生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_ラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いるキット |
| 出願番号： | 2001108286 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | G01N 33/543,G01N 33/53 |
特許情報キャッシュ
三浦 俊英 松浦 斎 遠藤 光二 片山 勝博 JP 4507439 特許公報(B2) 20100514 2001108286 20010406 ラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いるキット 日東紡績株式会社 000003975 浅村 皓 100066692 浅村 肇 100072040 長沼 暉夫 100088926 池田 幸弘 100102897 三浦 俊英 松浦 斎 遠藤 光二 片山 勝博 20100721 G01N 33/543 20060101AFI20100701BHJP G01N 33/53 20060101ALI20100701BHJP JPG01N33/543 581DG01N33/53 X G01N 33/48-33/98 特開２００１−２８９８５０（ＪＰ，Ａ） 特開平０１−２５３６５４（ＪＰ，Ａ） 特開昭６１−２１３６７３（ＪＰ，Ａ） 特開２０００−１６２２１２（ＪＰ，Ａ） 2 2002303630 20021018 7 20080117 廣田 健介 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、ラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いるキットに関する。更に詳細には、検体中のＣ反応性蛋白質（以下ＣＲＰと記載することもある）などの抗原を、検体中のリウマチ因子（以下ＲＦと記載することもある）などの影響を受けることなく、特異的に測定することのできるラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いる保存安定性に優れたキットに関する。【０００２】【従来の技術】免疫学的測定法の一つであるラテックス免疫比濁測定法は、測定対象である抗原を含有する検体と、該抗原に対する抗体を感作したラテックス粒子とを混合して抗原抗体反応を行い、生成した免疫凝集物の量を、得られた反応液の濁度を測定することにより求め、その測定値から検体中の抗原量を測定する方法である。ラテックス免疫比濁測定法は簡便な方法により検体中の抗原を高感度で高精度に測定できるため、従来より臨床検査や実験室での免疫学的研究に広く用いられてきた。しかしながら、ラテックス免疫比濁測定法の対象となる血清などの検体中には、ヒトの個体特性、採取条件等により、生体成分であるＲＦ等が混在しており、ラテックス免疫比濁測定法により得られる測定値に誤差を生じるという問題がある。これら検体中のＲＦなどによる非特異的反応の影響を解消、軽減する種々の手法が検討されている。ＲＦは、自己抗体であり、変性ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して反応することが知られている。ＲＦは、ヒト検体中のＲＦの濃度等の条件により、ヒトとは異なる種類の動物から得た、検体中の抗原を測定するための試薬の構成成分の一つである抗体に対して反応する場合があり、これが、ラテックス免疫比濁測定法による臨床検査において非特異的反応の要因となる。こうしたＲＦによる測定時の非特異的反応を回避するため、測定の前に血清などの検体中の内因性のＲＦを不活性化するか又は除去する等の前処理が通常必要で、この前処理をしなければ測定の結果は著しい誤差を生じる場合がある。【０００３】【発明が解決しようとする課題】特開昭５４−１１９２９２号公報には、ＲＦによる非特異的反応を回避するために、検体中の抗原を測定するための試薬の構成成分の一つである異種抗体分子のＦｃ部分を酵素反応で取り除いたＦ（ａｂ′）２分子を、抗体として用いる免疫測定法が開示されている。しかしながら、このような免疫測定法は、酵素反応、精製等の試薬調製のための煩雑な工程を必要とするため、コストアップ、製造ロット間差につながるなどの欠点がある。また、特開平８−８６７８３号公報には、免疫比濁測定法において、スレオ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオール（ＤＴＴ）を使用して非特異的反応を低下させることが開示されている。しかしながら、この免疫比濁測定法をそのままラテックス免疫比濁測定法に適用した場合には、測定試薬の保存安定性に問題があり、改良が必要である。従って、本発明の目的は、検体中のＣＲＰなどの抗原を、検体中のＲＦなどの影響を受けることなく、特異的に測定することのできるラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いる保存安定性に優れたキットを提供することにある。【０００４】【課題を解決するための手段】本発明者は、ＲＦなどの影響を受けることなく、検体中のＣＲＰなどの抗原を特異的に測定することのできるラテックス免疫比濁測定法及びそれに用いる保存安定性に優れたキットを得ることを目的として鋭意研究した結果、測定対象である検体中の抗原と該抗原に対する抗体とを反応させる前に、あらかじめチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混合することにより、ラテックス免疫比濁測定法による検体中の抗原の特異的な測定が可能となり、また、測定試薬の構成成分の一つとしてチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを用いることにより、保存安定性に優れたキットが得られることを見出し、本発明を完成させた。