生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_改変された毛様体神経栄養因子、それらを作製する方法およびそれらの使用方法 |
| 出願番号： | 2000533553 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C12N 1/15,C12N 1/19,C12N 1/21,C12N 5/10,C12P 21/02,A61K 38/00,A61K 47/48,A61P 3/04,A61P 3/10,A61P 25/00,A61P 25/14,A61P 43/00,C07K 14/47,C07K 14/475 |
特許情報キャッシュ
ファンドル， ジェイムズ ピー． スタール， ネイル JP 4330796 特許公報(B2) 20090626 2000533553 19990226 改変された毛様体神経栄養因子、それらを作製する方法およびそれらの使用方法 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 597160510 ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ． 山本 秀策 100078282 ファンドル， ジェイムズ ピー． スタール， ネイル US 09/031,693 19980227 20090916 C12N 15/09 20060101AFI20090827BHJP C12N 1/15 20060101ALI20090827BHJP C12N 1/19 20060101ALI20090827BHJP C12N 1/21 20060101ALI20090827BHJP C12N 5/10 20060101ALI20090827BHJP C12P 21/02 20060101ALI20090827BHJP A61K 38/00 20060101ALI20090827BHJP A61K 47/48 20060101ALI20090827BHJP A61P 3/04 20060101ALI20090827BHJP A61P 3/10 20060101ALI20090827BHJP A61P 25/00 20060101ALI20090827BHJP A61P 25/14 20060101ALI20090827BHJP A61P 43/00 20060101ALI20090827BHJP C07K 14/47 20060101ALI20090827BHJP C07K 14/475 20060101ALI20090827BHJP JPC12N15/00 AC12N1/15C12N1/19C12N1/21C12N5/00 AC12P21/02 CA61K37/02A61K47/48A61P3/04A61P3/10A61P25/00A61P25/14A61P43/00 111C07K14/47C07K14/475 C12N 15/00-15/90 C07K 14/475 JSTPlus(JDreamII) BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed UniProt/GeneSeq 特表平０７−５０６００５（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−１５７４９３（ＪＰ，Ａ） 特表２０００−５０７２７１（ＪＰ，Ａ） Neurology., 46[5] (1996) p.1244-1249 Neurosci Res., 23 (1995) p.327-333 実験医学, 13[16] (1995) p.179-184 25 US1999004430 19990226 WO1999043813 19990902 2002504370 20020212 54 20060217 横田 倫子 【０００１】本願は、米国特許出願０９／０３１，６９３（１９９８年２月２７日出願）の優先権を主張する。本願を通じて、種々の特許および刊行物が参照される。これらの特許および刊行物は、本明細書において参考としてその全体が本願に対して援用される。【０００２】（発明の背景）本発明は、神経学的または他の疾患または障害の処置のために有用である治療用のＣＮＴＦ関連ポリペプチドに関する。【０００３】毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、ニワトリ胚毛様体神経節ニューロンのインビトロでの生存に必要とされるタンパク質である（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９８０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．３４、６９−７５）。毛様体神経節は、解剖学的には、眼窩内に位置し、外側直筋と視神経鞘との間に存在し；これは、動眼神経から副交感神経線維を受ける。動眼神経は、毛様体筋および瞳孔括約筋を神経支配する。【０００４】過去十年間に亙って、多数の生物学的効果が、毛様体神経節ニューロンの生存を支持する能力に加えて、ＣＮＴＦに帰せられている。