生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_金属コロイド粒子 |
| 出願番号： | 2002063024 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | G01N 33/553 |
特許情報キャッシュ
石塚 康司 蓮実 文彦 難波 靖治 野中 浦雄 大倉 一郎 JP 3886000 特許公報(B2) 20061201 2002063024 20020308 金属コロイド粒子 株式会社ビーエル 593025712 井出 正威 100091502 石塚 康司 蓮実 文彦 難波 靖治 野中 浦雄 大倉 一郎 20070228 G01N 33/553 20060101AFI20070208BHJP JPG01N33/553 G01N 33/553 特開平１１−１４００９７（ＪＰ，Ａ） 特開２０００−２６８６３９（ＪＰ，Ａ） 特開平０５−１３３９５６（ＪＰ，Ａ） 特開平０６−１１６６０２（ＪＰ，Ａ） 特表２００３−５１００６５（ＪＰ，Ａ） 11 2003262638 20030919 9 20050222 竹中 靖典 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子およびその製造方法に関し、さらに詳細には、該金属コロイド粒子を用いた標識抗体または抗原、ならびに、該標識抗体または抗原が組み込まれた免疫学的測定用キットおよび免疫学的測定法に係る。【０００２】【従来の技術】免疫学的測定法、就中、イムノクロマト法（ＩＣＡ法）は、その高い特異性に加え、簡易、迅速を特徴とする臨床診断法として実用化されている。イムノクロマト法は、操作が煩雑で重厚な設備、機器などを必要とせず、軽便な器具を使用した簡便な操作により、目視だけでも被検出物の有無を判定できる点で好都合である。【０００３】近年、感染症の診断にイムノクロマト法が用いられているが、その検出感度は、一般に、細菌の場合、１０５〜１０７ＣＦＵ／ｍｌである。細菌の検出感度は遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）によれば１０３〜１０４ＣＦＵ／ｍｌまで達成されている。しかしながら、遺伝子増幅法は重厚な設備、機器および煩雑な操作が必要であり、しかも、検出までに数時間という長時間を要する。【０００４】また、従来、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫学的測定法による検出も行われているが、その感度は、最も高感度の酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）でも１０４〜１０５ＰＦＵ／ｍｌである。感染可能なウイルスの濃度は１０３ＰＦＵ／ｍｌであるため、早期の診断感染予防には、現行の１０倍から１００倍の感度を有する診断法の開発が求められている。【０００５】【発明が解決しようとする課題】従来、イムノクロマト法（ＩＣＡ法）では、細菌やウイルスを特異的に検出するために、金コロイドで標識された抗体を用いることが一般的である。しかしながら、この金コロイド標識を用いたイムノクロマト法の感度は、上記感染症診断に要求される感度を達成するためには必ずしも十分とは言えず、一層高感度な標識が求められている。タンパク質の染色に従来使用されている白金コロイド粒子を抗体の標識に用いることも考えられるが、イムノクロマト法においては白金コロイド粒子の平均粒径が小さいために発色が不充分であり、実用には適さないとされていた。【０００６】本発明は、金コロイド粒子よりも一層高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子を提供することを目的とする。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的の下に鋭意研究した結果、金コロイド粒子の表面に白金微粒子を担持させることにより、金コロイドよりも一層高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】すなわち、本発明によれば、金コロイド粒子の表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子が提供される。本発明では、金コロイド粒子の表面が部分的にまたは全体的に白金で被覆されている態様も包含され、したがって、上記「担持」の用語は、この白金で被覆された態様も含むものである。【０００９】タンパク質の染色に従来用いられている白金コロイド粒子は、粒径が最大で３２オングストローム程度であったが、本発明の金属コロイド粒子は、金コロイド粒子の表面に白金を担持させた構成であるため、従来の白金コロイド粒子よりも見かけ上大きな粒径を有する白金コロイド粒子として機能するため、視認性に優れ、しかも、その表面は良好な白金活性を維持している。【００１０】【発明の実施の形態】本発明の金属コロイド粒子は、溶媒中にて塩化金酸を還元して金コロイド粒子を生成せしめ（以下「第１段還元」と記す）、しかる後、溶媒中にて該金コロイド粒子の存在下で塩化第二白金酸（Ｈ２［ＰｔＣｌ６］（以下「塩化白金酸」と記す）を還元する（以下「第２段還元」と記す）ことによって製造することができる。