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| タイトル： | 公開特許公報(A)_組換えバチルスメガテリウム菌 |
| 出願番号： | 2002267120 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C12N15/09,C12N1/21,C12P21/02 |
特許情報キャッシュ
林 康弘 秋葉 俊一 袴田 佳宏 荒 勝俊 斎藤 英一 JP 2004097153 公開特許公報(A) 20040402 2002267120 20020912 組換えバチルスメガテリウム菌 花王株式会社 000000918 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 林 康弘 秋葉 俊一 袴田 佳宏 荒 勝俊 斎藤 英一 7 C12N15/09 C12N1/21 C12P21/02 C12N1/21 C12R1:11 C12P21/02 C12R1:11 JP C12N15/00 A C12N1/21 C12P21/02 C C12N1/21 C12R1:11 C12P21/02 C C12R1:11 3 ＯＬ 14 4B024 4B064 4B065 4B024AA01 4B024AA11 4B024BA19 4B024CA04 4B024DA05 4B024DA06 4B024EA04 4B024FA02 4B024FA18 4B024GA11 4B064AG21 4B064CA02 4B064CA19 4B064CC24 4B064DA01 4B065AA17X 4B065AA17Y 4B065AA26X 4B065AB01 4B065AC14 4B065AC15 4B065BA02 4B065CA24 4B065CA44 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバチルス メガテリウム菌及びこれを用いた目的タンパク質の製造法に関する。【０００２】【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】今日まで、組換えＤＮＡ技術による異種タンパク質の生産には、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）をはじめとして、酵母や糸状菌、培養動植物細胞、バチルス属細菌等の宿主ベクター系が用いられてきた。このうち、バチルス属細菌の一つである枯草菌は、産業用酵素の供給源のみならず食品産業でも利用されている菌であり、安全性が極めて高いことに加え、菌体外へのタンパク質の分泌が可能であり、菌体内若しくはペリプラズムで異種タンパク質を生産させる大腸菌の系と比較して異種タンパク質の精製操作が大幅に簡略化できるという利点があることから、大腸菌に次いで遺伝学的研究が行われ、形質転換効率の高い宿主ベクターが開発されている。【０００３】しかしながら、枯草菌においても、その宿主ベクター系は適当なプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域がない場合には、目的産物が細胞内に留まったままであったり、分泌生産された目的タンパク質が膜の上や菌体外でプロテアーゼにより分解されたり、シャペロンの不適合等の要因によって効率的な物質生産が行われない（非特許文献１参照）、といった問題がある。【０００４】一方、バチルス メガテリウム菌は、枯草菌と同様にバチルス属細菌の一つであり、プロテアーゼ分泌能が枯草菌等に比べて低いことが知られている。斯かるバチルス メガテリウム菌を宿主として異種タンパク質を生産した例はいくつか報告されているが（非特許文献２、非特許文献３参照）、いずれも外来遺伝子産物は菌体内に蓄積されており、菌体外へ分泌生産されたという報告はない。【０００５】他方、シスタチン類は、システインプロテアーゼ阻害剤の総称であり、ヒト組織および体液に広く分布し、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ及びＳのようなシステインプロテアーゼと密接かつ可逆的な複合体を形成し、これらのプロテアーゼが関与する正常又は病的な過程の調節に係わっている。従って、シスタチンは、後天的な肺炎（肺気腫）、劇症肝炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、細菌毒素に起因するショック様症候群、カテプシンＫの選択的阻害による疾患（骨粗しょう症、パジェット病、悪性高カルシウム血症、代謝性骨疾患等）に関与すると考えられている。【０００６】そして、斯かるシスタチン類の製造についても、そのアミノ酸構造をコードする遺伝子を用いた組換え生産が試みられており、シスタチンＣを始め、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンα及びシスタチンＳの組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による生産などが知られているが、その生産性は低く実用化されるレベルには至っていないのが実情である。【０００７】本発明は、目的タンパク質を効率的且つ大量に製造するための宿主ベクター系及びこれを用いたシスタチン類の製造法を提供することを目的とする。【０００８】【非特許文献１】Ｓｉｍｏｎｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｖａ，， Ｉ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５７：１０９，（１９９３）【非特許文献２】Ｙａｍａｇａｔａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８６：３５８９，（１９８９）【非特許文献３】Ｒｙｇｕｓ， Ｔ．， ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ， Ｗ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３５：５９４，（１９９１）【０００９】【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチルス属細菌の宿主ベクター系を用いたタンパク質の生産方法について種々検討したところ、バチルス メガテリウム菌を宿主とし、これをバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を含む発現ベクターで形質転換させた組換えバチルス メガテリウム菌を用いることにより、目的タンパク質が効率よく大量に分泌生産できることを見出した。