生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_急性肝炎および慢性肝線維化の治療剤 |
| 出願番号： | 2002226552 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,A61K38/00,A61P1/16,C07K14/47 |
特許情報キャッシュ
淀井 淳司 中村 肇 奥山 裕照 嶌原 康行 JP 2004067542 公開特許公報(A) 20040304 2002226552 20020802 急性肝炎および慢性肝線維化の治療剤 レドックス・バイオサイエンス株式会社 502208076 淀井 淳司 591253227 三枝 英二 100065215 掛樋 悠路 100076510 小原 健志 100086427 中川 博司 100090066 舘 泰光 100094101 斎藤 健治 100099988 藤井 淳 100105821 関 仁士 100099911 中野 睦子 100108084 淀井 淳司 中村 肇 奥山 裕照 嶌原 康行 7 A61K38/00 A61P1/16 C07K14/47 JP A61K37/02 A61P1/16 C07K14/47 3 ＯＬ 13 特許法第３０条第１項適用申請有り ２００２年８月２５日〜２９日 開催「１１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｉｎｕｓｏｉｄ＆Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｔｈｅｒ Ｃｅｌｌｓ」において文書をもって発表 4C084 4H045 4C084AA02 4C084BA44 4C084CA04 4C084CA17 4C084CA18 4C084MA01 4C084NA14 4C084ZA752 4H045AA30 4H045BA10 4H045CA40 4H045EA27 4H045HA05 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、急性肝炎および慢性肝線維化の治療剤に関する。【０００２】【従来の技術およびその課題】チオレドキシンはその活性部位配列の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−内にレドックス活性なジスルフィド／ジチオールを有する小さい１２ ｋＤａの多機能タンパク質である（ｒｅｆ． １）。 チオレドキシンはリボヌクレオチドリダクターゼに対するハイドロゲン供与体，デオキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌から単離されて以来，多くの原核生物，真核生物から単離同定されてきた。成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は，本発明者らがＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので，ヒトチオレドキシンである。細胞内チオレドキシンはラジカル消去や，ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１や ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ などのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（ｒｅｆ． ２）。 さらに， ヒトチオレドキシンはｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ） やａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ−１ （ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。ヒトチオレドキシンはＣＤＤＰ誘導性の細胞障害に抵抗性を示す。われわれは， ＴＲＸ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ （Ｔｇ） ｍｉｃｅ （ＴＲＸ Ｔｇ ｍｉｃｅ）が脳虚血，インフルエンザ肺炎や他の酸化ストレス疾患に有効であることを示してきた（ｒｅｆ． ３）。【０００３】酸化ストレスは肝疾患においても重大な原因となっている（ｒｅｆ． ４）。 肝炎ウイルス，アルコール，薬剤は肝において活性酸素種を産生し，肝細胞のアポトーシスを誘導し，急性肝炎，ひいては肝線維化を引き起こす。（ｒｅｆ． ５） 肝線維化の際には，肝細胞死のみではなく，肝星細胞の活性化を伴う。肝星細胞はラジカルによって活性化し，増殖，コラーゲン産生，遊走，収縮，などの多機能を発揮する（ｒｅｆ． ６） 。肝線維化には，この星細胞の関与が非常に大きい。細胞培養実験では，抗酸化剤によって肝星細胞の活性化が抑制され，また，動物実験でも，抗酸化剤によって肝線維化が抑制されることからも，星細胞活性化，肝線維化に酸化ストレスが関与していることが分かる。【０００４】本発明者らは，これまで，グルタチオン前駆体のＮ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅがチオアセトアミド誘発肝線維化を抑制することを報告してきた（ｒｅｆ． ７） 。ＡＤＦ はこれまで，胎児肝や肝癌において強発現し，肝線維化でも強発現することがわかっており，ＡＤＦ が肝疾患でなんらかの役割をはたしていることが予想される。【０００５】本発明は、チオレドキシンを有効成分とする肝疾患治療剤を提供することを目的とする。【０００６】【課題を解決するための手段】本発明は、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする急性肝炎治療剤に関する。