生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_シクロプロピル基導入塩基を含有したＤＮＡ |
| 出願番号： | 2001072393 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C07H19/173,C12N15/09 |
特許情報キャッシュ
齋藤 烈 中谷 和彦 堂野 主税 小川 敦司 JP 3681338 特許公報(B2) 20050527 2001072393 20010314 シクロプロピル基導入塩基を含有したＤＮＡ 独立行政法人科学技術振興機構 503360115 野口 繁雄 100085464 齋藤 烈 中谷 和彦 堂野 主税 小川 敦司 20050810 7 C07H19/173 C12N15/09 JP C07H19/173 C12N15/00 A 7 C07H CA(STN) REGISTRY(STN) 特開昭62−252726（ＪＰ，Ａ） 特表平6−505156（ＪＰ，Ａ） BIOCHEMICAL JOURNAL, 2000，Vol.351, No,2,，pages 319-326 CHEMICAL ABSTRACTS 131:228917 (1999) 3 2002275193 20020925 10 20010314 伊藤 幸司 【０００１】【発明の属する技術分野】 本発明はＤＮＡに関するものである。【０００２】【従来の技術】 ＤＮＡの酸化損傷は、細胞の老化や癌化に密接に関係している。ＤＮＡの酸化はＤＮＡを構成する核酸塩基のうち最も酸化されやすいグアニン塩基で酸化損傷が起きやすい。また。最近の研究から、酸化損傷は最初に酸化されたグアニンだけでなく、距離的に離れた場所に位置するグアニンへ酸化損傷が伝搬することが分かってきた。【０００３】 ＤＮＡが電子移動の良い媒体となり得るかどうかについて、ここ１０年世界の第一線の研究グループにより活発に研究されてきた。電子移動の機構については研究者の間で未だ十分な合意が得られていないものの、ＤＮＡはある程度の効率で電子を通す媒体であることが多くの実験結果から示されている。当初ＤＮＡが一電子酸化されることにより生じたホールは、ＤＮＡの隅から隅まで瞬時に非局在化するという機構が提唱されていたが、最近の研究結果から、ＤＮＡ塩基の中で最も酸化されやすいグアニン（Ｇ）塩基上にまずホール（Ｇラジカルカチオン）が形成され、その生じたホールがＤＮＡの中を、Ｇを飛び石伝いに移動する「Ｇホッピング」機構が有力となっている。またごく最近では、酸化力の強い酸化剤を用いた場合には、Ｇだけでなくアデニン（Ａ）塩基が、ホールホッピングのジャンプ台となっているのではないかと推測されている。【０００４】 単独のＧよりも低い酸化電位を有する連続Ｇ配列（ＧＧ，ＧＧＧ）や8-oxo-Ｇをはじめとする修飾塩基を含むＤＮＡ中でホール移動を行なうと、ホール（ラジカルカチオン）はこれらの部位で高効率で捕捉される。これらは熱力学的要因によるものであり、ＤＮＡ内ホール移動速度を制御する因子として詳しく調べられてきた。【０００５】 ＤＮＡ上に生成したＧラジカルカチオンのたどる運命は大きく、１）ラジカルアニオンからの逆電子移動により消滅する、２）脱プロトン化の後、酸素や水と反応して分解に至る（トラップされる）、そして３）ホールホッピングによりＧに再生するのいずれかに絞られる。従って、ＤＮＡ上で効率よくホール移動が進行するためには、１）、２）の過程によりホールがトラップされる速度に比べて、ホール移動速度が十分速くなければならない。【０００６】 ホール移動速度は、ホールドナーとホールアクセプターのポテンシャルエネルギー差を大きくすることにより、速くすることが可能である。しかし、ホールがトラップされる速度を変化させる手法は、今日まで報告されていない。極めて早い、もしくは遅いホールトラップ速度を持つ人工ヌクレオシドは、ＤＮＡ上でのホール移動機構の解明に大きく寄与することが期待される。【０００７】【発明が解決しようとする課題】 ＤＮＡの酸化損傷の伝搬を防止するためには、酸化損傷が伝搬する前に、直ちに無害化してしまう方法が有効であるが、そのような方法は現在まで知られていない。 そこで、本発明は酸化損傷の伝播を食いとめる部位をもったＤＮＡを提供することを目的とするものである。