生命科学関連特許情報
| タイトル： | 再公表特許(A1)_精製アントシアニンの製造法および結晶性アントシアニン |
| 出願番号： | 2001007891 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C07H17/065,C12P19/60 |
特許情報キャッシュ
松本 均 花村 聡 平山 匡男 JP WO2002022847 20020321 JP2001007891 20010911 精製アントシアニンの製造法および結晶性アントシアニン 明治製菓株式会社 000006091 平木 祐輔 100091096 藤田 節 100118773 石井 貞次 100096183 松本 均 花村 聡 平山 匡男 JP 2000276540 20000912 7 C07H17/065 C12P19/60 JP C07H17/065 C12P19/60 AP(GH,GM,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,CH,CY,DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EC,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PH,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW 再公表特許(A1) 20040122 2002527289 18 技術分野本発明は、天然物由来のアントシアニンから精製アントシアニンを製造する方法および精製アントシアニンをさらに結晶化して結晶性アントシアニンを製造する方法、ならびに該製造法で調製される結晶性アントシアニンに関する。さらに詳しくは、アントシアニン類を構成するアントシアニジンルチノシドまたはアントシアニジングルコシドを酵素的に変換または除去して、アントシアニジンルチノシドまたはアントシアニジングルコシドをより減少させることにより、以降の精製・結晶化工程を容易にすることを特徴とする方法である。背景技術アントシアンとは、下記の式（Ｉ）に示される骨格を有するアントシアニジンとそれに糖が結合して配糖体となったアントシアニンとの総称である。アグリコンであるアントシアニジンとしては、例えばデルフィニジン（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、シアニジン（Ｃｙａｎｉｄｉｎ）、マルビジン（Ｍａｌｖｉｄｉｎ）、ペラルゴニジン（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、ペオニジン（Ｐｅｏｎｉｄｉｎ）、ペチュニジン（Ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）などがある。アントシアニンは例えば、上記アントシアニジンにグルコースが配糖体として結合している場合はアントシアニジングルコシドと呼ぶ。また、アントシアニンに見いだされる糖としては単糖類であるグルコース以外に、ガラクトース、アラビノースや２糖類であるルチノース、ソフォロースなどがある。アントシアン類は自然界に幅広く存在し、主に天然系色素として食品、あるいはその機能性から欧州では、医薬品、医薬部外品、化粧品などに幅広く使用されている。例えば特公昭５９−５３８８３号に記載されるような瘢痕形成剤としての利用、あるいは、特開平３−８１２２０号公報に記載されるようなブルーベリー由来のアントシアニンを用いた末梢血管の疾病治療について価値ある薬理学的性質が見出されている。昨今日本国内でもアントシアニンの色素以外の利用法としてアントシアニンの機能性に注目が集まってきている。本発明者らも、カシス（英名Ｂｌａｃｋｃｕｒｒａｎｔ，和名黒フサスグリ）のアントシアニンにいくつかの有用な効能を見出し、報告（ＷＯ０１／０１７９８）している。しかし、薬理学的性質を持つこれらアントシアニンを医薬品などとして用いる場合には、高純度に精製されたものが求められるのに対して、高純度に精製された精製アントシアニンが大量に製造された例は過去になかった。また高純度アントシアニンは安定性・吸湿性などの面から好ましくは結晶製品が求められるが、結晶性アントシアニンが大量に製造された例も過去に無かった。また、従来の医薬品用のアントシアニン組成物は主にブルーベリー由来の製剤であるが、アントシアニン含有量が２５重量％以下であり、有効性を発揮するためにはアントシアニン製剤として少なくとも１回当たり数百ｍｇも投与しなくてはならず、少量の摂取で薬理学的な効果を出すことは事実上不可能であり、高純度の精製アントシアニンを含有したアントシアニン高含有組成物が求められていた。高純度の精製アントシアニンが存在しなかった理由は、ブルーベリー由来のアントシアニンを例に取るとアントシアニン成分が１５種も存在しており、それらの物質の物理化学的性質が非常に似ているために分取用カラムなどによる精製においてそれぞれの流出ピークが重なってしまうことや、また、それぞれの成分が非常に少量であるために分離精製が不可能であったためである。また、カシス由来のアントシアニンを例にあげると、シアニジン−３−Ｏ−グルコシド（以下Ｃ３Ｇと略記する。）、シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド（以下Ｃ３Ｒと略記する。）、デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド（以下Ｄ３Ｇと略記する。）およびデルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド（以下Ｄ３Ｒと略記する。）の４成分がアントシアニン類として含まれているが、ブルーベリー由来のアントシアニンと同様に該４物質の物理化学的性質が非常に似ているために、これら４成分の混合物であってもクロマトピークが接近しており、分取用クロマトグラフィーや遠心分配クロマトグラフィーを用いて精製アントシアニンを得ようとしても極端な収率の低下を伴うため大量調製は不可能であった。