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高妻　卓司 JP 2004049063 公開特許公報(A) 20040219 2002208986 20020718 プロテアーゼ含有試薬を用いた定量方法および定量試薬 旭化成ファーマ株式会社 303046299 高妻　卓司 7 C12Q1/37 JP C12Q1/37 11 ＯＬ 9 4B063 4B063QA01 4B063QA19 4B063QQ67 4B063QQ79 4B063QR02 4B063QR16 4B063QS24 4B063QS28 4B063QS36 4B063QX01 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼ含有試薬を用いた定量方法、試薬及び試薬キットに関するものである。より詳細には、本発明は、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンのごとき糖化タンパク質の定量方法および定量に用いるプロテアーゼ含有試薬に関し、定量においてブランクを低減させる技術、特にプロテアーゼ含有試薬の保存時に生じるブランクの上昇を回避する技術に関するものである。本発明は臨床検査の技術分野において有用である。【０００２】【従来の技術】プロテアーゼは近年、産業用として大量供給されるようになり、臨床検査でも前処理用等で用いられるようになった。特に糖尿病の臨床検査の分野では、タンパク質中の糖化タンパク質割合が、血糖コントロール状態を良好に反映することから、プロテアーゼを用いた糖化タンパク質の定量法が開発されてきた（特開平６−４６８４６号公報、特開平５−１９２１９３号公報、ＷＯ９８／４８０４３号公報、ＷＯ９７／１３８７２号公報等）。また、本発明者らも正確に糖化タンパク質を定量する目的で、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法（特開２００１−５４３９８）、糖化タンパク質割合の測定方法（特開２００１−２０４４９）を開発してきた。【０００３】しかしながらこれらの定量において用いるプロテアーゼ含有試薬は、特に保存によりブランクが上昇してくる問題があり、この問題の解決なしには正確な糖化タンパク質の定量が困難であることが解ってきた。ここでブランクとは、試料の代わりに生理的食塩水や蒸留水を測定した場合のバックグラウンドノイズのことをいい、通常は試料の測定値から差し引かれるものである。この値が大きくなると、ブランク感度（ノイズ）に対する試料の感度が小さくなり、測定誤差が生まれやすくなることから、ブランクは小さい方が好ましい。プロテアーゼを含有する試薬のブランクを低減させる方法、特に保存時のブランク上昇を抑える方法についてはこれまで知られていなかった。【０００４】【発明が解決しようとする課題】以上のとおり、プロテアーゼを含有する試薬において、ブランクを小さくする必要、特に保存時のブランク上昇を回避する必要がある。本発明の課題は、プロテアーゼを含有する試薬についてブランクを小さくすること、特に保存時のブランク上昇を回避することにあり、プロテアーゼおよびカタラーゼを共存させたプロテアーゼ試薬を用いることにより、プロテアーゼ試薬を用いた定量においてブランクの低減、特に保存時のブランクの上昇を低減させることにある。さらに、具体的には、臨床生化学検査において好ましく用いられる糖化蛋白質定量方法及びその定量に用いられる試薬を提供することにある。【０００５】【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するためには、本発明者は、プロテアーゼを含有する試薬（単に「プロテアーゼ試薬」ということがある。）がなぜ保存時にブランク上昇を引き起こすのかの原因を究明して、その原因を除去することを試みた。そこで本発明者らは鋭意検討した結果、過酸化物の生成がブランク上昇の原因であること、その原因を消去するにはカタラーゼの処方が有効であることを突き止めた。さらに、プロテアーゼと他の酵素を共存させた場合に、一般的には他の酵素はプロテアーゼの作用により速やかにその活性を失うが、カタラーゼは意外にもプロテアーゼに対して安定であり、長期間の保存でもその活性を失わないことを見出し本発明の完成に至った。【０００６】すなわち、本発明は、プロテアーゼ試薬を用いて定量する方法において、プロテアーゼおよびカタラーゼを共存させることにより、プロテアーゼ試薬のブランクを低減させる方法、特に保存時のブランク上昇を低減させる方法及びその方法に用いるプロテアーゼ試薬及びキットに関し、特に臨床生化学検査における糖化蛋白質の定量に有用な定量方法、試薬及びキットに関する。【０００７】以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。本発明に使用しうるプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。特に糖化タンパク質を定量する場合には、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良いが、例えばトリプシン（Ｔｒｉｐｓｉｎ）、キモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｉｐｓｉｎ）等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。【０００８】微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）　等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−ｃ（シグマ社製）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ａ；シグマ社製）　等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ；シグマ社製）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｔ；ベーリンガー・マンハイム社製）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ；和光純薬社製）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来、リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ和光純薬社製）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例はあくまで例示であって、本件発明をなんら限定するものではない。