【０００５】従って、本発明は、検体中の抗原を測定するラテックス免疫比濁測定法において、検体とチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混合し、次いで、検体中の抗原と該抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子とを反応させることを特徴とするラテックス免疫比濁測定法である。更に本発明は、検体中の抗原をラテックス免疫比濁測定法により測定するためのキットであって、ｉ）チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを必須成分として含む試薬、及びｉｉ）検体中の抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子を必須成分として含む試薬からなるキットである。【０００６】【発明の実施の形態】本発明で対象とする検体としては、ヒトの血液、血清、血漿などが挙げられ、特に血清が検体として望ましい。本発明で測定する検体中の抗原としては、特に限定されず、従来から免疫測定法で測定され得る抗原のいずれも測定可能である。このような抗原としては、例えば、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、ヒトアルブミン等の高分子量蛋白質や、薬物、ペプチド等の低分子量の抗原性物質等が挙げられる。例えば、ＣＲＰは、急性炎症あるいは急性の組織崩壊で増加する急性期蛋白の一種で代表的な炎症マーカーである。そのため、ＣＲＰの定量は、炎症・組織障害を起こす種々の疾患の活動性、重症度、経過をみる際に不可欠である。したがって、病院、臨床検査センター等において、ＣＲＰはルーチンで測定されている。このような検体中の抗原と抗原抗体反応させるための抗体は、通常これらの抗原で動物を公知の方法により免疫して得られる動物由来の抗体である。動物としては、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、マウス、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられ、抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、これら抗体の抗原結合性断片などが挙げられる。このような抗体で感作させるラテックス粒子としては特に限定されず、例えば、有機高分子化合物の微粒子が挙げられる。かかる有機高分子化合物としては、例えば、ポリスチレン、スチレンースチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルーブタジエンースチレン共重合体、塩化ビニルーアクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルーアクリレート共重合体等の重合体などが挙げられる。特にこれらの重合体の微粒子を均一に懸濁したラテックス等が好適に用いられる。ラテックス粒子の平均粒径は、検体中の抗原の測定方法、測定濃度又は測定機器等によって適宜選択されるが、通常０．０５−１．０μｍであり、なかでも０．０５−０．５μｍが好ましい。上記抗体を上記ラテックス粒子に感作させるには、通常の化学結合又は物理吸着が適用できる。【０００７】本発明のラテックス免疫比濁測定法においては、測定しようとする抗原を含む検体中とチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混合し、次いで、検体中の抗原と該抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子とを反応させる。ここで用いるチオグリコール酸の塩としては、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリコール酸カリウムなどが挙げられる。チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールの添加量は、好ましくは、検体１μｌ当たり０．５〜５０μｍoｌ量、更に好ましくは、１〜２５μｍoｌ量である。このとき検体１μｌに対し、チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを含む溶液の添加量は、好ましくは、１０〜５００μｌ、更に好ましくは、２０〜２００μｌである。なお、検体１μｌ当たり０．５〜５０μｍoｌ量あるいは１〜２５μｍoｌ量でＤＴＴ（スレオ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオール）を添加した場合には、検体中の蛋白質の非特異的凝集が起こりやすいが、本発明で用いるチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールの場合には、このような添加量でも非特異的凝集は起こりにくい。検体に、チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを添加後、数分間撹拌あるいは放置し、その後、抗体を感作させたラテックス粒子を加えて抗原抗体反応を行う。