生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ハプトグロビン様作用を持つヘモグロビン認識ペプチド |
| 出願番号： | 2002221798 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C12N15/09,C07K7/08,A61K38/00,A61P43/00 |
特許情報キャッシュ
冷牟田 修一 JP 2004057115 公開特許公報(A) 20040226 2002221798 20020730 ハプトグロビン様作用を持つヘモグロビン認識ペプチド 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 591001949 野村 健一 100107870 間山 世津子 100098121 冷牟田 修一 7 C12N15/09 C07K7/08 A61K38/00 A61P43/00 JP C12N15/00 A C07K7/08 A61K37/02 A61P43/00 111 2 ＯＬ 7 （出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１３年度新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの） 4B024 4C084 4H045 4B024AA01 4B024AA11 4B024BA80 4B024CA05 4B024CA07 4B024DA06 4B024EA03 4B024GA11 4C084AA07 4C084BA01 4C084BA08 4C084BA18 4C084BA23 4C084CA59 4C084NA14 4C084ZA51 4C084ZB21 4H045AA10 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA16 4H045BA41 4H045EA20 4H045EA50 4H045FA20 4H045FA74 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビンを認識し、ハプトグロビン様作用を持つペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。【０００２】【従来の技術】ハプトグロビンはヘモグロビンを認識し強固な結合をすることで知られるタンパク質である。その生理的意義の全容はいまだ不明であるが、複合体を作ることにより、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強することが知られている。また、最近、複合体を形成することにより構造の変化が起こり、マラリア等の感染症や遺伝病（鎌状赤血球症）で上昇する溶血ヘモグロビンの処理にも役立っていることが解ってきた（Ｎａｔｕｒｅ，４０９， １９８−２０１ （２００１））。【０００３】【発明が解決しようとする課題】低分子の化合物でハプトグロビンと同様の作用を持つ化合物があれば、ハプトグロビンの生体内での機能を調べるのに有用である。本発明の目的は、そのようなハプトグロビン様化合物を提供することにある。【０００４】【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ヘモグロビンに対し親和力を持ち、かつハプトグロビン様作用を持つペプチドを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。【０００５】即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。（ａ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるペプチド（ｂ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつヘモグロビンを認識し、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用を持つペプチドまた、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。【０００６】【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。【０００７】本発明のペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すものである。（ａ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるペプチド（ｂ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつヘモグロビンを認識し、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用を持つペプチド（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。【０００８】本発明のペプチドは、ヘモグロビンと特異的に結合することから、ヘモグロビンの検出に利用することができる。また、ハプトグロビンと同様の作用を持つことから、ハプトグロビンの異常等によって生じる疾患などの治療薬として利用できる可能性もある。【０００９】【実施例】〔実施例１〕 ヘモグロビンの精製ヒト脱繊維血液２０ｍｌを遠沈管に取り、バランスをとった後、遠心機で３０００回転／分で５分間遠心した。遠心機から静かに遠沈管を取り出し、駒込ピペットを使い血清を除去した。遠沈管に残った血球の約３倍容の０．９％ＮａＣｌ水溶液（氷冷）を加え、駒込ピペットで空気を送り込みながら攪拌した。バランスをとった後、３０００回転／分で５分間遠心した。遠心機から遠沈管を静かに取り出し、駒込ピペットで上澄みを取り除いた。上述した０．９％ＮａＣｌ水溶液の添加から遠心までの操作を２回繰り返し、赤血球を洗浄した。【００１０】遠心して集めた赤血球に等容の冷蒸留水を加え、駒込ピペットで攪拌して溶血させた。これに赤血球の約半量のエーテル（氷冷）を加えて、駒込ピペットを使い約５分間攪拌した。攪拌は遠沈管を氷冷しながら行った。攪拌後、バランスをとり、３０００回転／分で５分間遠心した。遠心の結果、液は上からエーテル層、赤血球膜層、ヘモグロビン層の３層に分離したので、駒込ピペットを使いヘモグロビン層だけを取り出し、ＰＢＳに対し、透析し、精製ヘモグロビンを得た。【００１１】〔実施例２〕 ヘモグロビン認識ペプチドを含むクローンの選択実施例１で精製したヘモグロビンをポリスチレンのカラムに固相化し、次いで、２％カゼイン溶液によりヘモグロビンの付着していない部分をブロッキングした。ランダムペプチドライブラリーを加え、１〜数時間反応させた。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の♯Ｅ８１１０Ｓ Ｐｈ Ｄ．