ＣＮＴＦは、ラット末梢視神経および脳における両能性の神経節前駆体細胞の分化を誘導すると考えられている（Ｈｕｇｈｅｓら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３５：７０−７３）。さらに、ＣＮＴＦは、ニワトリ胚脊髄神経節感覚ニューロンの生存を促進することが観察されている（ＳｋａｐｅｒおよびＶａｒｏｎ，１９８６、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３８９：３９−４６）。さらに、ＣＮＴＦは、運動ニューロン、海馬ニューロンおよびシナプス前脊髄ニューロンの生存および分化を支持する（Ｓｅｎｄｔｎｅｒら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４０−４４１；Ｉｐら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：３１２４−３１３４；Ｂｌｏｔｔｎｅｒら、１９８９、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１０５：３１６−３２０）。【０００５】骨格筋の神経支配が筋肉の構造および機能の維持において重要な役割を果たしていることは永く知られている。骨格筋は、ＣＮＴＦの正の作用の標的であることが最近示されている。具体的には、ＣＮＴＦは、骨格筋の脱神経誘導萎縮（湿重量および筋繊維の断面積の減少）および脱神経化した骨格筋の攣縮および強縮性緊張の減少の両方を防止する。Ｈｅｌｇｒｅｎら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７６：４９３−５０４。このモデルにおいて、ヒトＣＮＴＦはまた、体重増加の遅延として現れる有害効果ももたらした。この有害効果はまた、ＡＬＳの処置のためにｒＨＣＮＴＦを用いた臨床試験においても観察されている。従って、脱神経後の筋肉重量および動物の体重の同時測定は、それぞれ、ｒＨＣＮＴＦまたは他の化合物の処置に対する効力および有害反応の尺度として使用され得る。これらの測定値から得られた効力値の比を、治療指数（Ｔ．Ｉ．）と定義する。これを、本明細書において、ＴＤ25／ＥＤ50と表現し、その結果、Ｔ．Ｉ．の値が高ければ、その化合物は治療用量でより安全である。【０００６】ＣＮＴＦは、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２および国際公開ＷＯ９１／０４３１６（１９９１年４月４日公開）（これらは、その全体が本明細書において参考として援用される。）において記載されるように、細菌発現系においてクローニングされ、そして合成されている。【０００７】ＣＮＴＦについてのレセプター（「ＣＮＴＦＲα」という）はクローニングされ、配列決定され、そして発現されている（Ｄａｖｉｓら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９−６３を参照のこと）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）として知られるＣＮＴＦおよび造血因子は、ＩＬ−６シグナル伝達成分ｇｐ１３０および第二のβ成分（ＬＩＦＲβとして知られる）を含む、共有されたシグナル伝達経路を介してニューロン細胞に作用する；従って、ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプター複合体は、ＬＩＦ応答性細胞、またはｇｐ１３０およびＬＩＦＲβを有する他の細胞におけるシグナル伝達を開始し得る（Ｉｐら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：１１２１−１１３２）。【０００８】ヒトＣＮＴＦに加えて、対応するラット（Ｓｔｏｅｋｌｉら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９２０−９２３）およびウサギ（Ｌｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８９４２−８９４７）の遺伝子がクローニングされており、そして２００アミノ酸のタンパク質をコードすることが見出されており、これは、ヒト遺伝子と約８０％の配列同一性を共有する。ヒトおよびラットの両方の組換えタンパク質が例外的に高レベル（総タンパク質の７０％にもいたる）で発現され、そしてほぼ均質にまで精製されている。【０００９】構造的および機能的な類似性にもかかわらず、組換えのヒトおよびラットのＣＮＴＦは、いくつかの点で相違する。培養物中のニワトリ胚毛様体ニューロンの生存および神経突起の伸長を支持するにおける組換えラットＣＮＴＦの生物学的活性は、組換えヒトＣＮＴＦのものよりも４倍良い（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２）。さらに、ラットＣＮＴＦは、ヒトＣＮＴＦレセプターについて、ヒトＣＮＴＦよりも高い親和性を有する。【００１０】大きさが同一であるヒトおよびラットのＣＮＴＦの物理的特性における驚くべき相違は、ＳＤＳゲルにおけるそれらの異なる移動性である。この挙動の相違は、変性状態においてでさえ維持される、２つの分子のうちの一つにおける異常な構造的特徴の存在を示唆する（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２）。