【０００７】また、本発明は、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする慢性肝炎（特に、肝線維化）の治療剤に関する。【０００８】【発明の実施の形態】本明細書においては、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類には、チオレドキシン活性を有するものであれば、オリゴペプチドからポリペプチド（タンパク質）まで広く含まれる。【０００９】チオレドキシン活性を有するファミリーは、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ−（Ｘ及びＹは同一又は異なって２０種類の天然アミノ酸のいずれかを示す。）を有しており、チオレドキシンスーパーファミリー（以下、「ＴＲＸファミリー」という）と呼ばれている。【００１０】ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドとしては、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類を例示することができ、これらの中でも、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類が好ましい。【００１１】また、ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドには、具体的には、ヒトを含む動物のチオレドキシン（ヒトを含む動物のＡＤＦ）、大腸菌などの細菌のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン等のチオレドキシン；ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチド（ヒトＡＤＦＰ）；ヒト，大腸菌等のグルタレドキシン等が含まれる。【００１２】ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドとしては、チオレドキシンが好ましく、特にヒトチオレドキシン及び酵母チオレドキシンが好ましい。酵母チオレドキシンは、酵母から単離したものでもよいが、チオレドキシンを多く含む酵母の形態で使用することもできる。【００１３】これらＴＲＸファミリーに属するポリペプチド類は、本発明の急性肝炎及び慢性肝炎治療剤に、単独で、又は２種以上組み合わせて含有させることができる。【００１４】ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドは、細菌（大腸菌）、酵母、植物及び動物、特にヒトを含む哺乳動物（ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、モルモット、ラット、マウス、ウサギなど）由来のいずれであってもよい。また、ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドは、天然物を精製する方法、遺伝子組換え法により、酵母，大腸菌等から得られるものであってもよく、ＴＲＸ活性を有する限り、その１又は複数のアミノ酸を置換、付加、欠失等した誘導体であってもよい。【００１５】チオレドキシンを含む該ポリペプチド類は、酸化型であっても還元型であってもよいが、好ましくは還元型である。【００１６】治療される肝疾患としては、急性肝炎及び慢性肝炎が挙げられ、これらは、ウイルス性（急性、慢性）肝炎、薬物性（急性、慢性）肝炎が挙げられ、慢性肝炎としては、特に肝線維化が挙げられる。【００１７】投与経路としては、経口（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤など）及び非経口（注射剤、吸入剤、点鼻剤、坐剤など）のいずれでも投与することができる。【００１８】急性肝炎ないし慢性肝炎治療剤のＴＲＸファミリーに属するポリペプチドの有効量としては、成人１日あたり５０〜５００ ｍｇ程度であり、これを１日あたり１〜３回に分けて投与することができる。【００１９】【発明の効果】本発明によれば、副作用の心配がない急性肝炎及び慢性肝炎の治療剤を提供することができる。【００２０】【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。実施例１（１）方法材料．ヒト組み換えチオレドキシンは味の素より供給された。抗ヒトチオレドキシン抗体は Ｆｕｊｉ Ｒｅｂｉｏ により供給された。コラゲナーゼ，チオアセトアミドは和光薬品より購入した。 プロナーゼＥはメルク社より購入した。ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ −ａｃｔｉｎ （−ＳＭＡ） に対する抗体は ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ から購入した。 ［３Ｈ］チミジン ａｎｄ ［−３２Ｐ］ｄＣＴＰはアマシャムファルマシアから購入した。動物．チオレドキシントランスジェニックマウス（１０週令）はＯｒｉｅｎｔａｌ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃ． から購入した。 Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ （１０週令）はＪａｐａｎ ＳＬＣ Ｉｎｃ．から購入した。 Ｗｉｓｔａｒラットは ＳＬＣ から購入した。チオアセトアミド誘発急性肝炎モデル．２５グラムから３０グラムの雄マウスを肝障害モデルに使用した。チオレドキシントランスジェニックマウス（２３匹）と野生型マウス（２３匹）に対して，チオアセトアミド（２００μｇ／ｇ ａｎｄ １００μｇ／ｇ） を腹腔内投与した。２４時間後にジエチルエーテルで麻酔したうえで，肝を摘出した。肝の一部は１０％ホルマリンで固定し，組織学的実験に使用した。残りの肝組織は液体窒素で瞬時に凍結し，−８０℃で保存した。