生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_染色標本の脱色方法および装置 |
| 出願番号： | 2001153639 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | G01N 33/48,G01N 1/36,G01N 1/28 |
特許情報キャッシュ
山本 茂子 永井 豊 JP 3899845 特許公報(B2) 20070112 2001153639 20010523 染色標本の脱色方法および装置 日本光電工業株式会社 000230962 本田 崇 100074147 山本 茂子 永井 豊 20070328 G01N 33/48 20060101AFI20070308BHJP G01N 1/36 20060101ALI20070308BHJP G01N 1/28 20060101ALI20070308BHJP JPG01N33/48 PG01N1/28 ZG01N1/28 J G01N 33/48 G01N 1/28 JSTPlus(JDream2) 特開平０７−０２７６８２（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−０２１４６８（ＪＰ，Ａ） 特開平０７−３３３１２３（ＪＰ，Ａ） 特開平０４−２９１１５７（ＪＰ，Ａ） 金井 泉、金井 正編著，臨床検査法提要，金原出版，１９９８年 ９月２０日，第３１版，第２８６頁〜２８９頁 渡辺 明朗，血液細胞はなぜ染め分けられるか，都臨技会誌，１９９２年 ４月２５日，Vol. 20、No. 3，p.2-8 8 2002350431 20021204 10 20040123 白形 由美子 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、血液塗抹標本などの生体組織染色標本を再染色するために脱色する脱色方法に関する。【０００２】【従来の技術】血液塗抹標本の代表的染色は、ロマノフスキー(Romanowsky)染色である。現在広く使われているライト（Wright）染色、ギムザ（Giemsa）染色、Pappenheim二重染色(May-Grunwald-Giemsa染色）などは、ロマノフスキー染色の改良法である。【０００３】ロマノフスキー染色法またはその改良法で用いられる色素には、メチレンブルー（塩基性色素）、エオジン（酸性色素）、メチレンブルーエオシネイト（中性色素）、のほか、アズールＢなどのメチレンブルーの酸化物（アルカリ性メチレンブルー溶液中で発生する）などがある。【０００４】メチレンブルーは、細胞内の酸性物質、例えば細胞内のＲＮＡと結合して青色に染める。【０００５】エオジンは、例えば赤血球のヘモグロビン、好酸球の好酸性顆粒（好酸球顆粒）などの塩基性物質と結合して赤に染める。【０００６】メチレンブルーエオシネイトは、水溶液中でメチレンブルーとエオジンに解離し、それぞれの色素として機能する他、中性顆粒などの特殊顆粒を赤褐色ないし紫紅色に染める。【０００７】アズールＢなどのメチレンブルーの酸化物は、核のＤＮＡ、細胞質のアズール顆粒と結合し、紫赤色（あずき色）に染める。【０００８】このような染色が行われた血液塗抹標本は、その染色が失敗の場合、再染色することはできず、新たに別の標本を染色して観察するようにしていた。【０００９】【発明が解決しようとする課題】染色の色合いは、染色液の種類、ロット番号、染色時の気温や湿度などによって変化するので、所望の染色結果が得られない場合がある。また、人為的ミスによっても所望の染色結果が得られないことになる。このような場合、細胞観察が困難になったり、観察不可能となる。【００１０】しかし、一度染色した塗抹標本は、染め直すことができなかったので、適切に染色されない場合には、正確な観察ができなくなり、採取が困難な貴重な標本であれば観察の機会が失われていた。【００１１】本発明は、このような従来技術に鑑みなされたもので、その目的は、染色した塗抹標本を脱色して、再度、染色ができるようにすることである。【００１２】【課題を解決するための手段】 本発明方法は、ロマノフスキー染色法またはその改良法により染色された標本の脱色方法であって、染色された標本をメタノールに浸漬する第１のステップを含む。これにより、例えばアズールＢまたはメチレンブルーなどのようにアルコールによく溶ける色素により染色された部分が脱色される。【００１３】 さらに、本発明方法は、上記第１のステップの後に、リン酸緩衝液とメタノールの混合液に前記標本を浸漬する第２のステップを含む。