【００１０】すなわち本発明は、バチルス メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換えバチルス メガテリウム菌を提供するものである。【００１１】また本発明は、目的タンパク質をコードする遺伝子としてシスタチン類をコードする遺伝子を組み込んだ上記組換えバチルス メガテリウム菌を培養し、当該培養物中からシスタチン類を分離するシスタチン類の製造法を提供するものである。【００１２】【発明の実施の形態】本発明の組換えバチルス メガテリウム菌は、バチルス メガテリウム菌を宿主とし、これをバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなるものである。以下、本発明の組換えバチルス メガテリウム菌について説明する。【００１３】本発明において用いられる宿主菌は、バチルス メガテリウム菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であればよいが、プロテアーゼの機能が消失又は低いか或いはプロテアーゼの菌体外分泌能が低く、分泌生産された目的タンパク質の細胞膜上や菌体外での分解が抑制されるものが好ましく、例えばバチルス メガテリウム菌 ＷＨ３２０株が挙げられる。ＷＨ３２０株は、Ｒｙｇｕｓらによって調製されたＤＳＭ３１９株の派生株であり、ＤＳＭ３１９株をＥＭＳにて変異処理し、ラクトース及びＸＧａｌを含む寒天培地上で白いコロニーを示す株として取得されたものである。本株にはβ−ガラクトシダーゼ活性が見られない（Ｒｙｇｕｓ．Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５５：５３５（１９９１）。【００１４】本発明の組換えバチルス メガテリウム菌を形質転換するためのベクターは、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と、目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を含むものであればよい。プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４８２）由来のＤＮＡ断片（配列番号１、特開平６−２１７７８１号公報）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０６７）由来のＤＮＡ断片（配列番号２、特開２０００−２１００８１号公報）が好適に挙げられ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ由来のＤＮＡ断片（配列番号２）が好ましい。【００１５】斯かるプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域のセルラーゼ遺伝子からの単離は公知の方法、例えば Ｍａｎｉａｔｉｓら［Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）］に記載の方法で行うことができる。また、公知のポリメラアーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法によって特異的に増幅することにより効率的に取得できる［Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．，Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）］。【００１６】目的タンパク質をコードする遺伝子は、上記プロモーター領域及び分泌シグナル領域の下流末端に結合すればよく、当該目的タンパク質としては、各種酵素タンパク質や生理活性ペプチド等、いずれの異種タンパク質でもよい。【００１７】斯かるバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼのプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持する発現ベクターは、バチルス メガテリウム菌に保持され増殖するプラスミドであればよく、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のｐＢＣ１６、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｐＡＭα１、ｐＡＭα１の一部を含むシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫなどが挙げられる。【００１８】斯かるベクターを用いて、宿主バチルス メガテリウム菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いればよい。【００１９】斯くして得られる組換えバチルス メガテリウム菌（形質転換体）を、当該組換えバチルス メガテリウム菌が生育可能な培地中で適当な培養条件で培養することにより、目的タンパク質を大量に生成させることができる。特に、本発明の組換えバチルス メガテリウム菌はシスタチン類の大量分泌生成に適するものであり、宿主バチルス メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と、シスタチン類をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換えバチルス メガテリウム菌を用い、これを適当な培地中で適当な培養条件で培養することによって、シスタチン類を大量に分泌生成させることができる。【００２０】ここで、シスタチン類としては、その起源や種類に限定されず、ファミリー１（ステフィンファミリー）、ファミリー２（シスタチンファミリー）及びファミリー３（キニノーゲンファミリー）に分類される全てのシスタチンスーパーファミリー並びに、システインプロテアーゼに対する阻害活性を有する特開平７−１２６２９４号公報に記載の新規システインプロテアーゼインヒビター、特表２００１−５１２９６６号公報に記載のＣＳＴＩＮのようなシスタチン様タンパク質が挙げられる。