チオアセトアミド誘発慢性肝線維化モデル． チオレドキシントランスジェニックマウス（１０匹）と野生型マウス（１０匹）に対して，チオアセトアミド（５０ μｇ／ｇ）を週３回，４週間，腹腔内投与した。最後の投与の翌日に，ジエチルエーテルで麻酔したうえで，肝を摘出した。肝の一部は１０％ホルマリンで固定し，組織学的実験に使用した。残りの肝組織は液体窒素で瞬時に凍結し，―８０℃で保存した。ラット，マウス肝星細胞分離． Ｗｉｓｔａｒラット肝とＣ５７ＢＬ／６ マウス肝からプロナーゼＥとコラゲナーゼにより灌流消化を行ったうえで，ナイコデンツ密度勾配遠心法により肝星細胞を分離した。細胞純度は細胞形態とビタミンＡによる自家蛍光から判定し，９５％以上である。 プラスチックプレート上で，１０％血清入りダルベッコイーグルメヂウムで培養した。２日毎にメヂウム交換をした。［３Ｈ］チミジン取り込み実験． 培養活性化星細胞の培養上清中にチオレドキシンを添加し，２４時間培養した。 １．０μＣｉ／ｍｌ ［３Ｈ］チミジンを添加し，６時間後にその放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。ウエスタンブロッテイング． チオレドキシンで処理した肝星細胞を１× ＳＤＳ サンプルバッファー（１００μｌ／３５−ｍｍ ｄｉｓｈ） （６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ６．８，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ２％ ＳＤＳ， ５％ ２−β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ， １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）で溶解し，サンプルを作成した。熱変性後，各サンプル （１０μｇ ） をＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （１２％） に供し， Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ 膜 に転写した。 ｈＴＲＸ とα−ＳＭＡに対する抗体で反応させた後，２次抗体で反応させ，ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔでバンドを検出した。ノーザンブロテイング． Ｉｓｏｇｅｎ を用いて，培養星細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。 Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ （２０μｇ） を１％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ で分離したのち， ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ （Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に転写した。ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎで作成した二重鎖ＤＮＡを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルしてプローブとした。ＤＮＡ配列を確認した。プライマーは以下に示す： α１ ｔｙｐｅＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ， ５’−ＧＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＴ−３’ （ｆｏｒｗａｒｄ） ａｎｄ ３’−ＣＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣ−５’ （ｒｅｖｅｒｓｅ）； ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’ （ｆｏｒｗａｒｄ） ａｎｄ ３’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−５’ （ｒｅｖｅｒｓｅ）。 プローブと膜をハイブリダイゼーションさせ，オートラジオグラフィー のバンドをＫｏｄａｋ ＸＡＲ５ ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ上で検出した。マロリーアザン染色．パラフィン包埋した組織片を４−μｍ の厚さに切り，切片を作成した。アザン染色を行った。 Ｍａｃ ＳＣＯＰＥ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５と Ｐｈｏｔｇｒａｂ−２５００ ｆｏｒＭａｃｉｎｔｏｓｈ ＦＵＪＩＸ ＳＨ−２５／Ｍ を用いて，画像を取り込み，線維化領域を測定した。免疫組織染色．パラフィン包埋切片を １％ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ， ０．１％ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ， １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で 処理した。 １：５０に希釈した ｈＴＲＸとα−ＳＭＡに対するマウス モノクローナル抗体で反応させ，その後１：２００で希釈した ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２ で１時間室温で反応させ，ＤＡＢで発色させた。（２）結果障害肝におけるチオレドキシンの発現． 