドウ球菌の迅速な検出は各分野にまたがって重要なこととなっていた。そのためには現状の培養検出法に必要な時間では十分早いとは言えず、一層早急な検出法が求められていた。また、従来、明瞭な卵黄反応を生じさせ、卵黄反応陽性と判定するためには、多くの時間が必要であり、早期に正確な黄色ブドウ球菌の検出を行うためには、一層明瞭な卵黄反応を短時間で生じさせる検出法が必要であった。【０００９】本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を短時間で生じさせる黄色ブドウ球菌の迅速検出法を提供することを課題とする。【００１０】【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を短時間で生じさせる黄色ブドウ球菌の迅速検出法を開発すべく、鋭意研究を行った。【００１１】その結果、卵黄を含有する培地に検体を接種し、培養し、培地上に微生物の集落を発現させる第１段階と、卵黄反応を促進する温度で恒温保持し、卵黄反応を促進する第２段階からなる検出法が、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を短時間で生じさせることにより、黄色ブドウ球菌を迅速に検出できる検出法であることを見い出し、本発明を完成した。【００１２】本発明の目的は、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を短時間で生じさせる黄色ブドウ球菌の迅速検出法を提供することである。【００１３】前記課題を解決する本発明は、卵黄を含有する培地に検体を接種し、培養し、培地上に微生物の集落を発現させる第１段階と、卵黄反応を促進する温度で恒温保持し、卵黄反応を促進する第２段階からなる黄色ブドウ球菌の迅速検出法であり、卵黄反応を促進する温度が、培養温度よりも少なくとも５℃高い温度であることを望ましい態様としており、また、卵黄反応を促進する温度が、４０℃〜７５℃であることを望ましい態様ともしており、さらに、第２段階において、５５℃〜７５℃で少なくとも１時間恒温保持し、卵黄反応を促進すること（以下、態様１と記載する。）、及び第２段階において、５５℃〜６５℃で少なくとも２時間恒温保持し、卵黄反応を促進すること（以下、態様２と記載する。）を望ましい態様としてもいる。【００１４】【発明の実施の形態】次に、本発明について詳細に説明する。本発明の黄色ブドウ球菌の迅速検出法は、卵黄を含有する培地に検体を接種し、培養し、培地上に微生物の集落を発現させる第１段階と、卵黄反応を促進する温度で恒温保持し、卵黄反応を促進する第２段階からなることを特徴としている。【００１５】本発明に使用される卵黄を含有する培地は、卵黄を含有し、卵黄反応を示す黄色ブドウ球菌が生育できる培地であれば如何なる種類の培地であってもよいが、前記のとおり、従来技術として知られる卵黄加マンニット食塩寒天培地、食塩卵寒天培地、ベアード・パーカー寒天培地、エッグヨーク食塩寒天培地等が例示でき、簡便にはこれらの市販品を用いることができる。【００１６】尚、通常、卵黄は６５℃以上の温度で熱変性し凝固するため、前記培地の調製時、卵黄の熱による変性を防止するために、卵黄を除いた配合成分からなる基礎培地を滅菌した後に、添加される。また、滅菌後の培地に添加するために、その卵黄液は変性を防止しつつ無菌的に処理されたものを用いる。詳しくは、新鮮な鶏卵を消毒用アルコール綿にてその外殻を洗浄し、滅菌処理したピンセットなどで割卵し、卵黄部を無菌的に取出し無菌卵黄液とする。または採取した卵黄液を無菌フィルターなどにより、除菌操作を行ない、無菌卵黄液とする。または卵黄含有液を電子線などで照射し、無菌卵黄液を調製する。【００１７】検体中の微生物の培養及び恒温保持に使用される装置としては、温度を一定に維持できる装置であれば如何なる種類の装置であってもよいが、恒温槽、恒温培養器、インキュベーター等の装置を例示することができる。【００１８】本発明の第１段階の検体の培養温度は、検体中の微生物、特に黄色ブドウ球菌の集落が適正な大きさまで迅速に発育するために、好適な温度帯であれば限定されないが、通常３５〜３７℃である。また、培養時間は、培地の種類、培養温度等により異なり、黄色ブドウ球菌の集落が肉眼で確認できる大きさにまで生育し得る時間であれば限定されないが、通常１８〜２４時間程度である。