−１２ＴＭｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、１２アミノ酸残基からなる約１０１０種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。【００１２】反応終了後、０．０５〜０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、「Ｔｗｅｅｎ ２０」という）含有ＰＢＳで１０〜数十回洗浄し、その後、５％カゼイン溶液を加え１〜数時間静置した。再びＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄したのち、ハプトグロビン（２−２型）溶液（１００μｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加した。室温で１時間静置した後、ピペッティングし、取り出した画分を溶出画分とした。【００１３】溶出画分をＥ．ｃｏｌｉ （ＥＲ２５３７）に感染させ、ＩＰＴＧ−Ｘ Ｇａｌ プレート上に生育させた。そこから１００クローンを拾い培養した後、ウレアーゼを固相化したプレートを用いてＥＬＩＳＡ行った。ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。まず、精製ヘモグロビン（１０μｇ／ｍｌ， １００μｌ）をプレートに固定し、これにペプチド提示ファージ溶液（１００μｌ）を加え、室温で２時間静置した。次に、プレートを洗浄し、未結合のファージを取り除いた後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（ファルマシア社製抗Ｍ１３ファージ抗体、２０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で２時間静置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液（フナコシ社製）を加え、発色させた。ＥＬＩＳＡの結果、ヘモグロビンと強く反応するクローンが幾つかみつかった（クローンＮｏ．１〜４）。これらのクローンを含む溶液の吸光度、及びバックグラウンド（ヘモグロビンをプレートに固定せず、他は同様の操作を行った。）の吸光度を図１に示す。【００１４】〔実施例３〕 ハプトグロビン様活性の検出実施例２でヘモグロビンに対する反応性が確認されたクローン（クローンＮｏ．１〜４）を培養後、ＰＥＧ／ＮａＣｌにより濃縮した。【００１５】精製へモグロビン（１ｍｇ／ｍｌ， ２０μｌ）をＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。このＰＶＤＦ膜を以下の（ａ）〜（ｆ）の試験液に浸漬した後、パーオキシダーゼの発色基質溶液に浸漬した。（ａ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．１のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は１０１２ｔ．ｕ．／ｍｌである。ファージ１粒子あたり５個のペプチドが提示されている。）（ｂ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．２のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は上記と同じ）（ｃ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．３のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は上記と同じ）（ｄ）ＰＢＳ及びクローンＮｏ．４のファージ溶液を含む試験液（ファージ濃度は上記と同じ）（ｅ）ＰＢＳ及びハプトグロビンを含む試験液（ハプトグロビン濃度は１０μｇ／ｍｌ）（ｆ）ＰＢＳのみを含む試験液。【００１６】発色基質溶液は、ジアミノベンジジン１０ｍｇを１０ｍｌの精製水に溶解し、これに１ｍｌの酢酸バッファー（ｐＨ ４．５）を加えた後、過酸化水素水を１２．５μｌ加えて調製した。【００１７】各ＰＶＤＦ膜上のヘモグロビンの発色状態を調べた結果、クローンＮｏ．１〜Ｎｏ．３のファージ溶液及びハプトグロビンを含む試験液に浸漬した場合に強い発色がみられた。クローンＮｏ．４のファージ溶液を含む試験液に浸漬した場合は、ＰＢＳのみを含む試験液に浸漬した場合と同程度の発色しかみられなかった。以上のことから、クローンＮｏ．１〜Ｎｏ．３のファージが提示するペプチドは、ハプトグロビンと同様にヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用があると考えられる。なお、図２に、（ｆ）の試験液に浸漬したＰＶＤＦ膜（図中のＡ）及び（ａ）の試験液に浸漬したＰＶＤＦ膜（図中のＢ）を示す。【００１８】〔実施例４〕 ペプチドのアミノ酸配列の解析実施例３でハプトグロビン様活性が確認されたクローン（クローンＮｏ．１〜３）の培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、前記クローンが提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。クローンＮｏ．１、２、３が提示していたペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、２、３に示す。【００１９】【発明の効果】本発明のペプチドは、ヘモグロビンと特異的に結合するので、ヘモグロビンの検出に有用である。また、本発明のペプチドは、生体物質であるハプトグロビンと同様の活性を持つことからペプチド医薬としても有用である。【００２０】【配列表】【図面の簡単な説明】【図１】本発明のペプチドとヘモグロビンとの反応性を示す図である。【図２】ハプトグロビン様活性の検出試験の結果を示す図である。 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチド。（ａ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列により表されるペプチド（ｂ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつヘモグロビンを認識し、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用を持つペプチド 請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。 【課題】低分子の化合物でハプトグロビンと同様の作用を持つ化合物を提供する。【解決手段】ヘモグロビンを認識し、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を増強する作用を持つペプチド、及びそれをコードするポリヌクレオチド。【選択図】 なし