また、カシス中の代表的なアントシアニン類の量比はＤ３Ｇ，Ｄ３Ｒ，Ｃ３Ｇ及びＣ３Ｒがそれぞれ、１２．５％、４７．９％、４．１％及び３５．５％であり、含有量の低いＤ３Ｇ，Ｃ３Ｇ成分を大量精製するのは更に困難であり、精製アントシアニンを大量に製造する方法が求められていた。一方、従来からアントシアンは安定性に問題のあることが判っており、本発明者らは、アントシアニン高含有物の安定化剤としてフィチン酸、糖類、糖アルコール類を添加することによる安定化法を特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ００／０９２０４）している。しかし、アントシアニンを高含有量で使用して製剤化する時には、このような添加物を入れる余地がないために、さらに安定性の高い物性が要請されており、より物理的に安定な結晶形態のアントシアニンを使用した製剤が求められていた。そのため、従来医薬品用途として高純度アントシアニンは、例えば特許第３０３０５０９号に記載のデルフィニジン塩酸塩（配糖体ではなくアグリコンのアントシアニジン塩酸塩）の合成法などにより、いくつもの段階を経て有機合成されていたが、天然物から大量に調製された例はなかった。また、合成法によって製造されたアントシアニジン塩酸塩は、強酸性条件下では安定であるが、弱酸性から中性領域では配糖体に比べ分解されやすいことが判明しており、その応用範囲は甚だ狭いものになっていた。従って、酸性から中性領域でより安定なアントシアニンを結晶として調製することが求められていたが、有機合成法によりアントシアニンを大量に調製することは現状ではできていない。アントシアニン類の特性は、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ ＨＡＬＬ社刊，１９９４，Ｌｏｎｄｏｎ）に列記されている。例を挙げて引用すると、Ｄ３Ｒの結晶は従来報告されておらず、Ｄ３Ｇ塩酸塩の結晶形に関する報告はあるが融点の記載はなく大量に調製することが難しかったことがわかる。同様にＣ３Ｒ塩酸塩については、融点、結晶形共に記載があるが、Ｃ３Ｇ塩酸塩では融点の記載はなく大量に調製することが難しかったことがわかる。従来までは、結晶、非結晶を問わず精製されたアントシアニンが、微量にしか調製できなかったため、各種酵素のアントシアニンへの反応性を調べた研究はほとんどなかった。特に、ラムノシダーゼのアントシアニンに対する反応性を述べたものは皆無であった。以上のことより、煩雑な合成法を用いずに高純度の精製アントシアニンを天然物より大量に製造する方法が求められ、さらに精製アントシアニンを結晶化した結晶性アントシアニン塩を大量に製造する方法が求められていた。発明の開示本発明はラムノシダーゼを用いて、アントシアニジンルチノシドのラムノース末端を切断し、アントシアニジンルチノシド成分をアントシアニジングルコシドに変換させた後、アントシアニジングルコシド成分を精製して単離することを特徴とする精製アントシアニンの製造法、あるいはこの精製アントシアニンをさらに結晶化して、結晶性アントシアニジングルコシド塩・水和物を製造する方法に関する。また別の本発明は、β−グルコシダーゼを用いて、アントシアニジングルコシドのグルコース末端を切断し、分解除去した後に、アントシアニジンルチノシド成分を精製して単離することを特徴とする精製アントシアニンの製造法、あるいはこの精製アントシアニンをさらに結晶化して、結晶性アントシアニジンルチノシド塩・水和物を製造する方法に関する。さらにまた別の本発明は、これらの製造法を用いて調製された結晶性アントシアニン塩・水和物に関するものである。本発明を具体的に説明すると、第１発明は少なくとも１種以上のアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にラムノシダーゼを作用させ、アントシアニジンルチノシドを加水分解することによりアントシアニジングルコシドに変換させた後、アントシアニジングルコシドを単離し、精製することを特徴とする、精製アントシアニジングルコシドを製造する方法を提供する。第２の発明は少なくとも１種以上のアントシアニジングルコシドとアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にβ−グルコシダーゼを作用させ、アントシアニジングルコシドを加水分解し、アントシアニジングルコシドを減じせしめた後、アントシアニジンルチノシドを単離し、精製することを特徴とする、精製アントシアニジンルチノシドを製造する方法を提供する。上記の第１及び第２の発明において、アントシアニン組成物としてはカシス、イチジク、コーヒー、バナナ、ブラックベリーなどから選択される一種以上の果実から得られる果汁および／またはアメリカマコモ、サトイモなどから得られるアントシアニン濃縮物が挙げられる。ラムノシダーゼとしてはヘスペリジナーゼ、ナリンジナーゼ等が挙げられる。また、β−グルコシダーゼとしてはアントシアニジンルチノシドのβ−グルコシド結合は分解せずに、アントシアニジングルコシドのβ−グルコシド結合のみを選択的に分解できる酵素であり、その具体例としてはアーモンド由来のものが挙げられる。第３の発明は下記の工程を経て結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物を製造する方法を提供する。ａ）少なくとも１種以上のアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にラムノシダーゼを作用させ、アントシアニジンルチノシドを加水分解することによりアントシアニジングルコシドに変換する。ｂ）該アントシアニジングルコシドを精製することにより純度９９％以上のアントシアニジングルコシドを得る。ｃ）該アントシアニジングルコシドを塩酸／アルコール系の混合溶媒を用いて結晶化する。