【００１９】本発明の第２段階の卵黄反応を促進するための恒温保持の温度は、卵黄反応を促進するために、好適な温度帯であり、卵黄反応を迅速に確認でき得る条件であれば限定されないが、具体的には、後記する試験例の結果からも明らかなとおり、通常４０〜７５℃、好ましくは５５〜７５℃、より好ましくは５５〜６５℃である。なお、恒温保持の温度が３７℃以下の場合は、卵黄反応が十分に促進されず、卵黄反応が迅速に確認できないため、好ましくない。恒温保持の温度が８０℃以上の場合は、卵黄反応が見づらくなる、培地寒天が軟化し、集落が流れる等、観察に支障をきたし、好ましくない。【００２０】また、恒温保持の時間は、培地の種類、培養温度等により異なり、卵黄反応が肉眼で確認できるまでの時間であれば限定されないが、例えば、卵黄加マンニット食塩寒天培地の場合、４０℃では１０時間程度、５５℃〜７５℃では１時間程度であり、食塩卵寒天培地の場合、４０℃では２時間程度、５５℃〜７５℃では１時間程度である。【００２１】また、本発明の態様１に示すとおり、５５℃〜７５℃で少なくとも１時間恒温保持し、卵黄反応を促進することが、後記する試験例の結果からも明らかなとおり、短時間で明瞭な卵黄反応を観察できることから好ましい。【００２２】更に、驚くべきことには、後記する試験例の結果からも明らかなとおり、黄色ブドウ球菌が生育しない５５℃〜６５℃という温度で少なくとも２時間恒温保持し、卵黄反応を促進することにより、短時間で一層明瞭な卵黄反応が観察されるという良好な結果が得られた。【００２３】従って、本発明の態様２に示すとおり、黄色ブドウ球菌が生育しない５５℃〜６５℃という温度で少なくとも２時間恒温保持し、卵黄反応を促進することが、短時間で一層明瞭な卵黄反応を観察できることから好ましい。【００２４】次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。試験例１この試験は、黄色ブドウ球菌による卵黄反応の見易さを指標として、従来技術と本発明の方法を比較するとともに、恒温保持の適正な条件を調べるために行った。（１）試料の調製培地試料として、次の２種類の平板培地を調製し使用した。（ａ）本発明の実施例１に記載の市販の卵黄加マンニット食塩寒天培地（ｂ）本発明の実施例２に記載の市販の食塩卵寒天培地【００２５】（２）試験菌株試験用黄色ブドウ球菌として、微生物寄託機関であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲されたスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ ６５３８Ｐを使用した。【００２６】（３）試験方法各試料の黄色ブドウ球菌による卵黄反応の状態を、次の試験方法により試験した。（ａ）試験条件標準寒天培地の１平板に０．１ｍｌ塗抹し、３５℃で４８時間培養した場合に、前記試験菌株のほぼ５０個の集落が得られる試験菌株の希釈液を調製した。【００２７】各培地の１平板に、前記試験菌株の希釈液を０．１ｍｌ塗抹した後、３５℃で２０時間培養し、培地上にほぼ５０個（所定数）のしっかりとした集落を発現させた。尚、この時点で卵黄反応は認められない。【００２８】前記のとおり、３５℃で２０時間培養し、所定数の集落が観察された各５平板を、それぞれ、３５℃（継続培養。いわゆる従来技術）、３７℃、４０℃、５５℃、６５℃、７５℃、叉は８０℃の温度条件に設定された恒温槽中に静置し、０．５時間〜２８時間恒温保持して、卵黄反応の促進状態を観察した。【００２９】（ｂ）卵黄反応の評価方法各平板上に生じた集落の卵黄反応の見易さを次の指標に基づき評価した。１平板上の平均的なサイズの１０個の集落を肉眼観察し、集落の直径と集落の周囲に広がる卵黄反応（白濁環叉は透明環）の直径との差を計測し、これら差の平均値（５平板計５０個の集落から求まる平均値）を算出し、この平均値を、次の基準でレベル分けし、卵黄反応の見易さの指標とし、これを結果として表中に示した。集落直径と卵黄反応直径との差の平均値 レベル０ｍｍ ０１ｍｍ未満 １１ｍｍ以上２ｍｍ未満 ２２ｍｍ以上 ３【００３０】（４）試験結果この試験の結果は、表１及び表２に示すとおりである。表１は卵黄加マンニット食塩寒天培地、表２は食塩卵寒天培地における結果である。【００３１】表１から明らかなとおり、従来技術に相当する３５℃２４時間恒温保持（継続培養４４時間に相当）時の卵黄反応の状態は、レベル１であった。