【０００９】本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定にはカゼインフォリン法を用いた。活性の定義は、１分間−３７℃において１μｇのチロシンに相当する発色を１Ｕとした。【００１０】本発明に使用しうるカタラーゼとしては臨床検査に使用できるものであればいかなるカタラーゼを用いても良いが、例えば牛肝臓由来、人赤血球由来（以上和光純薬社製）などの動物由来のカタラーゼ、アスペルギルス由来（シグマ社製）、ミクロコッカス由来、ロドシュードモナス由来等の細菌由来のカタラーゼが挙げられる。【００１１】カタラーゼの活性は過酸化水素の減少をＵＶ２４０ｎｍの吸光度変化を測定して決定した。活性の定義は、１分間−２５℃において１μｍｏｌの過酸化水素を分解する活性を１Ｕとした。プロテアーゼ及びカタラーゼを共存させる場合に、カタラーゼの安定性を考慮すると、同じ属由来の酵素同士の組み合わせ、例えばプロテアーゼにバチルス由来のものを用いた場合には、バチルス由来のカタラーゼを用いることが好ましいが、それ以外の組み合わせを用いても良い。【００１２】本発明を糖化タンパク質の定量に適用する場合には、プロテアーゼを用いて対象となる糖化タンパク質を少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の基質になる程度に断片化し、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を作用させて定量すれば良い。少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素としては、前記プロテアーゼの作用により、被検液に含まれる糖化タンパク質から生成される糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに有効に作用し、実質的に糖化タンパク質が定量できる酵素であれば如何なるものを用いても良いが、糖化アルブミンを定量対象とする場合には、εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましく、糖化ヘモグロビンを定量対象とする場合には、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素が好ましい。【００１３】εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属又はデバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来の少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素等が挙げられる。αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素の例としては、上記εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用する酵素及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）由来の酵素が挙げられる。さらに、αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくはペプチドに作用し、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（Ｒ−ＦＯＤ；旭化成社製）が挙げられる。【００１４】糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は特開２００１−２０４４９（糖化タンパク質割合い測定方法）記載の方法にて測定し、３７度−１　分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。【００１５】本発明のプロテアーゼ含有試薬のブランクを低減させる方法については、プロテアーゼ及びカタラーゼを同一試薬に含有するように組成を決定すれば良い。またプロテアーゼ反応により生成する物質を定量する場合、例えば糖化アミノ酸を定量する場合には、例えば第一試薬にカタラーゼ及びプロテアーゼを処方し、第二試薬に発色系の試薬、例えば少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を処方すれば良い。またプロテアーゼの安定化や、アスコルビン酸、糖化アミノ酸の消去系を組み込む目的で第２試薬にカタラーゼ及びプロテアーゼを処方し、第一試薬に発色系の試薬及び消去系の試薬、例えば少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、アスコルビン酸オキシダーゼ等を処方してもよい。また、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素としてオキシダーゼを用いる場合には、少なくとも糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼを含有する試薬にアジ化ナトリウムを処方することにより、カタラーゼを失活させて、オキシダーゼを作用させれば生じた過酸化水素を問題なく定量することが出来る。【００１６】本発明に使用し得るプロテアーゼ試薬におけるプロテアーゼの濃度としては０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌの濃度であれば良く、好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。また本発明に使用し得るプロテアーゼ試薬におけるカタラーゼの濃度としては０．１Ｕ〜５ＫＵ／ｍｌの濃度であれば良く、好ましくは１Ｕ〜１ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌであるがこれ以外の量を用いても良い。さらに本発明の試薬キットに使用し得る、カタラーゼを失活させる目的で使用するアジ化ナトリウムを含む試薬のアジ化ナトリウムの濃度としては０．００１％〜１０％の濃度であれば良く、好ましくは０．０１％〜５％、最も好ましくは０．０２％〜２％であるがこれ以外の量を用いても良い。【００１７】以上のことから、本発明においては、プロテアーゼを含む試薬のブランクを低減させるために、プロテアーゼとカタラーゼとを共存するものとして試薬を調製するのであって、試薬は例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。【００１８】また本発明を、電極等を用いた定量、例えば電極を用いた過酸化水素の定量に応用することも可能である。このような場合、プロテアーゼが電極に固定されているなら、カタラーゼも同時に固定化されていても良く、またカタラーゼを電極の保存液中に存在させていても良い。プロテアーゼを前処理溶液として使用する場合には溶液中にプロテアーゼとカタラーゼとを共存させればよい。