第４の発明は上記第３の発明の方法により得られる結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物を提供する。第５の発明は下記の工程を経て結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物を製造する方法を提供する。ａ）少なくとも１種以上のアントシアニジングルコシドとアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にβ−グルコシダーゼを作用させ、アントシアニジングルコシドを加水分解することによりアントシアニジングルコシドを減じせしめる。ｂ）該アントシアニジンルチノシドを精製することにより純度９９％以上のアントシアニジンルチノシドを得る。ｃ）該アントシアニジンルチノシドを塩酸／アルコール系の混合溶媒を用いて結晶化する。第６の発明は上記第５の発明の方法により得られる結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物を提供する。上記の第３及び第５の発明において、ｂ）工程の精製法としてはイオン交換吸着クロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣを用いることができ、ｃ）工程の塩酸／アルコール系の混合溶媒としては５％（Ｖ／Ｖ）塩酸／９５％（Ｖ／Ｖ）メタノールをもちいることがでできる。第７の発明は下記の物理的性質を有する結晶性デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・０．５水和物を提供する。熱分析による融点：２５８℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１７ｎｍ（２７５００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：４６５組成式：Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１２Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４８．００ ４．５０ ６．８０第８の発明は下記の物理的性質を有する結晶性シアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・０．５水和物を提供する。熱分析による融点：２４５℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１０ｎｍ（２６３００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：４４９組成式：Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４８．８０ ４．７０ ６．９０第９の発明は下記の物理的性質を有する結晶性デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・１．５水和物。熱分析による融点：２２４℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５２０ｎｍ（２７８００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：６１１組成式：Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１６Ｃｌ・１．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４５．８０ ５．３０ ５．２０第１０の発明は下記の物理的性質を有する結晶性シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・０．５水和物を提供する。熱分析による融点：２１４〜２２６℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１２ｎｍ（２７４００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：５９５組成式：Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１５Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ５０．００ ５．３０ ５．３０本明細書においてアントシアニンとは、アグリコンであるアントシアニジンに糖類が結合した配糖体のことを示し、グルコース、ルチノース、アラビノース、ガラクトースなどの糖類が結合したグルコシド、ルチノシド、アラビノシド、ガラクトシドなどを含む。本発明において酵素反応に用いられる少なくとも１種以上のアントシアニジングルコシドおよび／またはアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物としては、アントシアニンを含むいかなるものでもよく、市販の果汁、濃縮ジュース、飲料、色素溶液、あるいは食品医薬品などの原料となる粉末などがあげられる。濃縮ジュースとして好ましくは、カシス、イチジク、コーヒー、バナナ、ブラックベリーなどから選択される一種以上の果実から得られる果汁および／またはアメリカマコモ、サトイモなどから得られるアントシアニン濃縮物がよい。また、該粉末を水や緩衝液などに溶解してから、反応に用いる。より好ましくは、本発明者らがＷＯ０１／０１７９８に報告した方法で調製したアントシアニン高含有組成物を用いるのがよく、事前に酸類・糖類・ポリフェノール類などが除去されているので、酵素反応後の精製工程において操作が容易になる。本発明の精製アントシアニンの製造法におけるアントシアニンのアグリコンの種類は、特に限定はしない。好ましくはカシス由来のアントシアニン類およびその塩がよい。