これに対して、３７℃で恒温保持した場合にも、卵黄反応がレベル１になるまでに２４時間を要し、卵黄反応を促進する効果は得られなかった。【００３２】一方、本発明に相当するところの、培地上に微生物の集落の発現後、培養温度よりも少なくとも５℃高い卵黄反応を促進する温度で恒温保持する、即ち、本試験において４０℃以上の恒温保持温度条件においては、レベル１以上の卵黄反応が観察されるまでの恒温保持時間は、４０℃で１０時間、５５〜７５℃で１時間であった。【００３３】即ち、従来技術に比較して、本発明の黄色ブドウ球菌の検出法は、卵黄反応の検出時間を、４０℃で１／２以下、５５〜７５℃で１／２４に短縮することが可能であった。【００３４】尚、恒温保持温度が８０℃の場合は、卵黄反応が見づらくなる、培地寒天が軟化し、集落が流れる等、観察に支障をきたし、不適当であった。【００３５】また、本発明の恒温保持温度を５５〜６５℃とした場合には、レベル２以上の一層明瞭な卵黄反応が４０℃での検出時間（２４時間）に比較して１／１２（２時間）という短時間で得られることが判明した。【００３６】次いで、表２から明らかなとおり、従来技術に相当する３５℃８時間恒温保持（継続培養２８時間に相当）時の卵黄反応の状態は、レベル１であった。これに対して、３７℃で恒温保持した場合にも、卵黄反応がレベル１になるまでに８時間を要し、卵黄反応を促進する効果は得られなかった。【００３７】一方、本発明に相当するところの、培地上に微生物の集落の発現後、培養温度よりも少なくとも５℃高い卵黄反応を促進する温度で恒温保持する、即ち、本試験において４０℃以上の恒温保持温度条件においては、レベル１以上の卵黄反応が観察されるまでの恒温保持時間は、４０℃で２時間、５５〜７５℃で１時間であった。【００３８】即ち、従来技術に比較して、本発明の黄色ブドウ球菌の検出法は、卵黄反応の検出時間を、４０℃で１／４、５５〜７５℃で１／８に短縮することが可能であった。【００３９】尚、恒温保持温度が８０℃の場合は、卵黄反応が見づらくなる、培地寒天が軟化し、集落が流れる等、観察に支障をきたし、不適当であった。【００４０】また、本発明の恒温保持温度を５５〜６５℃とした場合には、レベル２以上の一層明瞭な卵黄反応が４０℃での検出時間（８時間）に比較して１／４以下（１〜２時間）という短時間で得られることが判明した。【００４１】以上のとおり、本発明の検出法は、従来技術に比較して、卵黄反応の検出時間を大幅に短縮することが可能であり、卵黄反応を示す黄色ブドウ球菌を迅速に検出出来る方法として、有効であることが判明した。【００４２】尚、卵黄を含有する培地として、食塩卵寒天培地をベアード・パーカー寒天培地叉はエッグヨーク食塩寒天培地に変更して試験したが、卵黄反応の状態は、表２の結果とほぼ同様の結果が得られた。【００４３】また、黄色ブドウ球菌の供試菌株を適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。【００４４】【表１】【００４５】【表２】【００４６】次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４７】【実施例】実施例１卵黄を含有する平板培地として市販の黄色ブドウ球菌選択培地である卵黄加マンニット食塩（寒天）培地（日水製薬社製）を使用した。【００４８】検体として購入日より１週間経過した市販の鶏ひき肉を使用した。該鶏ひき肉をストマッカーにて細かく磨砕した後１０ｇ採取し、滅菌生理食塩水で１０倍に希釈した分散液０．１ｍｌを、前記平板培地に塗抹接種し、定温乾燥機（ヤマト科学社製）を用いて３７℃で２０時間培養し、培地上に微生物の集落を発現させた後、６０℃で３時間恒温保持し、卵黄反応を促進し、卵黄反応を肉眼観察し、その陽性陰性を判定した。尚、３７℃で２０時間培養後に発現した集落より細菌の同定用の試料を採取した。【００４９】その結果、集落周囲に、培地本来が持つ透明な色調とは明らかに異なり、また明らかに大きさ・色調とも集落とは異なる明瞭な薄白色の白濁環のある特徴的な卵黄反応を示した２０個の集落と、この反応を示さない３７個の集落が観察された。【００５０】卵黄反応が観察された集落に対応する前記細菌の同定用の試料について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、第１６３ページ、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行なった結果、卵黄反応を示した集落は、黄色ブドウ球菌であることが確認された。