【００２１】斯かる、１）ファミリー１としては、ヒトシスタチンＡ、ヒトシスタチンＢ、ラットシスタチンα、ラットシスタチンβ、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ−ｐ２１、オリザシスタチンＩ、オリザシスタチンＩＩ、コーンシスタチン、ソヤシスタチン等が挙げられ、２）ファミリー２としては、ヒトシスタチンＣ、ヒトシスタチンＳ、ヒトシスタチンＳＮ、ヒトシスタチンＳＡ、ヒトシスタチンＤ、ヒトシスタチンＭ、ヒトロイコシスタチン（シスタチンＦ）、ラットシスタチンＣ、ラットシスタチンＳ、マウスシスタチンＣ、マウスロイコノシスタチン、チキンシスタチン、ウズラシスタチン、ウシ初乳シスタチン、カープシスタチン、タイワンコブラ毒シスタチン、カブトガニシスタチン、チャムサーモンシスタチン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａシスタチン、サーコシスタチン、マムシ毒シスタチン等が挙げられ、３）ファミリー３としては、ヒト低分子量キニノ−ゲン、ヒト高分子量キニノーゲン、ウシ低分子量キニノーゲン、ウシ高分子量キニノーゲン、ラット低分子量キニノーゲン、ラット高分子量キニノーゲン、ラットＴ−キニノーゲン１、ラットＴ−キニノーゲン２等が挙げられる。【００２２】このうち、本発明の組換えバチルス メガテリウム菌を用いた製造には、特にファミリー２に属すものが好ましく、特にヒトの唾液由来のシスタチンであるシスタチンＳ、シスタチンＳＡ、シスタチンＳＮが適する。尚、これらシスタチン類の遺伝子は、生体からの抽出や増幅、化学的合成等の公知の方法により取得すればよい。【００２３】組換えバチルス メガテリウム菌の培養に用いる培地の種類としては、適当な窒素源、炭素源、ミネラルを含み、本発明のバチルス メガテリウム菌宿主が生育し、目的タンパク質を生産することのできるものであればよい。例えば、配列番号２で示されるＤＮＡ断片を含む組換えバチルス メガテリウム菌ＷＨ３２０株によってシスタチン類を生産する場合、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖等の二糖類又は可溶性澱粉等の多糖類等を配合した培地や、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を配合したＣＭ培地等を用いることができる。【００２４】また、培地のｐＨは、用いる組換えバチルス メガテリウム菌が生育し得る範囲のｐＨであればよいが、ｐＨ６．０〜８．０に調整するのが好適である。培養条件は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪または、通気撹拌培養すればよい。【００２５】【実施例】試験方法（１）宿主菌株宿主として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＨ３２０株（ＭｏＢｉＴｅｃ社）、比較例としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株を用いた。【００２６】（２）プラスミドの調製遺伝子のサブクローニングに用いる大腸菌宿主としてＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（タカラバイオ株式会社製）を使用した。ヒト顎下腺由来のｃＤＮＡからクローニングしてきたシスタチンＳ遺伝子を含むプラスミドとしてｐＵＳＡ３（Ｓａｉｔｏｈ，Ｅ．， ａｎｄＩｓｅｍｕｒａ，Ｓ．， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，：３９９，（１９９４））を使用した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｓ２３７株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を含むプラスミドとしてｐＨＹＥｇｌＳ（Ｈａｋａｍａｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６４：２２８１，（２０００））を使用した。シスタチン遺伝子をサブクローニングするベクターとしてｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ株式会社製）を使用した（図１）。【００２７】（３）使用培地及び培養条件組換え菌の培養には、表１に示したＣＭ培地を使用し、以下の培養条件で行った。すなわち、大型試験管（シード培地、５ｍＬ仕込）にて１５時間培養した前培養液を、５００ｍＬヒダつき三角フラスコ（メイン培地、２０ｍＬ仕込）に４％植菌し、培養温度３０℃、回転数２１０ｒｐｍで３〜４日間培養を行った。【００２８】【表１】【００２９】（４）遺伝子工学的手法遺伝子断片の増幅にはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を用いた。ＰＣＲ法には、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュー・ダイアグノスティックス社）を用いて、鋳型ＤＮＡ５ｎｇ、表２に示す順方向プライマー及び逆方向プライマー各２０ｐｍｏｌとして、ＰＣＲ反応（変性温度：９４℃−１分、アニール温度：５４℃−０．５分、ＤＮＡ鎖伸張温度：７２℃−４分を１サイクルとして３０回繰り返す）をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン・エルマ社）を用いて行った。増幅された遺伝子断片の塩基配列をサンガー法（Ｆ．Ｓａｎｇａｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３（１９８２））により決定し、ＰＣＲ法による配列のエラーが起こっていないことを確認した。構築した組換えプラスミドのバチルス メガテリウム菌への導入には、プロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．， Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１，（１９７９））の変法（プロトプラストの形成：ＢＲＯＷＮ Ｊ．Ｂ． ＆ ＣＡＲＬＴＯＮ．Ｂ．Ｃ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４２：５０８（１９８０）、形質転換体の再生：Ｐｕｙｅｌ，Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．４０：１（１９８７））に従って行った。【００３０】【表２】【００３１】（５）組換え菌生産物の解析培養後の培養液を遠心分離し培養上清と菌体を得た。