これにより例えばエオジンなどのように水溶性の色素により染色された部分が脱色される。さらに、本発明方法は、前記第２のステップの後に、前記標本をメタノールに浸漬するステップを含む。これにより、再染色が容易となる。【００１４】 本発明方法において、前記標本は、生体組織染色標本とし、染色された生体細胞核、血球細胞核、白血球核ＤＮＡ、血小板顆粒またはＲＮＡのうちいずれかが前記第１のステップの処理により脱色されていることを確認するステップ、またはアズールＢまたはメチレンブルーにより染色された標本部分が前記第１のステップにより脱色されていることを確認するステップを含む。これにより、前記第１のステップの後の処理を確実に行うことができる。【００１５】 また、本発明方法において、前記標本は、生体組織染色標本であり、好酸球顆粒が前記第２のステップの処理により脱色されていることを確認するステップ、または、エオジンにより染色された標本部分が前記第２のステップの処理により脱色されていることを確認するステップを含む。これにより、前記第２のステップの後の処理を確実に行うことができる。【００１６】また、本発明方法において、前記混合液は、リン酸緩衝液とメタノールの比が１：３から１：４の範囲とすれば、好適な処理結果が得られる。【００１９】 また、本発明装置は、ロマノフスキー染色法またはその改良法により染色された標本の脱色装置であって、メタノールを収容する第１の槽と、リン酸緩衝液とメタノールの混合液を収容する第２の槽と、メタノールを収容する第３の槽と、前記標本を前記第１の槽に浸漬した後、前記第１の槽から取り出し、前記第２の槽に浸漬した後、前記第２の槽から取り出し、前記第３の槽に浸漬した後、前記第３の槽から取り出す標本搬送手段と、この標本搬送手段が前記標本を各槽に浸漬する時間を制御する制御手段とを有する。 この構成によれば、前記標本を第１の槽に浸漬することにより、アズールＢまたはメチレンブルーなどアルコールによく溶ける色素により染色された部分が脱色され、前記標本を第２の槽に浸漬することにより、エオジンなど水溶性の色素により染色された部分が脱色される。 また、リン酸緩衝液とメタノールの前記混合液は、リン酸緩衝液とメタノールの比が１：３から１：４の範囲にした。このようにすれば、脱色後、鮮明に染色でき、かつ血液細胞の形態変化を抑えることができる。【００２０】【発明の実施の形態】本発明の脱色方法の実施の形態を説明する。ロマノフスキー染色法またはその改良法で染色された血液塗抹標本をメタノールを収容した槽に浸漬し、上下に振動させる。メタノール液に色がついてきたなら新しい液と交換し、これに血液塗抹標本を浸漬し、上下振動させるという同様の処理を繰り返す。ここで例えば、メタノール槽は５分おきにメタノールを交換し、メタノール槽には全部で２０分間浸漬する。全部の浸漬時間は、塗抹標本が染色されてからの経過時間によるが、染色直後であれば、全体で１０〜１５分程度、１ケ月経過であれば全体で３０分程度が必要である。この処理により、例えばアズールＢまたはメチレンブルーなど、アルコールによく溶ける性質の色素により染色された標本部分が脱色される。なお、上記メタノールは、純度９９．９％の特級メタノールが好適である。【００２１】メタノールに色がつかなくなったとき、顕微鏡下で、脱色を確認する。ここで確認されるのは、血球細胞核、白血球核ＤＮＡ、血小板顆粒またはＲＮＡなどの脱色である。一例を挙げると、図１に示すように染色された血液塗抹標本は、この処理により図２に示すようになることが確認される。ここで、図１に示す球体の大部分は赤血球である。赤血球は全体にヘモグロビンの赤色となっている。図１の中央部あたりにある大きめの球体が好酸球（記号Ａで示す）である。その好酸球は全体に好酸球顆粒のオレンジ色であり、その中に紫赤色の核（記号ａで示す）がある。好酸球を例にとると、このメタノール脱色処理により、図２に示すように、核のみが脱色される。図３はメタノール脱色処理後のリンパ球を含む標本を示したものである。図３の中央部あたりにリンパ球は存在するが、リンパ球の核およびＲＮＡを含む細胞質が脱色され、リンパ球全体は見えない状態となっている。ここでも脱色されずに残っている球体は赤血球である。【００２２】次に、血液塗抹標本をリン酸緩衝液とメタノール液が１：３〜１：４の割合で調合された混合液を収容した槽に入れる。混合液をこの割合としたのは、鮮明に染色でき、かつ血液細胞の形態変化を抑えるためである。そして、この槽の中において、血液塗抹標本を上下に振動させる。ここで例えば、混合液槽には５分間浸漬する。