【００５１】また、卵黄反応を示さない集落に対応する前記細菌の同定用の試料についても、上記方法により黄色ブドウ球菌の同定を行なったが、全て同菌とは同定されなかった。【００５２】即ち、この検出法により、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を、集落形成後３時間という短時間で生じさせ、食品中の黄色ブドウ球菌を迅速、確実、かつ明確に検出できた。【００５３】実施例２卵黄を含有する平板培地として市販の黄色ブドウ球菌選択培地である食塩卵寒天培地（日水製薬社製）を使用した。【００５４】検体として調理後五日目の焼きそばを使用した。該焼きそばをストマッカーにて細かく磨砕した後１０ｇ採取し、滅菌生理食塩水で１０倍に希釈した分散液０．１ｍｌを、前記平板培地に塗抹接種し、定温乾燥機（ヤマト科学社製）を用いて３７℃で１８時間培養し、培地上に微生物の集落を発現させた後、６５℃で３時間恒温保持し、卵黄反応を促進し、卵黄反応を肉眼観察し、その陽性陰性を判定した。尚、３７℃で２０時間培養後に発現した集落より細菌の同定用の試料を採取した。【００５５】その結果、集落周囲に、培地本来が持つ透明な色調とは明らかに異なり、また明らかに大きさ・色調とも集落と異なる明瞭な薄白色の白濁環のある特徴的な卵黄反応を示した２個の集落と、この反応を示さない１５個の集落が観察された。【００５６】卵黄反応が観察された集落に対応する前記細菌の同定用の試料について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、第１６３ページ、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行なった結果、卵黄反応を示した集落は、黄色ブドウ球菌であることが確認された。【００５７】また、卵黄反応を示さない集落に対応する前記細菌の同定用の試料についても、上記方法により黄色ブドウ球菌の同定を行なったが、全て同菌とは同定されなかった。【００５８】即ち、この検出法により、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を、集落形成後３時間という短時間で生じさせ、食品中の黄色ブドウ球菌を迅速、確実、かつ明確に検出できた。【００５９】実施例３市販の黄色ブドウ球菌選択培地であるベアード・パーカー寒天培地（メルク社製）粉末５８ｇを使用説明書に従って、精製水９５０ｍｌに均一に分散又は溶解し、オートクレーブ（岩楯医療機器製作所社製）を使用して１２１℃で１５分間加熱し滅菌して４５〜５０℃に冷却後、亜テルル酸塩卵黄乳液（メルク社製）５０ｍｌを添加し、シャーレ（栄研化学社製）１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化し卵黄を含有する平板培地（ベアード・パーカー寒天培地）を調製した。【００６０】検体として、にぎり飯を３日間３０℃にて放置したものを使用した。該にぎり飯を滅菌生理食塩水で１０倍に希釈した分散液０．１ｍｌを、前記平板培地に塗抹接種し、恒温培養器（日立製作所社製）を用いて３５℃で２０時間培養し、培地上に微生物の集落を発現させた後、５５℃で２時間恒温保持し、卵黄反応を促進し、卵黄反応を肉眼観察し、その陽性陰性を判定した。【００６１】その結果、黒色集落の周囲に、培地本来が持つ白濁した色調とは明らかに異なり、また明らかに大きさ・色調とも集落とは異なる明瞭な透明環、更にはこの透明環の中に白濁環のある特徴的な卵黄反応を示した１０個の集落と、この反応を示さない６７個の集落が観察された。【００６２】卵黄反応が観察された集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、第１６３ページ、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行なった結果、卵黄反応を示した集落は、黄色ブドウ球菌であることが確認された。【００６３】また、卵黄反応を示さない集落についても、上記方法により黄色ブドウ球菌の同定を行なったが、全て同菌とは同定されなかった。【００６４】即ち、この検出法により、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を、集落形成後２時間という短時間で生じさせ、食品中の黄色ブドウ球菌を迅速、確実、かつ明確に検出できた。