とりわけ、還元剤を含む溶媒中にて塩化金酸を還元して適当な粒径まで金コロイド粒子を生成せしめた後、直ちに前記溶媒中に適量の塩化白金酸を添加して還元させることにより、前記溶媒中の金コロイド粒子の表面に白金または白金微粒子を担持させることが好ましい。【００１１】還元剤としては、クエン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムなどが好適に使用されるが他の化合物を使用することを妨げない。【００１２】溶媒としては、通常、水が用いられるが、超純水や、イオン交換水を数回蒸留したものを使用することが好ましい。また、第１段還元及び第２段還元の何れも、溶媒を沸騰させるか、または、溶媒に窒素ガスなどの不活性気体を吹き込んで７０℃付近に維持して、溶媒から溶存酸素を除去した状態で行うことが好ましい。【００１３】上記製造方法において、白金を担持させる前の金コロイド粒子の平均粒径は、好ましくは、３０〜１００ｎｍ（ナノメートル）程度とされ、さらに好ましくは、４０〜８０ｎｍ（ナノメートル）程度とされる。金コロイド粒子の平均粒径が過小の場合、白金層が厚くなり触媒活性が低下する。また、過大の場合には金コロイド粒子表面が安定化し、白金の担持が不可能となる。【００１４】また、本発明の金属コロイド粒子の平均粒径は、実用上、通常は、５０〜１５０ｎｍナノメートル程度とされ、さらに好ましくは、６０〜１２０ｎｍ（ナノメートル）程度とされる。金属コロイド粒子の平均粒径が過小の場合、抗体の標識が十分に行えなくなり抗体の機能が失われ、また、過大の場合、メンブレンフィルターを目詰まりさせることになる。【００１５】本発明において、金コロイド粒子および金属コロイド粒子のそれぞれの平均粒径は、いわゆる重力的光散乱法により求められ、具体的には、各コロイド粒子をゾル状態のままで１４０００〜５５３００００×ｇ（重力の大きさ）にて回転せしめた超遠心分離機にかけた際のコロイド粒子の沈降速度から求められる。なお、このようにして求められた金粒子および白金粒子のそれぞれの平均粒径は電子顕微鏡観察により直接測定された金粒子および白金微粒子のそれぞれの平均粒径と実質的に一致する。【００１６】金コロイドおよび金属コロイドの粒径ならびに担持される白金の量及び厚さは、第１段還元および第２段還元のそれぞれにおける塩化金酸および塩化白金酸の添加量、還元剤の濃度、還元時間などの各種条件を変更することに適宜調節できる。還元剤の濃度は、第１段還元及び第２段還元の何れにおいても、溶媒全量に対して、０.０２〜０.５重量／容量％（以下、特に断らない限り、「％」は「重量／容量％（w/v%）」を意味する）とすることが好ましい。【００１７】第１段還元における塩化金酸の添加量は、溶媒全量に対して、０.００１〜０.０５％とすることが好ましい。第２段還元における塩化白金酸の添加量は、第１段還元で添加した塩化金酸１００重量部に対して、１００〜５００重量部とすることが好ましい。還元時間は、一般に、第１段還元及び第２段還元のそれぞれにおいて、添加された全ての金コロイド及び白金コロイドが還元される時間に設定することが好ましいが、これに限定されるものではない。【００１８】本発明の金属コロイド粒子は、通常の白金コロイド粒子と同様に、タンパク質に吸着して集積することにより黒色を呈するので、各種タンパク質の染色剤として使用でき、また、通常の金コロイド粒子と同様に、免疫学的測定用標識剤として用いることができる。本発明の金属コロイド粒子は、表面に白金が存在するため、パーオキシダーゼ活性など、高い酸化還元触媒活性を有する。したがって、酸化還元反応によって呈色する発色剤と本発明の金属コロイド粒子とを併用することによって、タンパク質を高感度で検出できる。かかる発色剤としては、硫酸銅などの銅（ＩＩ）イオンや、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）などが好適である。本発明の金属コロイド粒子は、ＴＭＢＺの存在下では濃厚な青色に変色し、また、酸化銅や硫酸銅などの銅（ＩＩ）イオンの存在下ではさらに濃厚な黒色を呈する。【００１９】本発明の金属コロイド粒子は、常法により抗原および抗体のそれぞれを標識することができ、イムノクロマト法やその他の各種免疫学的測定法に使用できる。また、このようにして標識された抗原および抗体は、イムノクロマト法測定キットやその他の各種免疫学的測定キットに組み込むことができる。【００２０】【実施例】実施例１［白金微粒子被覆金コロイド粒子の調製］（１）使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。（２）３９０ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液（水溶液１リットル当たり金として１ｇ、片山科学工業株式会社製）３０ｍｌを加え、その後、１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、６分４５秒後に、塩化白金酸水溶液（水溶液１リットル当たり白金として１ｇ、和光純薬工業株式会社製）３０ｍｌを加えた。塩化白金酸水溶液添加から５分後に１重量％クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、４時間、還流を行い、白金微粒子被覆金コロイド懸濁液を得た。（３）得られた白金微粒子被覆金コロイド懸濁液１ｍｌを１３８００×ｇで２５分間遠心分離を行い、遠心分離後、上清を除き、残った沈殿に超純水を０．