【０００８】【課題を解決するための手段】 シクロプロピル基導入塩基の一例は、グアニンのＮ2位又は８位にシクロプロピル基を導入したものである。 一例として、Ｎ2-シクロプロピルグアニンが結合したＮ2-シクロプロピル−２'−デオキシグアノシン（ｃｐＧ）を図１に示す。Ｎ2-シクロプロピル−２'−デオキシグアノシンを、リボフラビン存在下で３１２ｎｍの光を照射して一電子酸化すると、主生成物として２'−デオキシグアノシンが得られた。また、Ｎ2-シクロプロピル−２'−デオキシグアノシンと同等の酸化電位をもつＮ2-メチル−２'−デオキシグアノシンは同条件下では酸化されなかった。このことから、図２に示されるように、Ｎ2-シクロプロピルグアニン上に発生したラジカルカチオンは、Ｎ2位のシクロプロパン環の速やかな開環反応により直ちに消費され、開環生成物を与えるものと考えられる。 シクロプロピル基の導入位置が８位である8-シクロプロピルグアニンについても同様の反応が起こる。【０００９】 ＤＮＡの四種塩基中でＧに次いで酸化電位の低いアデニンについてもシクロプロピル基を導入して検討した。Ｎ6-シクロプロピルアデニンが結合したＮ6-シクロプロピル−２'−デオキシアデノシンをアントラキノン存在下で３６５ｎｍの光を照射して一電子酸化すると、主生成物として２'−デオキシアデノシンが得られた。また、Ｎ6-シクロプロピル−２'−デオキシアデノシンと同等の酸化電位をもつＮ6-メチル−２'−デオキシアデノシンは同条件下では酸化されなかった。このことから、シクロプロピルグアニンと同様に、Ｎ6-シクロプロピルアデニンについても、図３に示されるように、一電子酸化により生成するラジカルカチオンはＮ6位のシクロプロピル基の開裂反応によって速やかにトラップされると考えられる。 シクロプロピル基の導入位置が２位又は８位であるシクロプロピルアデニンについても同様の反応が起こる。【００１０】 このように、Ｎ2位又は８位にシクロプロピル基を導入したグアニン、及びＮ6位、２位又は８位にシクロプロピル基を導入したアデニンは、シクロプロパン環の開環反応による速度論的要因に基づいたホール捕捉能を有する塩基である。【００１１】 本発明のシクロプロピル基含有ＤＮＡは、シクロプロピル基導入塩基を少なくとも１個含有し、かつその塩基がグアニン又はアデニンであるものである。そのシクロプロピル基導入塩基は、上に示したように、Ｎ2位又は８位にシクロプロピル基を導入したグアニン、及びＮ6位、２位又は８位にシクロプロピル基を導入したアデニンからなる群から選ばれた塩基である。【００１２】 通常のＤＮＡの酸化では、図４（Ａ）に示されるように、ＤＮＡ塩基の中で最も酸化されやすいグアニン塩基上にホールが形成され、その生じたホールがＤＮＡの中でグアニン塩基を飛び石伝いに移動する「Ｇホッピング」機構により、酸化損傷が伝播していく。それに対し、本発明により、シクロプロピル基導入塩基として例えばシクロプロピルグアニン（ｃｐＧ）をＤＮＡ中に導入すると、図４（Ｂ）に示されるように、酸化により生じたホールはｃｐＧにより捕捉され、それ以上は伝播しないようになる。シクロプロピルグアニンに限らず、シクロプロピルアデニンをＤＮＡに導入した場合も同様である。 また、ＤＮＡに導入するシクロプロピル基導入塩基の数は１個に限らず、２個以上であってもよい。【００１３】【発明の実施の形態】 シクロプロピルグアニンはフルオロイノシンとシクロプロピルアミンとの反応により合成することができる。また、シクロプロピルアデニンはクロロプリンとシクロプロピルアミンとの反応により合成することができる。これらの合成法は、他のアミン類について知られている手法をシクロプロピルアミンに適用したものである。【００１４】 シクロプロピルグアニン含有ＤＮＡは、フルオロイノシンを含むＤＮＡを合成した後、シクロプロピルアミンで置換することにより合成することができる。 シクロプロピルアデニン含有ＤＮＡは、クロロプリンを含むＤＮＡを合成した後、シクロプロピルアミンで置換することにより合成することができる。【００１５】【実施例】 次に、Ｎ2-シクロプロピルグアニン含有ＤＮＡの合成方法について図５、図６を参照して説明するが、他のシクロプロピル含有ＤＮＡについても同様に合成することができる。