【００６５】実施例４基礎培地として次の組成の各原料を均一に分散又は溶解し、冷却固化した後の最終的な培地のｐＨが６．２になるように０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液若しくは０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を添加し調整した。【００６６】このｐＨを調整した基礎培地をオートクレーブ（岩楯医療機器製作所社製）を使用して１２１℃で１５分間加熱し滅菌して５０℃に冷却後、殻付き卵から無菌的に採取した卵黄液を１０ｇ添加し、シャーレ（栄研化学社製）１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化し卵黄を含有する平板培地を調製した。原材料 配合量カゼインペプトン（ディフコ社製） ５ｇ大豆ペプトン（日本製薬社製） ５ｇ酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製） ５ｇ塩化ナトリウム（和光純薬工業社製） ７０ｇマンニトール（和光純薬工業社製） １０ｇ塩化リチウム（和光純薬工業社製） ５ｇリン酸二水素一カリウム（和光純薬工業社製） ０．４ｇ寒天（伊那食品工業社製） １５ｇ精製水 １０００ｍｌ【００６７】検体として購入日より３日間経過した市販の鶏ひき肉を使用した。該鶏ひき肉をストマッカーにて細かく磨砕した後１０ｇ採取し、滅菌生理食塩水で１０倍に希釈した分散液０．１ｍｌを、前記平板培地に塗抹接種し、定温乾燥機（ヤマト科学社製）を用いて３５℃で２０時間培養し、培地上に微生物の集落を発現させた後、５５℃で１時間恒温保持し、卵黄反応を促進し、卵黄反応を肉眼観察し、その陽性陰性を判定した。【００６８】その結果、集落周囲に、培地本来が持つ透明な色調とは明らかに異なり、また明らかに大きさ・色調とも集落とは異なる明瞭な薄白色の白濁環のある特徴的な卵黄反応を示した１０個の集落と、この反応を示さない８個の集落が観察された。【００６９】卵黄反応が観察された集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、第１６３ページ、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行なった結果、卵黄反応を示した集落は、黄色ブドウ球菌であることが確認された。【００７０】また、卵黄反応を示さない集落についても、上記方法により黄色ブドウ球菌の同定を行なったが、全て同菌とは同定されなかった。【００７１】即ち、この検出法により、黄色ブドウ球菌による明瞭な卵黄反応を、集落形成後１時間という極めて短時間で生じさせ、食品中の黄色ブドウ球菌を迅速、確実、かつ明確に検出できた。【００７２】【発明の効果】以上詳記したとおり、本発明は、卵黄を含有する培地に検体を接種し、培養し、培地上に微生物の集落を発現させる第１段階と、卵黄反応を促進する温度で恒温保持し、卵黄反応を促進する第２段階からなる黄色ブドウ球菌の迅速検出法に関するものであり、本発明により奏せられる効果は次のとおりである。１）本発明の黄色ブドウ球菌の検出法は、黄色ブドウ球菌の特徴である卵黄反応を迅速、確実、かつ明確に検出できる点で、従来技術の方法に比較して優れている。２）本発明の黄色ブドウ球菌の検出法は、黄色ブドウ球菌の特徴である卵黄反応を迅速に検出するために、培養の後、所定の温度で恒温保持するのみの簡便な手法である点で優れている。３）本発明の黄色ブドウ球菌の検出法は、汎用性を有しており、卵黄を含有する各種の黄色ブドウ球菌用の選択培地において、黄色ブドウ球菌の特徴となる卵黄反応を従来技術の方法に比較して迅速に確認できる点で優れている。 卵黄を含有する培地に検体を接種し、培養し、培地上に微生物の集落を発現させる第１段階と、卵黄反応を促進する温度５５℃〜７５℃で少なくとも１時間恒温保持し、卵黄反応を促進する第２段階からなる黄色ブドウ球菌の迅速検出法。 第２段階において、５５℃〜６５℃で少なくとも２時間恒温保持し、集落直径と卵黄反応直径との差の平均値が１ｍｍ以上になるまで卵黄反応を促進する請求項１に記載の黄色ブドウ球菌の迅速検出法。 集落直径と卵黄反応直径との差の平均値が１ｍｍ以上２ｍｍ未満になるまで卵黄反応を促進する請求項１に記載の黄色ブドウ球菌の迅速検出法。