カシス由来のアントシアニンのアグリコン部分は、デルフィニジンとシアニジンのみであるが、酵素反応では、特にこの２種類のアントシアニジンにおける特異性があるとは考えられず、他のアントシアニジンの配糖体、例えば、式（Ｉ）に示されるマルビジン、ペラルゴニジン、ペチュニジン、ペオニジンなどの配糖体にも応用可能である。なお、カシス由来のアントシアニン成分の組成は、シアニジン−３−Ｏ−グルコシド（Ｃ３Ｇ）、シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド（Ｃ３Ｒ）、デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド（Ｄ３Ｇ）、デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド（Ｄ３Ｒ）の４成分からなっている。また、結晶性アントシアニン塩を構成する塩の種類は、塩酸、硫酸などの鉱酸、リン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸などの有機酸の塩（フラビニウム塩）が含まれるが、結晶のしやすさなどから、塩酸、ＴＦＡ、リン酸との塩が好ましい。本発明に用いられるラムノシダーゼとしては、動物、植物、微生物など特に起源は問わないが、作用機作としてアントシアニン末端のα−ラムノシダーゼ活性をもつものであればよいが、この際に注意しなくてはならないのはβ−グルコシダーゼ活性が低いことが重要である。さらには、アントシアニンは、中性から塩基性領域に長時間放置すると分解することが知られており、さらに加温により分解が促進されることが知られている。よって、ｐＨ４．０以下、温度４０℃以下で高い活性を持つことが必要である。好ましくは、ヘスペリジナーゼまたはナリンジナーゼがあげられ、より好ましくは、ヘスペリジナーゼがあげられる。ヘスペリジナーゼは、温州みかんの白濁成分であるヘスペリジンを分解することを目的として工業的に生産されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のものがあげられる。なお、これまでＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘスペリジナーゼのアントシアニンに対する反応作用は知られていなかった。ナリンジナーゼも落果みかんや夏みかんなどの苦味成分であるナリンジンを分解して呈味改善などに用いられているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のものなどがあげられる。なお、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のナリンジナーゼのアントシアニンに対しての応用は報告されていなかった。本発明に用いられるβ−グルコシダーゼとしては、特にその起源は問わないが、アントシアニンに対して反応しなくてはならないのは当然のこととして、アントシアニジンルチノシドのβ−グルコシド結合を分解せず、アントシアニジングルコシドのβ−グルコシド結合のみを分解する基質特異性が必要である。つまり、末端のグルコースにのみ反応し、分子内の中央部のグルコースには反応しないものが適している。また、ラムノシダーゼと同様にｐＨ４．０以下、温度４０℃以下で高い活性を持つことが必要である。好ましくは、アーモンド由来のβ−グルコシダーゼがあげられる。なお、アーモンド由来のβ−グルコシダーゼは、代表的なβ−グルコシダーゼであるが、アントシアニンに対する反応性を調べた研究は存在しなかった。β−グルコシダーゼのアントシアニンに対する反応処理の例としては、従来からブドウ汁、ピーチネクター等の果汁工業やワイン、シャンパンなどを含むスパークリングワインなどのワイン工業でβ−グルコシダーゼの一種であるアントシアナーゼを脱色、脱苦味に用いていることがあげられる。しかし、アントシアナーゼは、アントシアニンのグルコシドとルチノシド双方に反応し、分解してしまうために、精製アントシアニンの製造には不向きである。これらの酵素をアントシアニンに作用させる反応条件は、とくに限定はしないが上記のようにアントシアニンは、中性から塩基性領域に長時間放置すると分解することが知られており、さらに高温により分解が促進されることが知られているため、酸性領域が好ましく、高温で反応させないことが好ましい。具体的には、ｐＨ４．０以下、温度４０℃以下で反応させるのが最も好ましいと考えられる。酵素反応に用いるアントシアニン含有物中の基質の濃度は、特に限定されないが、極端に高濃度であると、反応液の粘性が増大し反応速度が落ち、また反応液中に存在する物質による阻害反応や、基質に対する転移反応などが心配されるため、基質濃度として１０（ｗ／ｖ）％以下が好ましく、より好ましくは５（ｗ／ｖ）％以下である。また、酵素の添加量は、反応時間との関連で特に限定するものではない。ラムノシダーゼまたはβ−グルコシダーゼによる酵素反応によってアントシアニン含有物における基質、すなわち、アントシアニジンルチノシドまたはアントシアニジングルコシドの含有量を減じせしめた後の酵素反応の停止法としては、通常用いられる方法である、加熱する温度上昇法、酸アルカリなどを加えるｐＨ調整法、有機溶媒添加法などが可能であるが、上記のようにアントシアニン類は中性から塩基性領域では不安定であり、加熱によって分解が促進されるため、好ましくは、塩酸、ＴＦＡ、リン酸などの強酸の添加によるｐＨ低下法、あるいはメタノールなどの有機溶媒添加法による酵素反応停止が望ましい。本発明において、酵素反応終了後の精製方法は、カラムクロマトグラフ法以外にも、必要に応じて他のクロマトグラフ法、樹脂吸着法や膜分離法などを適宜組み合わせて行うことが可能である。中でも、ＯＤＳシリカゲルを用いたクロマトグラフ法が最も好ましい。また、必要に応じて予め陽イオン交換樹脂などにアントシアニン成分を吸着させた後、溶出させることにより、予備精製を行ったものを同様に精製してもよい。