【００１６】 図５は２−フルオロイノシンをＤＮＡに導入する反応を示したものである。（１）２'−デオキシグアノシン（化合物（Ａ））から化合物（Ｄ）を合成する反応は既知のものであり、例えば次の参考文献の論文にも報告されている。参考文献：Acedo, M.; Fabrega, C.; Avino, A.; Goodman, M.; Fagan, P.; Wemmer, D.; Eritja, R., Nucleic Acid Res., 1994, 22, 2982-2989.【００１７】 化合物（Ａ）から化合物（Ｄ）を合成する概略を示す。化合物（Ａ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、イミダゾール存在下にターシャリーブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ）を作用させ、二つの水酸基をシリル化して化合物（Ｂ）を得る。化合物（Ｂ）を１，４−ジオキサンを溶媒として、ジエチルアゾダイカルボキシレート（ＤＥＡＤ）、トリフェニルフォスフィン（ＰＰｈ3）、パラニトロフェニルエタノール（ＮＰＥ）を作用させ、化合物（Ｃ）を得る。化合物（Ｃ）をトルエン中ターシャリーブチルナイトライト（t-Butyl nitrite）を作用させジアゾニウム塩とした後、ポリビニルピリジンフッ化水素塩（ＰＶＰＨＦ）と反応させて、アミノ基をフッ素に置換して化合物（Ｄ）を得る。【００１８】（２）2-Fluoro-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-O6-(p-nitrophenetyl)2'-deoxyinosine（図５中の化合物（Ｅ））の合成 図５中の化合物（Ｄ）（2-fluoro-3'-O, 5'-O-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-O6-(p-nitrophenetyl)-2'-deoxyinosine)６５０.０ｍｇ（１.０１ｍｍｏｌ）と酢酸１４５ｍＬ（２.５３ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液１２ｍＬにテトラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）の１Ｍ ＴＨＦ溶液２.５ｍＬ（２.５０ｍｍｏｌ）を加え、９０分間撹拌した。溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相はn-hexane（ヘキサン）：ethyl acetate（酢酸エチル）＝１：１）を行い、2-Fluoro-2'-deoxyinosineを得た。【００１９】 得られた粗生成物とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１.３ｍｇ（０.０１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液１０ｍＬにジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒＣｌ）３７５.０ｍｇ（１.１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。溶媒を留去した後、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去して濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相はn-hexane：ethyl acetate＝１：１）により精製して、無色泡状の化合物（Ｅ）４８４.０ｍｇ（０.６７１ｍｍｏｌ，２段階合計収率６７％）を得た。