組織免疫染色にて，チオレドキシンは慢性肝線維化における肝細胞で強発現し，線維束に存在する非実質細胞（肝星細胞）では発現がほとんど無いことが判明した。なお，正常肝では，肝細胞におけるチオレドキシン発現はほとんど無い（図１）。チオアセトアミド誘発急性肝炎モデルでの効果． チオレドキシンが肝障害防御に関与するかを検討するために，チオレドキシントランスジェニックマウスを用いて，急性肝炎モデルを適応して検討した。野生型マウスとチオレドキシントランスジェニックマウスに過量のチオアセトアミドを腹腔内投与し急性肝炎を起こした。投与後２４時間７日間での生存率は，チオレドキシントランスジェニックマウスのほうが，野生型マウスより有意に高かった（図２Ａ， Ｂ）。肝酵素ＡＳＴ とＡＬＴのレベルは， チオレドキシントランスジェニックマウスのほうが，野生型マウスより有意に低かった（図２Ｃ）。ヘマトキシリンエオジン染色では，肝細胞壊死による脱落はチオレドキシントランスジェニックマウスのほうが，野生型マウスより有意に抑制されていた（図２Ｄ）。チオレドキシントランスジェニックマウスでのアポトーシス抑制． 動物実験における肝炎抑制の機序について，アポトーシスについて検討した。タネル染色にて，肝中心静脈周囲ゾーン３で，タネル陽性細胞は，チオレドキシントランスジェニックマウスのほうが，野生型マウスより有意に少なかった（図２Ｅ）。チオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２におけるＴＮＦ−α誘発細胞死抑制．つぎに，肝細胞株ＨｅｐＧ２ を用いて，チオレドキシンの効果を検討した。チオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２ と優性ネガテイブチオレドキシン発現肝細胞株ＨｅｐＧ２を作成し，その培養上清中に腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ （ＴＮＦ−ａｌｐｈａ） を添加し，細胞死を誘導した。細胞の生存率はＭＴＴアッセイによって，測定した。ＴＮＦ−ａｌｐｈａによる細胞死は，チオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２ においてコントロールの肝細胞株ＨｅｐＧ２より低く，優性ネガテイブチオレドキシン発現肝細胞株ＨｅｐＧ２においてコントロールの肝細胞株ＨｅｐＧ２より高い（図３）。チオアセトアミド誘発慢性肝線維化モデルでの効果． つぎに，チオレドキシンが肝線維化にどのような影響があるかを検討した。チオアセトアミド週３回４週間の長期投与によって肝線維化モデルを作成した。アザン染色にて組織学的検討を行った。肝線維化領域の面積はチオレドキシントランスジェニックマウスのほうが，野生型マウスより有意に少なかった（図４Ａ， Ｂ）。肝酵素ＡＳＴ とＡＬＴのレベルは， チオレドキシントランスジェニックマウスのほうが，野生型マウスより有意に低かった（図４Ｃ）。チオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２と初代培養星細胞との共培養．次に，チオレドキシントランスジェニックマウスにおける肝線維化抑制の機序に肝星細胞が関与しているかを検討するために，ラット肝から分離培養した初代培養肝星細胞とチオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２ および優性ネガテイブチオレドキシン発現肝細胞株ＨｅｐＧ２との共培養を行った。共培養後２４時間での肝星細胞のＤＮＡ合成能を見るために ［３Ｈ］チミジン取り込み実験を行った。肝星細胞のＤＮＡ合成能はチオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２ との共培養においてコントロールの肝細胞株ＨｅｐＧ２との共培養より低く，優性ネガテイブチオレドキシン発現肝細胞株ＨｅｐＧ２との共培養においてコントロールの肝細胞株ＨｅｐＧ２との共培養より高い（図５Ａ）。これらの結果から肝細胞株ＨｅｐＧ２から分泌されるチオレドキシンが活性化肝星細胞の増殖能を抑制している可能性が示唆された。外因性チオレドキシンの培養星細胞増殖抑制効果． チオレドキシンが肝星細胞の増殖能を抑制するかを検討した。培養星細胞の培養上清にリコンビナントチオレドキシンを添加して，肝星細胞のＤＮＡ合成能を見るために ［３Ｈ］チミジン取り込み実験を行った。リコンビナントチオレドキシンは肝星細胞の増殖能を濃度依存性に抑制した（図５Ｂ）。（３）考察本実施例では，チオレドキシンの急性肝炎および慢性肝線維化に対する効果をチオレドキシントランスジェニックマウスを用いて検討した。チオアセトアミド誘発急性肝炎モデルでは，生存率，肝酵素，組織のいずれもチオレドキシントランスジェニックマウスにおいて改善した。加えて，タネル染色では，チオレドキシントランスジェニックマウスにおいてアポトーシスが抑制されていることが示された。チオアセトアミドは肝細胞の細胞質において活性酸素種を産生することにより肝細胞を障害することが知られている。 活性酸素種はまた肝細胞のアポトーシスを誘発し，細胞死にいたらしめる。これらのことからもチオアセトアミド誘発急性肝炎モデルにおけるチオレドキシンの抗アポトーシス効果は活性酸素種の排除によると考えている。脳虚血障害モデルでは，中大動脈閉塞後のタンパクカルボニル化の抑制によって チオレドキシントランスジェニックマウスにおいては改善することが示された。さらに，われわれは，チオレドキシン強発現細胞はペロキシナイトライト誘導性の細胞障害に抵抗性を示すことを報告している。また，チオレドキシンによる抗アポトーシスの機序について報告されている。チオレドキシンは，ｐ５３ およびｐ３８を抑制してアポトーシスを抑制し，また，ＡＳＫ−１をフ゛ロックすることにより ＴＮＦ−（誘導性のアポトーシスを抑制した。【００２１】肝線維化もチオレドキシントランスジェニックマウスにおいて改善した。