５ｍｌ加え、攪拌後、超音波で沈殿を再懸濁せしめ、この懸濁液を２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液を得た。この再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイドの平均粒径を、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５００（（株）堀場製作所製）によって測定したところ、９０ナノメートル（ｎｍ）であった。【００２１】実施例２［白金−金コロイド標識抗体の調製］抗ヒトＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白、Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）マウス単クローン抗体（株式会社日本バイオテスト研究所製）の蛋白換算重量１μｇ（以下、抗体の重量を示すとき、その蛋白換算重量を示す）と、実施例１で得られた白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置して、この抗体の全量を該再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイド粒子（以下「白金−金コロイド粒子」と記す）と結合させた。【００２２】これに最終濃度が０．２％となるように１％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と記す）水溶液を加えて、上記抗体に結合せしめられた白金−金コロイド粒子の表面をブロックした。この懸濁液を５５３×ｇで２５分間遠心分離して、白金−金コロイド粒子の表面がＢＳＡでブロックされた白金−金コロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。この白金−金コロイド標識抗体を、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁して、精製白金−金コロイド標識抗体懸濁液を得た。【００２３】実施例３［イムノクロマト法テストストリップの作成］図１に示されるイムノクロマト法テストストリップを作成した。すなわち、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターをクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。該膜担体のクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、抗ヒトＣＲＰマウス単クローン抗体６．３ｍｇ／ｍｌを含有した抗体液０．５μｇをスポット状に塗布して、これを室温で乾燥して捕捉部位３１とした。この捕捉部位３１が発色を観察する判定ゾーンとされる。なお、この抗ヒトＣＲＰマウス単クローン抗体は、免疫反応において、抗原であるヒトＣＲＰに対する結合部位が、実施例２の白金−金コロイド標識抗体の調製に使用された抗体とは異なる抗体をいう。（２）また、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、実施例２で得られた精製白金−金コロイド標識抗体懸濁液３７．５ｌμｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて精製白金−金コロイド粒子標識抗体含浸部材２とした。【００２４】（３）次に、試料添加用部材である綿布５、上記の精製白金−金コロイド標識抗体含浸部材２、クロマト展開用膜担体３および吸収用部材４である帯状の濾紙のそれぞれを、図１に示されるように、帯状の粘着シート１の粘着面の所定位置に貼着してイムノクロマト法テストストリップとした。すなわち、このクロマト展開用膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図１の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図１の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、精製白金−金コロイド粒子標識抗体含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着し、該含浸部材２の上面に試料添加部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着した。さらに、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめて、イムノクロマト法テストストリップを得た。【００２５】比較例１［金コロイドの調製］（１）使用するガラス器具の全てを王水で洗浄するかまたはシリコンコーティングした。（２）９９ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸（片山科学工業株式会社製）水溶液（水溶液１リットル当たり金として５.８ｇ）１ｍｌを加え、さらにその１分後に、１重量％クエン酸ナトリウム水溶液１．５ｍｌを加え、５分間還流を行い、その後、室温に放置して冷却し、懸濁液を得た。