【００２０】 化合物（Ｅ）の核磁気共鳴スペクトルデータ：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 2.50 (ddd, 1H, J = 13.2, 6.4, 4.0 Hz), 2.74 (ddd, 1H, J = 13.2, 6.8, 6.4 Hz), 3.28 (t, 2H, J = 6.8 Hz) 3.34 (dd, 1H, J = 10.2, 5.0 Hz), 3.40 (dd, 1H, J = 10.2, 4.6 Hz), 3.72 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 4.64 (m, 1H), 4.80 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 6.34 (pseudo t, 1H, J = 6.6 Hz), 6.74-6.78 (4H), 7.14-7.37 (9H), 7.46 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.02 (s, 1H), 8.14 (d, 2H, J = 8.8 Hz); FABMS m/z 722 [(M+H)+].【００２１】（３）2-Fluoro-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyinosine 3'-O-(2-cyanoetyl N,N-diisopropylphosphoramidite)（図５中の化合物（Ｆ））の合成 化合物（Ｄ）１１１.８ｍｇ（０.１５５ｍｍｏｌ）をアセトニトリルで共沸した後、アセトニトリル（１.５ｍＬ）に溶かし、テトラゾール１６ｍｇ（０.２２８ｍｍｏｌ）、2-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト６５ｍＬ（０.２２６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物は酢酸エチルで抽出し、水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去して濃縮した。得られた淡黄色泡状の化合物（Ｆ）を１５８.５ｍｇ得た。 この化合物（Ｆ）は、そのまま続くＤＮＡ合成に使用した。【００２２】（４）Ｎ2-シクロプロピルグアニン含有ＤＮＡの合成 図６に示されるように、Ｎ2-シクロプロピルグアニンを含むＤＮＡは、まず2-フルオロイノシンを含むＤＮＡの合成を行った後にポストモディフィケーションにより2-フルオロイノシンをＮ2-シクロプロピル−２'−デオキシグアノシンに変換することによって合成した。【００２３】 その2-フルオロイノシンを含むＤＮＡの合成は、ホスホロアミダイト（化合物（Ｆ））を用いた標準的な固相合成法により行なった。合成したＤＮＡは支持体に保持したまま取り出し、そのまま０.５ＭのＤＢＵ（1,8-ジアザビシクロウンデセン）のアセトニトリル溶液で室温で２０分間処理することで６位のP-Nitrophenetyl基をはずし、１％トリエチルアミンのアセトニトリル溶液、及びアセトニトリルで洗浄を行った。さらに、６Ｍシクロプロピルアミン水溶液で６０℃で１６時間処理を行なうことで２位へのシクロプロピル基の導入、脱保護及び支持体からの切り出しを同時に行い、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することによりＮ2-シクロプロピルグアニンを含むＤＮＡを得た。【００２４】（Ｎ2-シクロプロピルグアニンを含むＤＮＡの作用） ＤＮＡオリゴマー ATT TAT AG8T XTG TAG15 GTA TTTの５'末端を放射ラベルした後、その相補鎖AAA TAC CTA CAC ACCNBPU ATA AATと二本鎖を組ませた。その塩基配列を図７に示す。Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはチミンである。この二本鎖中、Ｘは、Ｇ、Ｎ2-メチルＧ、又はＮ2-シクロプロピルＧ（ｃｐＧ）を、CNBPUはシアノベンゾフェノン置換ウリジンを示す。CNBPUは、３１２ｎｍの光照射により励起され、相補鎖側のＧ8からの電子移動を促進し、酸化損傷をまずＧ8に発生させることが出来る。【００２５】 このＤＮＡオリゴマーに所定の処理を施した後、そのＤＮＡオリゴマーをポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果を図８に示す。 図８の写真で、最上段は泳動レーンを表わしている。