反応は、通常トリス緩衝液、へぺス緩衝液などのグッド緩衝液中でｐＨ４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０の範囲、０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の範囲で行う。反応後、反応液の濁度を、吸光度、散乱光度、分子数などを測定する光学的測定法により測定する。測定波長は、通常２００〜１０００ｎｍの範囲が使用される。実際の測定には２ポイントアッセイ法などを適用することができる。得られる実際の光学的測定値から、抗原濃度が既知の標準検体を用いて作成した検量線に基づいて、検体中の抗原濃度を測定することができる。【０００８】本発明のラテックス免疫比濁測定法により測定するためのキットは、チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを必須成分として含む試薬（第１試薬）、及び検体中の抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子を必須成分として含む試薬（第２試薬）からなる。第１試薬や第２試薬には、どちらにもトリス緩衝液、へぺス緩衝液等のグッド緩衝剤が含まれていて良い。更に通常測定試薬に添加される添加物、例えば、食塩等の塩、防腐剤、ＢＳＡ、デキストラン、香料等を添加しても良い。【０００９】【実施例】以下、実施例に従って本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等限定されるものではない。実施例１−６及び比較例１−３Ａ）測定検体１）ＲＦ添加血清ＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ、ＲＦ濃度０の血清はＣＲＰ２ｍｇ／ｄｌ血清と生理食塩水を１対１で混合したものを用いた。ＣＲＰ濃度１ｍｇ／ｄｌ、ＲＦ濃度１５００ＩＵ／ｍＬ及び３０００ＩＵ／ｍｌのＲＦ添加血清は、ＣＲＰ２ｍｇ／ｄｌ血清とＲＦ高値血清を硫安分画し濃縮して調製したＲＦ濃度が３０００ＩＵ／ｍｌ及び６０００ＩＵ／ｍｌのＲＦ高濃度試料を１対１で混合し作成した。２）ＣＲＰ高値血清３０ｍｇ／ｄｌの濃度の標準液（ＣＲＰ多点検量線用標準液２ｍｌ×６濃度、ニットーボーメディカル）をそのまま使用した。【００１０】Ｂ）測定用試薬１）第１試薬本発明の実施例の測定には、ＣＲＰ測定用試薬の第１試薬として表１に示す組成の溶液を調製した。【００１１】２）第２試薬抗ヒトＣＲＰヤギ抗体を感作したラテックス粒子を含むＮ−アッセイ ＬＡ ＣＲＰ−Ｓニットーボー（ニットーボーメディカル）のラテックス試薬をそのまま使用した。Ｃ）測定測定は日立７１５０自動分析装置を使用した。日立７１５０自動分析装置の３７℃の反応セル中に、検体を３μｌ及び第１試薬１５０ｍｌを入れ、第１試薬の添加５分後に第２試薬１５０μｌを添加し、５分間、抗原抗体反応をさせた。そして、装置内の演算機構により２ポイントアッセイを行い、検体ブランクを除いた主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにおける反応前後の吸光度変化量を測定した。ＣＲＰ既知濃度のキャリブレーターの測定から得られた標準曲線から、検体中のＣＲＰの濃度を求めた。【００１２】測定例１ＲＦ添加試料のＣＲＰ濃度の測定ＲＦの添加量を変えて、既知のＣＲＰ濃度が正確に測定できるかどうか検討した。測定結果を表２に示した。表２に示した結果から分かるように、ＣＲＰ測定値がＲＦ濃度０の時のＣＲＰ測定値に近いほどＲＦの影響を受けていないことから、比較例１に比べ、実施例１と２では、殆どＲＦの影響がない。【００１３】測定例２試薬の安定性（ＲＦ回避能の変化）日立７１５０自動分析装置の試薬保冷庫に、各組成の第１試薬を開封したまま放置し、０、２８、５６日目にＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ、ＲＦ３０００ＩＵ／ｍｌのＲＦ高値血清を測定し、本発明の試薬のＲＦの影響回避能の変化を検討した。結果を表３に示した。【００１４】表３の結果から分かるように、５６日目で実施例３、４は、比較例２に比べＲＦの影響が少なく、比較例２よりＲＦの影響回避能が長期間持続する組成であるといえる。測定例３ 試薬の安定性（反応性の比較）測定例２と同様に保存した試薬の０、２８、５６日目のＣＲＰ３０ｍｇ／ｄｌの検体を測定し、ＣＲＰに対する反応性の安定性を比較した。この測定では０日目の標準曲線を２８，５６日目でも使用し、測定値を算出した。結果を表４に示した。【００１５】表４に示した結果から分かるように、５６日目で実施例５、６は、比較例３に比べ測定値の低下が少なく、安定な組成であるといえる。【００１６】【発明の効果】以上に詳細に述べた通り、本発明のラテックス免疫比濁測定法により、検体中のＣＲＰなどの抗原を、検体中のＲＦなどの影響を受けることなく、特異的に測定することができる。また、本発明のラテックス免疫比濁測定法用キットは、保存安定性に優れたものである。 検体中の抗原を測定するラテックス免疫比濁測定法において、検体とチオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを混合し、次いで、検体中の抗原と該抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子とを反応させることを特徴とするラテックス免疫比濁測定法。 検体中の抗原を請求項１に記載のラテックス免疫比濁測定法により、検体中のリウマチ因子の影響を受けることなく、測定するためのキットであって、 ｉ）チオグリコール酸もしくはその塩又はチオグリセロールを必須成分として含む試薬、及び ｉｉ）検体中の抗原に対する抗体を感作させたラテックス粒子を必須成分として含む試薬からなるキット。