次いで、この懸濁液を２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして金コロイド懸濁液を得た。【００２６】比較例２［金コロイド標識抗体の調製］白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液の代わりに比較例１の金コロイド懸濁液を用いた以外、実施例２と同様にして、金コロイド標識抗体を得た。【００２７】比較例３［イムノクロマト法テストストリップの作成］白金−金コロイド標識抗体の代わりに比較例２の金コロイド標識抗体を使用した以外、実施例３と同様にして、イムノクロマト法テストストリップを得た。【００２８】試験例１［イムノクロマト法による測定］実施例３及び比較例３で得られたイムノクロマト法テストストリップを使用して、抗原であるリコンビナントＣＲＰを測定した。すなわち、リコンビナントＣＲＰ（オリエンタル酵母工業株式会社製）を、０．２５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０．２５％ＢＳＡを含む０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と混合し、リコンビナントＣＲＰの濃度が１５．６、３１．３、６２．５、１２５および２５０ｐｇ（ピコグラム）／ｍｌの供試液を調製した。これらの供試液１００μｌを、上記のイムノクロマト法テストストリップの試料添加部材５上に滴下して膜担体３に展開せしめ、１５分後に捕捉部位３１の発色の濃度を肉眼で観察した。ブランクは０．２５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０．２５％ＢＳＡを含む０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とした。結果を表１に示す。発色濃度の判定は、下記４段階基準に従った。【００２９】＋＋：濃い黒色に発色、＋ ：黒色に発色、± ：薄い黒色に発色、− ：発色せず。【００３０】【表１】【００３１】表１の結果から、本発明の白金−金コロイド粒子で標識された抗体を使用した場合には、抗原であるリコンビナントＣＲＰを１５．６ｐｇ／ｍｌまで測定できるのに対し、金コロイド粒子で標識された抗体を使用した場合には抗原であるリコンビナントＣＲＰを２５０ｐｇ／ｍｌまでしか測定できないことが判る。したがって、本発明の白金−金コロイド粒子は、従来の金コロイド粒子よりも約１６倍の感度を有する。【００３２】試験例２［発色剤を併用したイムノクロマト法による測定］試験例１における展開後のイムノクロマト法テストストリップの捕捉部位３１に３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）（ペルオキシダーゼ用発色キットＳＴ（株式会社タウンズ製））を１μｌ加え、１０分間静置後に青色の発色の濃度を肉眼で観察した。発色の濃度の判定は、下記５段階基準に従った。【００３３】＋＋＋：非常に濃い青色に発色、＋＋：濃い青色に発色、＋ ：青色に発色、± ：薄い青色に発色、− ：発色せず。【００３４】【表２】【００３５】表２の結果から、白金−金コロイド粒子で標識された抗体とＴＭＢＺを併用した場合には、抗原であるリコンビナントＣＲＰを３．９１ｐｇ／ｍｌまで測定できることが示された。したがって、本発明の白金−金コロイド粒子に発色剤を併用することによって、従来の金コロイド粒子の約６０倍以上も感度を向上できる。【００３６】【発明の効果】本発明の金属コロイド粒子は、タンパク質染色剤および免疫学的測定用標識剤として有用であり、特に、イムノクロマト法の標識剤として用いた場合、従来の金コロイドの１０倍以上の感度が得られる。さらに、本発明の金属コロイド粒子は、白金同様の酸化還元触媒活性を有するので、酸化還元反応によって呈色する発色剤と併用することにより、従来の金コロイドの６０倍以上の感度が得られる。【図面の簡単な説明】【図１】ａは本発明によるイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたクロマト法テストストリップの縦断面図。【符号の説明】１ 粘着シート２ 標識抗体含浸部材３ クロマト展開用膜担体３１ 捕捉部位４ 吸収用部材５ 試料添加部材 金コロイド粒子の表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子。 金属コロイド粒子の平均粒径が５０〜１５０ナノメートルである請求項１に記載の金属コロイド粒子。 金コロイド粒子の平均粒径が３０〜１００ナノメートルである請求項１記載の金属コロイド粒子。 溶媒中にて塩化金酸を還元して金コロイド粒子を生成せしめた後、該金コロイド粒子の存在下で塩化白金酸を還元することを特徴とする金属コロイド粒子の製造方法。 請求項１に記載の金属コロイド粒子を含有するタンパク質染色剤。 請求項１に記載の金属コロイド粒子を含有する免疫学的測定用標識剤。 請求項１に記載の金属コロイド粒子によって標識された抗体または抗原。 請求項７に記載の抗体または抗原を備える免疫学的測定用キット。 請求項７に記載の抗体または抗原を使用することを特徴とする免疫学的測定法。 免疫学的測定がイムノクロマト法に基づくものである請求項８に記載の免疫学的測定用キット。 免疫学的測定法がイムノクロマト法である請求項９に記載の免疫学的測定法。