この浸漬時間も塗抹標本が染色されてからの経過時間により調節すると効率良く脱色を行うことができる。この浸漬処理により、例えばエオジンなどの水溶性の色素により染色された標本部分が脱色される。この処理の後、顕微鏡下で、脱色を確認する。ここで確認されるのは、赤血球のヘモグロビン、好酸球顆粒などの脱色である。上記の図２の例で言えば、赤血球全体および好酸球全体が脱色され、すべての血液構成要素が脱色されていることが確認される。また上記の図３の例で言えば、残っていた赤血球が脱色され、すべての血液構成要素が脱色されていることが確認される。【００２３】次にメタノールに塗抹標本を１分程度浸漬する。この処理により、塗抹標本は固定される。ここで、メタノールは、脱色に用いたと同様の純度９９．９％の特級メタノールが好適である。【００２４】次に、脱色した塗抹標本に対し染色を再度行う。この染色は、通常行われている従来の染色、すなわちロマノフスキー染色法またはその改良法による染色で良いので、説明を省略する。【００２５】次に、本発明による脱色装置について説明する。図４にその全体構成を示す。この図に示すように、標本収容部１には、血液塗抹標本２が複数枚収容されている。血液塗抹標本２は、スライドガラスに塗抹された血液にロマノフスキー染色法またはその改良法による染色がなされたものである。【００２６】標本収容部１に隣接してメタノール槽３が設けられている。メタノール槽３は４つの槽から成り、それぞれの槽３ａ〜３ｄにメタノールが収容されている。ここでメタノールは、上記方法の説明で用いたメタノールと同様のものである。【００２７】メタノール槽３に隣接して混合液槽４が設けられている。混合液槽４は、リン酸緩衝液とメタノール液の混合液を収容した槽である。この混合液は、上記方法の説明で用いた混合液と同様のものである。【００２８】混合液槽４に隣接してメタノール槽５が設けられている。このメタノール槽５に収容されるメタノールは、上記メタノール槽３に収容されるものと同様のものである。【００２９】さらに、本装置は、標本収容部１、メタノール槽３、混合液槽４およびメタノール槽５の上部を移動可能に保持されたアーム６ａを備えた搬送部６を備えている。搬送部６は、制御部７により制御され、アーム６ａを水平移動、垂直移動させることにより、血液塗抹標本２を、標本収容部１から取り出し、以後、メタノール槽３ａ〜３ｄ、混合液槽４、メタノール槽５の順に浸漬、取り出しを行うものである。【００３０】本装置において、メタノール槽３が第１の槽であり、混合液槽４が第２の槽であり、搬送部６が第１の標本搬送手段であり、制御部７が第１の制御手段である。【００３１】このように、構成された装置の動作を説明する。制御部７により制御される搬送部６は、アーム６ａを移動させて、まず標本収容部１から複数の血液塗抹標本２を取り出し、これらをメタノール槽３ａ〜３ｄに対し順次、浸漬、取り出しを行う。ここでメタノール槽３ａ〜３ｄに浸漬される時間はそれぞれ５分間であり、全体で２０分間となっている。この処理により、アズールＢまたはメチレンブルーなどにより染色された標本部分が脱色される。すなわち、血球細胞核、白血球核ＤＮＡ、血小板顆粒またはＲＮＡなどが脱色される。【００３２】次に搬送部６は、アーム６ａを移動させて、血液塗抹標本２を混合液槽４に５分間浸漬して取り出す。この処理によりエオジンなどにより染色された部分が脱色される。すなわち、赤血球のヘモグロビン、好酸球顆粒などが脱色される。【００３３】次に搬送部６は、アーム６ａを移動させて、血液塗抹標本２をメタノール槽５に所定時間（例えば１分程度）浸漬して取り出す。この処理により血液塗抹標本２の血液構成要素は固定され、以後の染色に備えられる。【００３４】なお、上記の動作において、血液塗抹標本２が各槽に浸漬されている間、アーム６ａを上下振動させる機能を搬送部６に備えるならば、脱色がより効果的に行われる。【００３５】また、連続して次の血液塗抹標本２を脱色する場合には、その脱色処理の前に、前回使用した各槽のメタノールや混合液を新しいものに取り替える必要がある。この取り替えのために、各槽に液体を排出する排出手段と、該当する液体を各槽にそれぞれ供給する供給手段を設け、全脱色処理が１回終る毎に、各槽の液体排出、供給を行わせるよう制御すれば、自動的に液体の取り替えを行うことができる。【００３６】このような、排出手段と、供給手段と、これらを制御する制御手段を備えた場合、メタノール脱色処理のためのメタノール槽は１つで良い。【００３７】このような装置の例を図５に示す。この図において、標本収容部１１には、血液塗抹標本２が複数枚収容されている。