【００１９】さらに本発明に基づく糖化蛋白質を定量する場合に用いるプロテアーゼ試薬には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。【００２０】本発明の糖化蛋白質定量試薬及び方法に於ける定量対象である糖化蛋白質としては、例えば糖化アルブミンまたは糖化ヘモグロビンが挙げられるが、定量対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定されるものではなく、特定蛋白質以外の蛋白質由来の糖化蛋白質、例えばグロブリン成分以外の蛋白質由来の糖化蛋白質で有れば、何れの糖化蛋白質を定量しても良い。【００２１】【発明の実施の形態】次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。【実施例１】【００２２】＜反応手順＞上記プロテアーゼ試薬１８０μｌおよび試料９μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）。ブランク用試料には蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。さらに調製した試薬を３７℃１週間保存して同様の試験を行い保存によるブランクの変化を測定した。その結果を表１に示す。【００２３】【表１】表１から分かるように、カタラーゼ添加により試薬の初期のブランクそのものも低減し、かつ保存時のブランク上昇も劇的に低減していた。ブランクの低減にカタラーゼ添加が非常に有効であることが明白となった。【００２４】【実施例２】【００２５】＜反応手順＞上記プロテアーゼ試薬１８０μｌおよび試料９μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）。ブランク用試料には蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。また試料に管理血清を用いて感度（感度ΔＡ＝（Ａ１−Ａ０）−（Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を求めた。さらに調製した試薬を３７℃１週間保存して同様の試験を行い保存による感度及びブランクの変化を測定した。発色試薬はアジ化ナトリウムありなしの２種類を検討した。アジ化ナトリウムありの場合の結果を表２に示す。【００２６】【表２】表２から分かるように、カタラーゼ添加により糖化アルブミン定量試薬のブランクそのものも低下し、かつ保存時のブランク上昇も劇的に低下していた。しかも試料の定量結果へのカタラーゼ添加の影響はアジ化ナトリウムの存在する系では観察されなかった。またアジ化ナトリウムを処方しない場合、保存初日の試料の感度はカタラーゼ含有５００Ｕ／ｍｌにおいて２１．２ｍＡｂｓと有意に低く（含有した場合は５６．３ｍＡｂｓ）、カタラーゼが過酸化水素を消去し、測定を不正確にしていることが分かった。これらのことから、糖化アルブミン定量試薬のブランクの低減にカタラーゼ添加が非常に有効であることが明白であり、かつオキシダーゼを用いてプロテアーゼ反応生成物の定量を行う場合には発色反応時にアジ化ナトリウムを共存させカタラーゼ反応を止めてから発色すれば良いことが明白となった。【００２７】【実施例３】【００２８】＜反応手順＞上記プロテアーゼ試薬１．８ｍｌおよび試料９０μｌを混合し、３７℃−２時間反応させ、分子量１万カットの膜で濾過し、ろ液をプロテアーゼ反応溶液とした。プロテアーゼ反応溶液１８９μｌをセルに分注し５５５ｎｍを測光する（Ａ０）。続いて発色試薬１８０μｌを添加し３７℃−５分間インキュベーションし５５５ｎｍを測光する（Ａ１）。ブランク用試料には蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。また試料にヘモグロビンを用いて感度（感度ΔＡ＝（Ａ１−Ａ０）−（Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を求めた。その結果を表３に示す。【００２９】【表３】表３から分かるように、カタラーゼ添加により糖化ヘモグロビン定量試薬のブランクそのもの、および保存時のブランク上昇も低下していた。しかも試料の定量結果への影響はアジ化ナトリウム添加の系では観察されなかった。これらのことから、糖化ヘモグロビン定量試薬のブランクの低減にカタラーゼ添加が有効であることが明白であった。【００３０】【発明の効果】以上のとおり、カタラーゼを共存させたプロテアーゼ試薬を用いることにより、プロテアーゼ試薬を用いる定量方法において、ブランクが低減され、かつブランクの上昇を低減させることができた。よって、本発明によれば、プロテアーゼ反応生成物を感度良く定量することができた。 カタラーゼを共存させたプロテアーゼ含有試薬を用いることを特徴とするプロテアーゼ含有試薬を用いた定量方法。 試料にカタラーゼを共存させたプロテアーゼ含有試薬を混合して反応を行い、次いでアジ化ナトリウムを添加してカタラーゼを失活させた後、生成物を定量することを特徴とするプロテアーゼ含有試薬を用いた定量方法。 プロテアーゼ含有試薬を用いた定量方法が糖化タンパク質の定量方法であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン若しくは糖化アルブミンであることを特徴とする請求項３に記載の方法。 プロテアーゼ含有試薬にカタラーゼを配合することにより、プロテアーゼ含有試薬のブランクを低減させる方法。 プロテアーゼおよびカタラーゼを含有することを特徴とするプロテアーゼ含有試薬。 試薬が糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする請求項６に記載のプロテアーゼ試薬。 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン若しくは糖化アルブミンである請求項７に記載のプロテアーゼ試薬。 プロテアーゼおよびカタラーゼを含有するプロテアーゼ含有試薬、およびアジ化ナトリウムを含有する試薬を組み合わせてなることを特徴とする試薬キット。 試薬キットが糖化タンパク質の定量に用いるものであることを特徴とする請求項９に記載の試薬キット。 糖化タンパク質が糖化ヘモグロビン若しくは糖化アルブミンである請求項１０に記載の試薬キット。 【課題】プロテアーゼ含有試薬のブランクを低減させる。【解決手段】プロテアーゼ含有試薬にカタラーゼを共存させることにより、ブランク、特に保存時のブランク上昇を低減させる。さらにプロテアーゼ反応の生成物を定量する場合には発色試薬にアジ化ナトリウムを含有させカタラーゼ反応を停止させればよい。【選択図】　　選択図なし

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