肝酵素が有意に改善していることからも，チオレドキシンの抗線維化作用は肝細胞死抑制の２次的効果が大きいと考えている。 しかし，おもしろいことに，外因性のチオレドキシンに肝星細胞増殖抑制効果のあることを発見した。実際，肝星細胞のＤＮＡ合成能はチオレドキシン強発現肝細胞株ＨｅｐＧ２ との共培養において抑制された（ｒｅｆ． ８） 。これらの結果は，肝線維化の際に肝細胞で強発現するチオレドキシンは肝細胞への抗アポトーシス作用だけでなく，その周囲の肝星細胞への抗増殖作用も発揮していることを示唆する。【００２２】以前，我々は，抗酸化剤Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ が肝星細胞の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）依存性増殖能を抑制する事を報告した。その機序は，Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ が，星細胞から分泌されるカテプシンＢの酵素活性を上昇させ，ＰＤＧＦ受容体を分解することにより，抑制された（ｒｅｆ． ９） 。本研究でも，チオレドキシンが星細胞の増殖能を抑制するが，ＰＤＧＦなどの細胞膜受容体に影響はなかった。肝星細胞は酸化ストレスにより増殖も含めた活性化を起こすことから，われわれは，チオレドキシンの抗増殖作用は活性酸素種の排除によると考えている。【００２３】線維化は増殖能と同様に活性化星細胞の重要な機能であることはよく知られている（ｒｅｆ． １０）。抗線維化療法は 肝硬変の治療に有効となりうる（ｒｅｆ． １１）。以前，報告したように，抗酸化剤Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ は動物モデルだけでなく，培養星細胞でもそのコラーゲン発現をｍＲＮＡレベルで抑制する。チオレドキシンは培養肝星細胞においてむしろコラーゲン産生を促進する傾向がみられた。さらに，われわれは，チオレドキシン強発現マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３を作成し，コラーゲン発現とチオレドキシンとの関係を検討したが，ＮＩＨ３Ｔ３では，チオレドキシンはコラーゲン発現に影響なかった（未発表）。これらの結果からも，動物モデルにおけるチオレドキシンの線維化抑制効果は，肝細胞死抑制と星細胞増殖抑制効果によると考えられる。【００２４】抗線維化治療薬はこれまでいくつか報告されているが，すべて人工の薬剤である。よって，その副作用がつねに問題となり，臨床応用にはなかなか結びつかなかった。しかし，チオレドキシンは体内でも発現する内因性のチオールタンパクであるため，より臨床応用に導きやすいと考えている。【００２５】結論として，チオレドキシンは急性および慢性肝疾患の有効な治療法となることが示された。参考文献１． Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ， Ｙｏｄｏｉ Ｊ． Ｒｅｄｏｘ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７； １５： ３５１−３６９．２． Ｈｉｒｏｔａ Ｋ， Ｍａｔｓｕｉ Ｍ， Ｉｗａｔａ Ｓ， Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ａ， Ｍｏｒｉ Ｋ， Ｙｏｄｏｉ Ｊ． ＡＰ−１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｆ−１． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９９７； ９４（８）： ３６３３−３６３８．３． Ｔａｋａｇｉ Ｙ， Ｍｉｔｓｕｉ Ａ， Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９９９； ９６（７）： ４１３１−４１３６．４． Ｏｋｕｙａｍａ Ｈ， Ｓｈｉｍａｈａｒａ Ｙ， Ｋａｗａｄａ Ｎ． Ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｔ−ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｒａ． Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ． ２００２； １７（２）： ４８７−４９５．５． Ｓｈｉｍａｈａｒａ Ｙ， Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｎ， Ｕｙａｍａ Ｎ， Ｏｋｕｙａｍａ Ｈ， Ｍｏｍｏｉ Ｈ， Ｋａｍｉｋａｗａ Ｔ， Ｔｅｒａｊｉｍａ Ｈ， Ｉｉｍｕｒｏ Ｙ， Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ， Ｉｋａｉ Ｉ， Ｋｕｓｈｉｈａｔａ Ｆ， Ｋｉｙｏｃｈｉ Ｈ， ＫｏｂａｙａｓｈｉＮ， Ｙａｍａｏｋａ Ｙ． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｉｚｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｄａｍａｇｅ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｓｕｒｇ． ２００２； ２６（４）： ４５１−４５６．６． Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＤＢ， Ａｓａｈｉｎａ Ｋ， Ｎａｋａｔａｎｉ Ｋ， Ｍｉｎａｍｉｙａｍａ Ｙ， Ｓｅｋｉ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ Ｋ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＳＴＡＰ） ｗｉｔｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１； ２７６（２７）： ２５３１８−２５３２３．