その下のＸはその位置の核酸塩基の種類を表わし、ｈνは３１２ｎｍの光を０℃で１５分間照射する酸化反応処理、piperidineはピペリジン中、９０℃で２０分間の加熱処理を表わし、○はその処理を行ったこと、Ｘは行なわなかったことを表わしている。【００２６】 泳動パターンで、一番上の黒い部分が、元の長さのＤＮＡである。レーン１は、配列を示すマーカレーンで、このＤＮＡオリゴマーをマクサム−ギルバート法で処理した結果であり、ＧとＡの位置にバンドが確認される。【００２７】 レーン２はＸがＧ，レーン３はＸがＮ2-メチルＧ、レーン４〜６はＸがＮ2-シクロプロピルＧであるＤＮＡを用いた実験結果を表わしている。レーン２と３では、Ｇ15の位置にバンドが生じていることから、Ｇ8に発生した酸化損傷がＤＮＡを伝搬し、Ｇ15まで到達していることが分かる。レーン４では、Ｇ15の位置のバンド強度がレーン２，３のバンド強度に比べて著しく低下していることから、酸化損傷の伝搬が抑えられていることがわかる。レーン２とレーン４では、ＤＮＡの違いはＸがＧかｃｐＧであるかの違いであり、このことは、ｃｐＧがＧ8からＧ15への酸化損傷の伝搬を抑制していることが分かる。レーン５，６は、レーン４のコントロール実験であり、本実験の信頼性の高さを示している。 図８の電気泳動の結果は、シクロプロピルグアニンがＤＮＡ内でのグアニン酸化損傷の拡散を防止していることを示している。【００２８】【発明の効果】 通常のＤＮＡでは多数のグアニン又はアデニンで酸化損傷が起こるが、本発明のシクロプロピル基含有ＤＮＡでは、シクロプロピル基導入塩基を少なくとも１個含有し、かつその塩基がグアニン又はアデニンであるようにしたので、シクロプロピル基導入塩基の極めて迅速な反応により、他のグアニンやアデニンの酸化分解を防止することができる。このように、本発明のシクロプロピル基含有ＤＮＡは、損傷の伝搬を防止することが出来る。【００２９】 近年の遺伝子科学の進展により、遺伝子レベルでの診断、例えばＤＮＡチップなどの利用により、ＤＮＡの産業上での需要が急速に伸びている。これら遺伝子診断に用いられるＤＮＡも当然酸化損傷を受け、ＤＮＡが切断されるなどして診断精度の低下を来す。シクロプロプルグアニンやシクロプロプルアデニンを含有しておくことにより、ＤＮＡの酸化分解を防止できる。【００３０】 ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡと蛋白の反応や相互作用により、発色、吸収などの化学信号を発する塩基は「リポーター塩基」として、遺伝子診断の信号の検出に利用されている。シクロプロピル基導入塩基は、ＤＮＡに導入され、ＤＮＡの酸化を検知することにより、速やかにアルキルラジカルが発生する。即ちシクロプロピル基導入塩基は新規なラジカル発生リポーター塩基となる。アルキルラジカルの発生は、エレクトロンスピン共鳴分光法により高感度での検出が可能である。【図面の簡単な説明】【図１】 Ｎ2-シクロプロピル−２'−デオキシグアノシンを示す化学式である。【図２】 Ｎ2-シクロプロピル−２'−デオキシグアノシンの酸化反応機構を示す化学反応式である。【図３】 Ｎ6-シクロプロピル−２'−デオキシアデノシンの酸化反応機構を示す化学反応式である。【図４】 ＤＮＡの酸化反応機構を示す化学反応式であり、（Ａ）は通常のＤＮＡの場合、（Ｂ）は本発明によるシクロプロピルグアニン含有ＤＮＡの場合である。【図５】 2-フルオロイノシンをＤＮＡに導入する反応を示す化学反応式である。【図６】 Ｎ2-シクロプロピルグアニン含有ＤＮＡの合成反応を示す化学反応式である。【図７】 評価に用いたシクロプロピルグアニン含有ＤＮＡの塩基配列を示す化学式である。【図８】 Ｎ2-シクロプロピルグアニン含有ＤＮＡオリゴマーに各種処理を施した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果を示す泳動パターンの写真である。【配列表】 シクロプロピル基導入塩基を少なくとも１個含有し、かつ前記塩基がグアニン又はアデニンであることを特徴とするシクロプロピル基含有ＤＮＡ。 前記シクロプロピル基導入塩基は、Ｎ2位又は８位にシクロプロピル基を導入したグアニンである請求項１に記載のシクロプロピル基含有ＤＮＡ。 前記シクロプロピル基導入塩基は、Ｎ6位、２位又は８位にシクロプロピル基を導入したアデニンである請求項１に記載のシクロプロピル基含有ＤＮＡ。