標本収容部１１に隣接してメタノール槽１３が設けられている。【００３８】メタノール槽１３に隣接して混合液槽１４が設けられている。混合液槽１４に隣接してメタノール槽１５が設けられている。【００３９】さらに、本装置は、標本収容部１１、メタノール槽１３、混合液槽１４およびメタノール槽１５の上部を移動可能に保持されたアーム２０ａを備えた搬送部２０を備えている。搬送部２０は、制御部２１により制御され、アーム２０ａを水平、垂直移動させることにより、血液塗抹標本２を、標本収容部１１から取り出し、以後、メタノール槽１３、混合液槽１４、メタノール槽１５の順に収納、取り出しを行うものである。【００４０】さらに、本装置は、メタノール槽１３にメタノールを供給するメタノール供給手段１６と、混合液槽１４に混合液を供給する混合液供給手段１７と、メタノール槽１５にメタノールを供給するメタノール供給手段１８と、各槽に収容された液体を選択的に排出させる排出手段１９を備えている。制御部２１は、搬送部２０を制御する他、メタノール供給手段１６、混合液供給手段１７、メタノール供給手段１８および排出手段１９を制御する。【００４１】本装置において、メタノール槽１３が第１の槽であり、混合液槽１４が第２の槽であり、搬送部２０が第２の標本搬送手段であり、制御部２１が第２の制御手段である。【００４２】次に、このように構成された装置の動作を説明する。まず、制御部２１は、メタノール供給手段１６、混合液供給手段１７、メタノール供給手段１８を制御して、メタノール槽１３にメタノールを、混合液槽１４に混合液を、メタノール槽１５にメタノールをそれぞれ供給する。ここでメタノールおよび混合液は図４に示した装置で用いたものと同様である。【００４３】次に搬送部２０は、アーム２０ａを移動させて、血液塗抹標本２を標本収容部１１から取り出し、メタノール槽１３に所定時間浸漬する。そして制御部２１は、排出手段１９を制御してメタノール槽１３に収容された使用済みのメタノールを排出させ、次にメタノール供給手段１６を制御して、メタノール槽１３に新たなメタノールを供給する。このため血液塗抹標本２は再度、メタノールに浸漬される。制御部２１は、この浸漬を所定時間（例えば５分間）行わせた後、排出手段１９を制御して使用済みのメタノールをメタノール槽１３から排出させ、次にメタノール供給手段１６を制御して、メタノール槽１３に新たなメタノールを供給する。このように、制御部２１は、血液塗抹標本２をメタノール槽１３に浸漬し、その使用済みのメタノールを排出させることを所定回数（例えば４回）行わせる。この処理により、アズールＢまたはメチレンブルーなどにより染色された標本部分が脱色される。【００４４】次に制御部２１は、搬送部２０のアーム２０ａを移動させて、血液塗抹標本２をメタノール槽１３から取り出し、血液塗抹標本２を混合液槽１４に所定時間（例えば５分間）浸漬し、その後取り出す。この処理によりエオジンなどにより染色された標本部分が脱色される。【００４５】次に制御部２１は、搬送部２０のアーム２０ａを移動させて、血液塗抹標本２をメタノール槽１５に所定時間（例えば１分間程度）浸漬して取り出す。この処理により血液塗抹標本２の血液構成要素は固定され、以後の染色に備えられる。そして制御部２１は、搬送部２０のアーム２０ａを移動させて脱色済みの血液塗抹標本２を図示せぬ脱色済み標本収容部に収容する。【００４６】次に、制御部２１は、排出手段１９を制御して各槽に収容された使用済みの液体を排出させると共に、搬送部２０のアーム２０ａを標本収容部１１の上部まで移動させて、停止させる。そして制御部２１は、各槽に該当する液体をそれぞれ供給するという最初の処理に戻り、各部に以上の動作を繰り返し行なわせる。この動作は、標本収容部１１に血液塗抹標本２がなくなるまで行わせる。【００４７】なお、上記の動作において、血液塗抹標本２が各槽に浸漬されている間、アーム２０ａを上下振動させる機能を搬送部２０が備えるならば、脱色がより効果的に行われる。【００４８】このように、メタノール脱色処理に用いるメタノール槽を１つとすれば、装置の小型化を図ることができる。【００４９】なお、以上は、メタノール脱色処理と、混合液脱色処理と、脱色した標本を固定するための固定処理とを全て行う場合に用いる装置の例である。【００５０】これに対し、メタノール脱色処理のみで良い場合には、その装置としては、例えば図４の装置において、制御部７の制御により、メタノール槽３を用いたメタノール脱色処理を行わせた後の処理、すなわち混合液脱色処理およびメタノール固定処理が省略されるような構成としても良い。