７． Ｏｋｕｙａｍａ Ｈ， Ｓｈｉｍａｈａｒａ Ｙ， Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｓｅｋｉ Ｓ， Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＤＢ， Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ Ｋ，Ｕｙａｍａ Ｎ， Ｙａｍａｏｋａ Ｙ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｒｅｄｏｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１； ２７６（３０）： ２８２７４−２８２８０．８． Ｕｙａｍａ Ｎ， Ｓｈｉｍａｈａｒａ Ｙ， Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｓｅｋｉ Ｓ， Ｏｋｕｙａｍａ Ｈ， Ｉｉｍｕｒｏ Ｙ， Ｙａｍａｏｋａ Ｙ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ． Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． ２００２； ３６（５）： ５９０−５９９．９． Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＤＢ， Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｉｍａｍｕｒａ Ｋ， Ｍｉｙａｍｏｔｏ Ｙ， Ｔａｔｅｎｏ Ｃ， Ｓｅｋｉ Ｓ， Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ Ｋ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ． ２０００； ３２（２）： ２６８−２７７．１０． Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｔｒａｎ−Ｔｈｉ ＴＡ， Ｋｌｅｉｎ Ｈ， Ｄｅｃｋｅｒ Ｋ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅ （Ｉｔｏ） ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｔｏｎｕｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９３； ２１３（２）： ８１５−８２３．１１． Ｏｋｕｎｏ Ｍ， Ａｋｉｔａ Ｋ， Ｍｏｒｉｗａｋｉ Ｈ， Ｋａｗａｄａ Ｎ， Ｉｋｅｄａ Ｋ， Ｋａｎｅｄａ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，Ｋｏｊｉｍａ Ｓ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｃａｍｏｓｔａｔ ｍｅｓｉｌａｔｅ， ｖｉａ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ＴＧＦ−ｂｅｔａ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２００１； １２０（７）： １７８４−１８００．【配列表】【図面の簡単な説明】【図１】線維化肝におけるチオレドキシン発現チオレドキシンの免疫組織染色．左側：正常ラット肝（１００倍），右側：チオアセトアミド誘発ラット線維化肝（１００倍）．【図２】急性致死性肝炎に対するチオレドキシンの効果Ａ．チオアセトアミド誘発急性致死性肝炎（２００（ｇ／ｇ）における生存率Ｂ．チオアセトアミド誘発急性致死性肝炎（１００（ｇ／ｇ）における生存率Ｃ．チオアセトアミド投与後２４時間での血清ＧＯＴ， ＧＰＴレベルＤ．ヘマトキシリンエオジン染色による組織学的解析Ｅ．タネル染色によるアポトーシス検出【図３】ＨｅｐＧ２におけるＴＮＦ−α誘導細胞死に対するチオレドキシンの効果チオレドキシン安定発現ＨｅｐＧ２にＴＮＦ−αとシクロヘキシミドを添加し，細胞死を誘発した．添加後２４時間で，ＭＴＴアッセイを行った．ＥＶ： ｐｃＤＮＡ３ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＨｅｐＧ２． ｗｔ： ＴＲＸ ｗｔ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＨｅｐＧ２． ｄｍ： ＴＲＸ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＨｅｐＧ２．【図４】肝線維化に対するチオレドキシンの効果Ａ．マロリーアザン染色による組織学的解析Ｂ．線維化領域の評価．Ｃ．チオアセトアミド最終投与後２４時間での血清ＧＯＴ， ＧＰＴレベル【図５】チオレドキシンによる培養星細胞の増殖能の抑制．Ａ．チオレドキシン安定発現ＨｅｐＧ２との共培養による星細胞増殖能への抑制効果．Ｂ．チオレドキシンによる星細胞増殖能への抑制効果． チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする急性肝炎治療剤。 チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする慢性肝炎の治療剤。 慢性肝炎が肝線維化である請求項２に記載の治療剤。 【課題】肝疾患治療剤を提供する。【解決手段】チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする急性肝炎及び慢性肝炎（肝線維化を含む）治療剤に関する。【選択図】なし