本明細書においてアントシアニン含有量は、ＰＣＴ／ＪＰ００／０９２０４またはＷＯ０１／０１７９８に記載してあると同様に、含まれるアントシアニンの各成分の含有量を合計したものであり、ＨＰＬＣによるアントシアニンのピーク面積比によって算出する。すなわち、最初に、重量既知のアントシアニン標品をＨＰＬＣで分析し、５２０ｎｍにおけるピーク面積から検量線を作成し、各アントシアニン成分の含量を求める。さらに、各成分の含量をピーク面積で除した応答係数、即ちｍｇ／ピーク面積を得る。次に、アントシアニン含有サンプルをＨＰＬＣ分析し、それぞれの成分のピーク面積に標品から求めた応答係数を乗じて、それぞれの成分含有量を計算し、注入量との比からアントシアニン純度を重量（ｗ／ｗ）％として求める。そのため、アントシアニンの純度はアグリコンであるアントシアニジンの量だけでなく、結合している糖の量も含むものとして算出される。本発明の精製アントシアニンの純度は、ＨＰＬＣ分析によれば純度９９％以上である。本発明における結晶化方法は、主に有機溶媒からの結晶化が好ましく、メタノールを結晶化溶媒とするのが好ましい。この際に、アントシアニン類は、酸との塩を作って結晶となるため、結晶化溶媒中に酸を添加しておくことが好ましく、１％〜５％（Ｖ／Ｖ）程度の塩酸、ＴＦＡ、リン酸などを添加しておくことが好ましい。後記の実施例１または３で調製された結晶Ｄ３Ｇ、結晶Ｄ３Ｒ、結晶Ｃ３Ｇ、結晶Ｃ３Ｒの熱分析を行ったところ、以下のような結果となった。Ｄ３Ｇの融点は２５８℃であり、Ｄ３Ｒの融点は２２４℃であり、Ｃ３Ｇの融点は２４５℃であり、Ｃ３Ｒの融点は２１４〜２２６℃である。本発明の結晶性アントシアニン塩は、偏光顕微鏡観察、元素分析、融点測定、ＨＰＬＣ分析により９９％以上の純度を有する結晶であり、吸湿性もなく融点も２００℃以上で大変安定な物質である。従来は高純度の精製アントシアニンや結晶性アントシアニン塩を製造することはできなかったが、本発明の製造法を用いることにより、天然物から精製する形で高純度の精製アントシアニンならびに結晶性アントシアニン塩を製造することができた。このようにして製造された結晶性アントシアニン塩は吸湿性を示さず、安定な性状であった。発明を実施するための最良の形態本発明を以下の実施例、参考例および比較例によりさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。参考例１ アントシアニン高含有組成物の調製ＷＯ０１／０１７９８に記載される方法に従ってアントシアニン高含有組成物を調製した。すなわち、市販のカシス濃縮果汁３Ｋｇ（固形分当たりのアントシアニン純度２．８％）を水で希釈し、Ｂｘ．１０の濃度に調製した。この希釈果汁を濾紙で濾過して異物を除去した後、日東電工社製の膜分離装置（ＮＴＲ−７４１０）を用い、膜分離を行った。膜分離により得られた濃縮液をスプレードライすることにより粉末状のアントシアニン高含有組成物を得た。本組成物のアントシアニン純度は固形分当たり１４．１％であった。本組成物は、室温に放置しておくと吸湿性を有した。実施例１ ヘスペリジナーゼを用いた精製デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシドと精製シアニジン−３−Ｏ−グルコシドの製造参考例１で得られた粉末４０ｇ（アントシアニン純度は１４．１％であり、アントシアニンの各成分割合は、Ｄ３Ｇ，Ｄ３Ｒ，Ｃ３Ｇ及びＣ３Ｒはそれぞれ、１２．５％、４７．９％、４．１％及び３５．５％である。）を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１Ｌに溶解してアントシアニン基質溶液とした。なお、基質溶液中のアントシアニンの含有量は計算では５．６４ｇであり、Ｄ３Ｇ，Ｄ３Ｒ，Ｃ３Ｇ及びＣ３Ｒの含有量はそれぞれ０．７１ｇ、２．７０ｇ、０．２３ｇ及び２．００ｇとなる。別途、田辺製薬社製ヘスペリジナーゼ（商品名ヘスペリジナーゼ田辺二号）７９．３５ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１Ｌに溶解しておき、酵素溶液とした。（ラムノシダーゼ活性４２．５Ｕ／ｍｌに相当する）基質溶液と酵素溶液をそれぞれ４０℃に加温した後、混合し反応を開始した。反応は４０℃で６時間行い、３％（Ｗ／Ｖ）リン酸溶液２Ｌを加え反応を停止させた。続いてイオン交換樹脂ＸＡＤ−７（ロームアンドハース社製）４Ｌをカラム（内径１３ｃｍ Ｘ 長さ ３０ｃｍ）に充填し、その反応混合液（４Ｌ）を通液させ、アントシアニン成分を吸着させた。次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＴＦＡ（２Ｌ）を通液し非吸着成分を洗浄した。さらに、０．１％ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液を通液し、吸着成分を溶出した。このメタノール溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、固形分濃度として１０％（Ｗ／Ｖ）になるように３％リン酸水溶液に転溶することにより濃縮液を得た。本濃縮液をＯＤＳ−１２０Ｔシリカゲルカラムを用い（東ソー社製、ＩＤ５．５×３０ｃｍ，２０μｍ）、０．１％ＴＦＡを含む９％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル水溶液で流速８０ｍｌ／分で５２０ｎｍの波長で検出し、Ｒ．Ｔ．（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）が６６−９０分のＤ３Ｇ画分と１５８−２００分のＣ３Ｇ画分を得た。これらの画分は、ＨＰＬＣ分析により単一ピークであり、純度９９％以上の精製デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシドと精製シアニジン−３−Ｏ−グルコシドを調製することが出来た。