菌体を菌体破砕緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ 、５％グリセロール）で懸濁し、超音波破砕（ＢＩＯＭＩＣ社７５００型、Ｏｕｔｐｕｔ ５、Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ ５０％、１５分間破砕）後、遠心分離した上清を菌体破砕物とした。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はレディゲルＪ （分離ゲル濃度１５％、バイオラッド）を用い、泳動後のゲルをクイックＣＢＢ（関東化学）にてタンパク質染色した。抗体染色はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦフィルター（ミリポア、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体に後記参考例に記載の方法により作製した組換え大腸菌由来のシスタチンＳに対する抗シスタチンＳマウス抗体、二次抗体にＨＲＰ標識の抗マウスＩｇ抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム ファルマシア バイオテク社）によって、シスタチンＳの検出を行った。【００３２】参考例 抗シスタチンＳ抗体の作製（１）パパイン阻害活性の測定方法シスタチンＳのパパイン阻害活性はＢａｒｒｅｔら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０、ｐｐ７７１（１９８１））に準じて測定した。１０ｍＭベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド（Ｂｅｎｚｏｉｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）ジメチルスルホキシド溶液を基質とし、２ｍＭのＥＤＴＡを含む、２００ｍＭリン酸緩衝液にＤＴＴを終濃度８ｍＭとなるように添加した。パパイン１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＴＴを含まない緩衝液に溶解した。また、反応停止用溶液として５％トリクロロ酢酸溶液を使用した。測定は以下の手順で行った。測定用チューブに１ｍＬＤＴＴを含む緩衝液と０．０５ｍＬのパパイン溶液、試料溶液０．５ｍＬおよび全量２ｍＬとなるよう蒸留水を入れ、２５℃で５分間インキュベートした。ついで基質溶液０．０５ｍＬを加え攪拌した。２５℃で１５分反応後、１ｍＬの反応停止液を加え、沈殿が生じた場合は１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清の４０５ｎｍの吸光度を測定した。相対阻害活性は次式（１）より求めた。相対阻害活性（％）＝１００−（（Ａ０−ＡＩ）／Ａ０×１００） （１）Ａ０：阻害剤フリーの吸光度ＡＩ：サンプルの吸光度【００３３】（２）シスタチンＳの組換え大腸菌による製造ヒト唾液由来シスタチンＳは斎藤ら［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，３９９−４０５（１９９４）］の方法に従って製造した。即ち、ヒトシスタチンＳのｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を宿主として組換え操作を行い、組換え体を作成した。組換え大腸菌の培養はアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）添加ＬＢ培地５０ｍＬにて前培養を行った。本培養はＭ９最小培地にシュークロース（４ｇ／Ｌ）、チアミン（２ｍｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．１ｍＭ）とアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた培地１６Ｌを用い３０−Ｌ容ジャーファーメンターによって、前培養液１６ｍＬを添加後、培養温度３７℃、通気量４Ｌ／ｍｉｎ、攪拌数２５０ｒｐｍの条件で行った。培養４時間後（ＯＤ６００＝０．５）にイソプロピルチオガラクトシド（終濃度０．３ｍＭ）を添加してさらに４時間培養を行い、シスタチンＳを発現した。培養後、Ｆｒｅｉｊｅら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１５７３７−１５７４４（１９９３）］の方法によって菌体処理を行いペリプラズム画分を調製した。【００３４】（３）シスタチンＳの精製シスタチンＳの精製はＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃ（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）によるイオンクロマトグラフィーによって行った。ペリプラズム画分を１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）にて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）にロードする。１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）で溶出洗浄後、１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）（２５０ｍＬ）、４％ＮａＣｌ溶解１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）（２５０ｍＬ）で形成されるグラジエントで溶出する。組換えシスタチンＳを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。【００３５】パパイン阻害活性を有するフラクションを凍結乾燥後、再度６０ｍＬの蒸留水に溶解後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて２０ｍＬに脱塩濃縮を行った。さらに、４０ｍＬの蒸留水を添加して、同様に脱塩濃縮を２回行った。得られた脱塩濃縮液２０ｍＬのうち１０ｍＬをさらにＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３にて濃縮を行い１．５ｍＬとした。得られたシスタチンＳ濃縮液１．５ｍＬをさらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｆカラム（１．