また、例えば図５の装置において、制御部２１により、メタノール槽１３を用いたメタノール脱色処理を行わせた後の処理、すなわち混合液脱色処理およびメタノール固定処理が省略されるような構成としても良い。【００５１】また、このようなメタノール脱色処理のみで良い場合には、専用の装置を用いても良い。その専用装置としては、例えば、図４の装置において、混合液槽４とメタノール槽５を設けず、搬送部６が血液塗抹２を標本収容部１からメタノール槽３まで搬送し、メタノール槽３で浸漬処理するまでを行うもので良い。【００５２】なお、図４および図５に示した装置において、血液塗抹標本の染色の濃度を検出する検出手段を設け、その濃度によって、脱色処理（メタノール脱色処理および／または混合液脱色処理）における浸漬時間を決定する。すなわち、濃い場合には長い時間に、薄い場合には短い時間に決定する。そして、その決定した時間、血液塗抹標本を浸漬するようにしても良い。【００５３】以上は、標本を血液塗抹標本としたが、ロマノフスキー染色法またはその改良法で染色された塗抹標本であれば良く、血液標本に限定されない。例えば、一般の生体細胞核を含むような標本でも良い。生体細胞核はメタノール脱色処理で脱色される。【００５４】【発明の効果】本発明によれば、染色に失敗した塗抹標本の再染色が可能になる。このため採取が困難な貴重な標本であっても１つで何度も観察の機会が得られるという効果がある。また、検査によっては、複数の塗抹標本をそれぞれ異なる染色方法で染めて観察する場合がある。このような場合、本発明によれば、１枚の塗抹標本を繰り返し使用できるようになるため、患者から採取する検体量を軽減させることができる。【図面の簡単な説明】【図１】染色された血液塗抹標本の一例を示す図。【図２】本発明方法のメタノール脱色処理によって、好酸球の核が脱色されたことを示す図。【図３】本発明方法のメタノール脱色処理によって、リンパ球全体が脱色されたことを示す図。【図４】本発明装置の一例を示す構成図。【図５】本発明装置の他の例を示す構成図。【符号の説明】１、１１ 標本収容部３、５、１３、１５ メタノール槽４、４１４混合液槽６、２０ 搬送部７、２１ 制御部 ロマノフスキー染色法またはその改良法により染色された標本の脱色方法であって、 染色された標本をメタノールに浸漬する第１のステップと、 この第１のステップの後に、リン酸緩衝液とメタノールの混合液に前記標本を浸漬する第２のステップと、 この第２のステップの後に、前記標本をメタノールに浸漬する第３のステップを含むことを特徴とする染色標本の脱色方法。 リン酸緩衝液とメタノールの前記混合液は、リン酸緩衝液とメタノールの比が１：３から１：４の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の染色標本の脱色方法。 請求項１または２に記載の染色標本の脱色方法であって、 前記標本は、生体組織染色標本であり、 染色された生体細胞核、血球細胞核、白血球核ＤＮＡ、血小板顆粒またはＲＮＡのうちいずれかが前記第１のステップの処理により脱色されていることを確認するステップを含むことを特徴とする染色標本の脱色方法。 請求項１または２に記載の染色標本の脱色方法であって、 アズールＢまたはメチレンブルーにより染色された標本部分が前記第１のステップにより脱色されていることを確認するステップを含むことを特徴とする染色標本の脱色方法。 請求項１または２に記載の染色標本の脱色方法であって、 前記標本は、生体組織染色標本であり、 好酸球顆粒が前記第２のステップの処理により脱色されていることを確認するステップを含むことを特徴とする染色標本の脱色方法。 請求項１または２に記載の染色標本の脱色方法であって、 エオジンにより染色された標本部分が前記第２のステップの処理により脱色されていることを確認するステップを含むことを特徴とする染色標本の脱色方法。 ロマノフスキー染色法またはその改良法により染色された標本の脱色装置であって、 メタノールを収容する第１の槽と、 リン酸緩衝液とメタノールの混合液を収容する第２の槽と、 メタノールを収容する第３の槽と、 前記標本を前記第１の槽に浸漬した後、前記第１の槽から取り出し、前記第２の槽に浸漬した後、前記第２の槽から取り出し、前記第３の槽に浸漬した後、前記第３の槽から取り出す標本搬送手段と、 この標本搬送手段が前記標本を各槽に浸漬する時間を制御する制御手段とを有することを特徴とする染色標本の脱色装置。 リン酸緩衝液とメタノールの前記混合液は、リン酸緩衝液とメタノールの比が１：３から１：４の範囲であることを特徴とする請求項７に記載の染色標本の脱色装置。