なお、純度測定のＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。即ち、ヒューレットパッカードシリーズ１１００（横川アナリチカルシステムズ社製）ＨＰＬＣシステムを用いて以下のようなグラジエント条件で分析を実施した。ＨＰＬＣグラジエント条件：時間（分） Ａ液（０．５％リン酸水溶液） Ｂ液（メタノール）０ ８０ ２０１５ ７７ ２３２０ ７７ ２３３０ ５０ ５０４０ ５０ ５０カラムは、ヒューレットパッカード社製Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍを用いた。流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、検出は波長５２０ｎｍで測定した。標品のＤ３ＧおよびＣ３ＧのＲ．Ｔ．はそれぞれ、１０．５４分、１４．６０分であった。また、酵素反応前の基質溶液と酵素反応を停止させた溶液の一部を採取し、孔径０．４５μｍのマイクロフィルターで異物を除去してアントシアニジングルコシド液を調製した。反応前と反応後のアントシアニン成分の含有量を測定した。結果は表１に示したとおりである。基質溶液中のアントシアニジンルチノシドが分解されてアントシアニジングルコシドが生成し、アントシアニジングルコシドのみの組成となっていることが示されている。しかも、反応前と比べてＤ３Ｇで３．３６倍、Ｃ３Ｇで６．７８倍に増加していることが示されている。実施例２ 結晶性デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物と結晶性シアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物の製造実施例１で得られたＤ３Ｇ画分とＣ３Ｇ画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、３０ｍｌのヘプタンを加え再度濃縮乾固し、分離操作中に混入するＴＦＡを除去した。重量測定したところ、得られたＤ３Ｇ画分は１．５１ｇであり、Ｃ３Ｇ画分は０．９８ｇであった。上記のＤ３Ｇ画分及びＣ３Ｇ画分をそれぞれ別個に５％塩酸／９５％メタノールに溶解後、５℃で２４時間静置し結晶化を行った。桐山ロートとＷｈａｔｍａｎ社製ＮＯ．２の濾紙を用いて固液分離を行い、さらに少量のアセトンで洗浄後乾燥し、析出物を得た。得られた両析出物は偏光顕微鏡で観察すると偏光が観測され結晶形であることがわかった。収量は結晶性Ｄ３Ｇ塩酸塩が１．０６ｇであり、結晶性Ｃ３Ｇ塩酸塩は０．５９ｇであった。得られた結晶性Ｄ３Ｇ塩酸塩と結晶性Ｃ３Ｇ塩酸塩についてＮＭＲによる構造決定を実施した。これらの２種のアントシアニンは従来報告のあるスペクトルデータと一致した。また、結晶性Ｄ３Ｇ塩酸塩と結晶性Ｃ３Ｇ塩酸塩のその他の物性値は以下の通りである。結晶性Ｄ３Ｇ塩酸塩：熱分析による融点：２５８℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１７ｎｍ（２７５００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：４６５組成式：Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１２Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４８．００ ４．５０ ６．８０計算値： ４７．７８ ４．５８ ６．７２結晶性Ｃ３Ｇ塩酸塩：熱分析による融点：２４５℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１０ｎｍ（２６３００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：４４９組成式：Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４８．８０ ４．７０ ６．９０計算値： ４９．５７ ４．７３ ６．９３実施例３ アーモンド由来のβ−グルコシダーゼを用いた精製デルフィニジ−３−Ｏ−ルチノシドと精製シアニジン−３−Ｏ−ルチノシドの製造参考例１で得られた粉末３．４２ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１Ｌに溶解して、アントシアニン基質溶液とした。別途、ＳＩＧＭＡ社製のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼ２０８ｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１Ｌに溶解して酵素液とした（５００Ｕ／ｍｌに相当）。基質溶液１Ｌを４０℃で１０分間保温して温度を安定させた後、酵素溶液１Ｌを加えてよく攪拌し反応を開始した。６０分経過後、２Ｌの０．３Ｎ塩酸を加え反応を停止した。続いて反応を停止させた反応混合液４Ｌを実施例１に記載されている方法と同様にイオン交換樹脂吸着によって処理して、さらに、ＯＤＳシリカゲルカラムを用いたＨＰＬＣによって精製することによりＲ．Ｔ．が６９−９６分のＤ３Ｒ画分と１４４−１７４分のＣ３Ｒ画分を得た。これらの画分は、実施例１記載のＨＰＬＣ分析条件（標品Ｄ３ＲおよびＣ３ＲのＲ．Ｔ．はそれぞれ、１２．６３分、１８．１９分）で分析した結果、上記Ｄ３Ｒ画分とＣ３Ｒ画分は単一ピークであった。従って、純度９９％以上の精製デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシドと精製シアニンジン−３−Ｏ−ルチノシドが調製できた。また、ＨＰＬＣにより測定した反応前の基質溶液と反応後の溶液におけるアントシアニン含有量を表２に示した。表２によればアントシアニジングルコシドのみが分解され、アントシアニジンルチノシドは大部分が分解されずに残っており、精製に最適な組成の反応液が得られていた。