５ｃｍ×９４ｃｍ）によるゲル濾過を行った。組換えシスタチンＳを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。パパイン阻害活性を有するフラクションをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３にて濃縮を行い２ｍＬとした。得られた濃縮液をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）により牛血清アルブミンを標準として定量した結果、６７８μｇ／ｍＬであった。【００３６】（４）抗シスタチンＳマウス抗体の作製（３）によって得られた精製シスタチンＳを用いて常法に従って抗シスタチンＳマウス抗体を作製した。即ち雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに精製シスタチンＳ溶液６０μＬを１００μＬ ＦＣＡと混合して腹腔内注射により初回免疫を行った。さらに、１４、２８、４８日後に精製シスタチンＳ溶液６０μＬを１００μＬ ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョンと混合して腹腔内注射を行った。５２日後にマウス尾静脈より全血を採取し、抗血清を分離し抗シスタチンＳマウス抗体とした。【００３７】比較例１ 枯草菌１６８株による発現ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。すなわち、プラスミドｐＨＹＥｇｌＳ５ｎｇを鋳型としＳ２３７ＵＥ及びＣＳ２３７Ｄの２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域をコードする０．６Ｋｂの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドｐＵＳＡ３ ５ｎｇを鋳型とし２３７ＣＳＵ及びｐＳＤの２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりヒト・シスタチンＳをコードする０．４ｋｂの遺伝子断片を得た。この０．４Ｋｂ断片の塩基配列をサンガー法により決定し構造遺伝子中のＥｃｏＲ Ｉサイトをコドンに影響の無いように（ＡＡＴ→ＡＡＣ）消去したことを確認した。単離した０．６Ｋｂ断片、０．４Ｋｂ断片をそれぞれ５ｎｇを鋳型としてＳ２３７ＵＥ及びｐＳＤの２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト・シスタチンＳをコードする遺伝子が結合した１．０ｋｂ遺伝子断片を得た。得られた１．０Ｋｂ断片とプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩ処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。この結合反応物を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［Ｄ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ， Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，（１９８５）］に従って調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドｐＨ２３７−ＵＳを得た。プロトプラスト法にて枯草菌１６８株に組換えプラスミドｐＨ２３７−ＵＳを導入し、得られた枯草菌について培養（３０℃、３日間）を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて菌体破砕物中にヒト・シスタチンＳに相当する分子サイズ（１４Ｋｄ）のタンパク質バンドが検出できたが、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった（図２）。【００３８】実施例１ バチルス メガテリウム菌による発現組換えプラスミドｐＨ２３７−ＵＳをＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＨ３２０ 株に導入し、得られた組換え体について培養（３０℃、４日間）を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてシスタチンが大量に菌体外分泌されていることが確認され、タンパク質染色においても充分に生産が確認できる生産レベルであることが認められた（図３）。【００３９】【発明の効果】本発明の組換えバチルス メガテリウム菌を用いれば、目的タンパク質を効率よく且つ大量に生産することができる。【００４０】【配列表】【図面の簡単な説明】【図１】シスタチン組換えプラスミドの構築（Ｓ２３７プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。【図２】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物の解析結果を示す図である（比較例１）。【図３】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換えバチルス メガテリウム菌生産物の解析結果を示す図である（実施例１）。 バチルス メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換えバチルス メガテリウム菌。 バチルス属細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４８２）又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０６７）である請求項１記載の組換えバチルス メガテリウム菌。 目的タンパク質をコードする遺伝子としてシスタチン類をコードする遺伝子を組み込んだ請求項１又は２記載の組換えバチルス メガテリウム菌を培養し、当該培養物中からシスタチン類を分離するシスタチン類の製造法。 【課題】目的タンパク質を効率的且つ大量に製造するための宿主ベクター系及びこれを用いたシスタチン類の製造法を提供する。【解決手段】バチルス メガテリウム菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換えバチルス メガテリウム菌、及び当該組換えバチルス メガテリウム菌を培養し、当該培養物中からシスタチン類を分離するシスタチン類の製造法。【選択図】 なし