実施例４ 結晶性デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物と結晶性シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物の製造実施例２と同様の結晶化工程を経て、析出物を得た。得られた両析出物は偏光顕微鏡で観察すると偏光が観測され結晶形であることがわかった。収量は結晶Ｃ３Ｒ塩酸塩が５８ｍｇであり、結晶Ｄ３Ｒ塩酸塩が８８ｍｇであった。得られた結晶性Ｄ３Ｒ塩酸塩と結晶性Ｃ３Ｒ塩酸塩についてＮＭＲによる構造決定を実施した。これらの２種のアントシアニンは従来報告のあるスペクトルデータと一致した。また、結晶性Ｄ３Ｒ塩酸塩と結晶性Ｃ３Ｒ塩酸塩の物性値は下記の通りである。結晶性Ｄ３Ｒ塩酸塩：熱分析による融点：２２４℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５２０ｎｍ（２７８００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：６１１組成式：Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１６Ｃｌ ・１．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４５．８０ ５．３０ ５．２０計算値： ４５．８６ ５．３８ ４．９８結晶性Ｃ３Ｒ塩酸塩：熱分析による融点：２１４〜２２６℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１２ｎｍ（２７４００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：５９５組成式：Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１５Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ５０．００ ５．３０ ５．３０計算値： ４９．９７ ５．１３ ５．４６比較例１ 市販のアントシアナーゼを用いた酵素反応参考例１で得られた粉末３４２ｍｇを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００ｍｌに溶解して、アントシアニン基質溶液とした。別途、果汁工業に用いられる代表的なアントシアナーゼの一種、ＧＩＳＴ−ｂｒｏｃａｄｅｓ社製 商品名ＣＹＴＯＬＡＳＥ ＰＣＬ５を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）で１０倍に希釈することにより酵素液を得た。基質溶液２ｍｌを４０℃で１０分間保温して温度を安定させた後、酵素溶液２ｍｌを加えてよく攪拌し反応を開始した。１５分経過後２００μｌの反応液をサンプリングし、２００μｌの０．３Ｎ塩酸を加え反応を停止した。反応前と反応後のアントシアニン組成をＨＰＬＣで測定した。反応前後のアントシアニンの含有量と組成を以下の表３に示した。アントシアニジングルコシド、アントシアニジンルチノシドの双方が分解されておりアントシアニン配糖体の精製には適さないことが判明した。産業上の利用の可能性本発明により、天然物から精製する形で高純度の精製アントシアニン並びに結晶性アントシアニン塩を製造することができた。このようにして製造された結晶性アントシアニン塩は吸湿性を示さず、安定な性状であった。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０００−２７６５４０号の明細書に記載された内容を包含する。そして、本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。 少なくとも１種以上のアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にラムノシダーゼを作用させ、アントシアニジンルチノシドをアントシアニジングルコシドに変換させた後、アントシアニジングルコシドを単離し、精製することを特徴とする、精製アントシアニジングルコシドを製造する方法。 アントシアニン組成物がカシス、イチジク、コーヒー、バナナ、ブラックベリーから選択される一種以上の果実から得られる果汁および／またはアメリカマコモ、サトイモから得られるアントシアニン濃縮物である請求項１記載の精製アントシアニジングルコシドを製造する方法。 ラムノシダーゼがヘスペリジナーゼ、ナリンジナーゼである請求項１または２記載の精製アントシアニジングルコシドを製造する方法。 少なくとも１種以上のアントシアニジングルコシドとアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にβ−グルコシダーゼを作用させてアントシアニジングルコシドを減じせしめた後、アントシアニジンルチノシドを単離し、精製することを特徴とする、精製アントシアニジンルチノシドを製造する方法。 アントシアニン組成物がカシス、イチジク、コーヒー、バナナ、ブラックベリーから選択される一種以上の果実から得られる果汁および／またはアメリカマコモ、サトイモから得られるアントシアニン濃縮物である請求項４記載の精製アントシアニジンルチノシドを製造する方法。 β−グルコシダーゼがアントシアニジンルチノシドのβ−グルコシド結合は分解せずに、アントシアニジングルコシドのβ−グルコシド結合のみを選択的に分解できる酵素である請求項４または５記載の精製アントシアニジンルチノシドを製造する方法。 β−グルコシダーゼがアーモンド由来のβ−グルコシダーゼである請求項４乃至６記載の精製アントシアニジンルチノシドを製造する方法。 下記の工程を経て結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物を製造する方法。ａ）少なくとも１種以上のアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にラムノシダーゼを作用させ、アントシアニジンルチノシドをアントシアニジングルコシドに変換する。ｂ）該アントシアニジングルコシドを精製することにより純度９９％以上のアントシアニジングルコシドを得る。ｃ）該アントシアニジングルコシドを塩酸／アルコール系の混合溶媒を用いて結晶化する。 請求の範囲８記載のｂ）工程の精製法がイオン交換吸着クロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣを用いた精製法である請求項８記載の結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物を製造する方法。 塩酸／アルコール系の混合溶媒が５％（Ｖ／Ｖ）塩酸／９５％（Ｖ／Ｖ）メタノールである請求項８または９記載の結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物を製造する方法。 請求項８乃至１０のいずれか１項記載の方法で得られた結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・水和物。 下記の工程を経て結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物を製造する方法。ａ）少なくとも１種以上のアントシアニジングルコシドとアントシアニジンルチノシドを含有するアントシアニン組成物にβグルコシダーゼを作用させてアントシアニジングルコシドを減じせしめる。ｂ）該アントシアニジンルチノシドを精製することにより純度９９％以上のアントシアニジンルチノシドを得る。ｃ）該アントシアニジンルチノシドを塩酸／アルコール系の混合溶媒を用いて結晶化する。 請求項１２記載のｂ）工程の精製法がイオン交換吸着クロマトグラフィーおよび／またはＨＰＬＣを用いた精製法である請求の範囲１２記載の結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物を製造する方法。 塩酸／アルコール系の混合溶媒が５％（Ｖ／Ｖ）塩酸／９５％（Ｖ／Ｖ）メタノールである請求項１２または１３記載の結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物を製造する方法。 請求項１２乃至１４のいずれか１項記載の方法で得られた結晶性アントシアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・水和物。 下記の物理的性質を有する結晶性デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・０．５水和物。熱分析による融点：２５８℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１７ｎｍ（２７５００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：４６５組成式：Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１２Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４８．００ ４．５０ ６．８０ 下記の物理的性質を有する結晶性シアニジン−３−Ｏ−グルコシド塩酸塩・０．５水和物。熱分析による融点：２４５℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１０ｎｍ（２６３００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：４４９組成式：Ｃ２１Ｈ２１Ｏ１１Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４８．８０ ４．７０ ６．９０ 下記の物理的性質を有する結晶性デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・１．５水和物。熱分析による融点：２２４℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５２０ｎｍ（２７８００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：６１１組成式：Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１６Ｃｌ・１．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ４５．８０ ５．３０ ５．２０ 下記の物理的性質を有する結晶性シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド塩酸塩・０．５水和物。熱分析による融点：２１４〜２２６℃Ｕｖλｍａｘ（ε）：５１２ｎｍ（２７４００）ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ：Ｍ＋：５９５組成式：Ｃ２７Ｈ３１Ｏ１５Ｃｌ・０．５Ｈ２Ｏ元素分析値： Ｃ Ｈ Ｃｌ測定値： ５０．００ ５．３０ ５．３０ ラムノシダーゼを用いて、アントシアニジンルチノシドのラムノース末端を切断し、アントシアニジンルチノシド成分をアントシアニジングルコシドに変換させた後、アントシアニジングルコシド成分を精製して単離することを特徴とする精製アントシアニジングルコシドの製造法、あるいはこの精製アントシアニジングルコシドをさらに結晶化して得られる結晶性アントシアニジングルコシド塩およびその製造方法を提供する。また、β−グルコシダーゼを用いて、アントシアニジングルコシドのグルコース末端を切断し、分解除去した後に、アントシアニジンルチノシド成分を精製して単離することを特徴とする精製アントシアニジンルチノシドの製造法、あるいはこの精製アントシアニジンルチノシドをさらに結晶化して得られる結晶性アントシアニジンルチノシド塩およびその製造方法を提供する。