【００１１】遺伝子工学による変異誘発は、組換えタンパク質の機能的ドメインの構造的機構を明らかにするために広汎に用いられている。いくつかの異なるアプローチが欠失または置換変異誘発を実施することについて文献において記載されている。最も首尾よいものは、アラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）および相同体スキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６）であるようである。これらのアプローチは、成長ホルモンのレセプター結合ドメインを同定し、そしてその同族レセプターに対して変更した結合特性を有するハイブリッドタンパク質を作製することを補助した。【００１２】ｒＨＣＮＴＦの物理学的、生化学的および薬理学的特性をよりよく理解するために、出願人は、それらの対応する組換えタンパク質の異なる生物学的および物理的特性に基づいて、ヒトおよびラットのＣＮＴＦ遺伝子の合理的変異誘発を行った（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．ら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２を参照のこと）。出願人は、６３位でのアミノ酸の性質が、ｓＣＮＴＦＲαに対するヒトＣＮＴＦの親和性およびそのインビトロでの生物学的効力を大いに増強し得ることを見出した（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３、２６８：１９０００−１９００３；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３：５８１３−５８１８）。【００１３】同時係属中の米国特許出願第０７／５７０，０６１（１９９０年８月２０日出願、発明の名称「Ｃｉｌｉａｒｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ」）および国際公開ＷＯ９１／０４３１６（１９９１年４月４日公開）（これらは、その全体が本明細書において参考として援用される。）に記載されるように、出願人が意図するＣＮＴＦの使用の一つは、ハンティングトン病（ハンティングトン舞踏病）の処置のためのＣＮＴＦの使用であった。ハンティングトン病（ＨＤ）は、中枢神経系の遺伝性変性障害である。ＨＤの根底となる病理は、不随意運動および認知活動の統制の局面を担う脳の奥底の構造体である基底核の進行性で容赦ない変性である。ＨＤにおける症状の発症は、一般に、２０歳〜４０歳の間の成人においてである。この疾患の特徴的な症状は、舞踏病および他の自発的運動、痴呆、ならびに精神医学的症状である。舞踏病性の運動は、短く、非自発的で、流れるような運動からなり、主に遠位端に影響を与える。患者は、しばしば、これらの運動を、その運動と自発的な行動とを混ぜ合わせることによって「繕う」傾向がある。しかし、ＨＤ患者はまた、失調（持続性、異常体位）、チック（「習慣性痙攣」）、運動失調（協調不能）および構語障害（どもりのある発話）を含む、種々の他の神経学的異常を示す。ＨＤの痴呆は、原型的な「皮質下」痴呆と特徴付けられる。ＨＤにおける痴呆の症状としては、精神機能の遅延および集中および連続的な課題における困難性が挙げられる。ＨＤ患者における行動障害は、多様であり、そして無関心および離脱症状のような人格の変化；動揺、衝動、妄想症、抑鬱、攻撃的行動、妄想、精神病などが挙げられ得る。この執拗な運動、認知および行動減退は、社会的および機能的な不能および、究極的には死をもたらす。【００１４】ＨＤは、常染色体で優性形質として遺伝する。米国の集団におけるその罹患率は、１０万人あたり５〜１０人であると見積もられ、米国の集団では、２５，０００人の総罹患数となる。しかし、症状の遅い発症に起因して、その集団において「危険あり」である無症候性の個体もまた多い。ＨＤ遺伝子を有する無症候性で危険ありの患者の罹患率は、おそらく、症候性の患者の罹患率の二倍である（Ｗ．ＫｏｒｏｓｈｅｔｚおよびＮ．Ｗｅｘｌｅｒ、私信）。従って、新しい治療を受けるに適格であるＨＤ患者の総数は、約７５，０００人である。【００１５】ＨＤの病原性を担うと現在考えられている遺伝子は、第４染色体の短アームのテロメア末端に位置する。この遺伝子は、未知の機能の構造的に新規なタンパク質をコードし、そしてその遺伝子産物とＨＤの病原性との関係は現在のところ確定していないままである。【００１６】ＨＤにおける主要な解剖損傷は、尾状核および被核のいわゆる「中程度の棘っぽい」ニューロン（総称して、齧歯類において線条として知られる）の欠失からなる。これらのニューロンは、突出系を含み、それにより、尾状核／被核は、脳の基底核の別の場所にその出力核を突出させる。中程度の棘っぽいニューロンによって利用される主要な神経伝達物質は、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）であるが、多くのニューロンがエンケファリンまたはサブスタンスＰのようなニューロペプチドもまた含有する。しかし、ＨＤにおいて、ＧＡＢＡを神経伝達物質として利用せず、代わりにアセチルコリンおよびニューロペプチドであるソマトスタチンもしくはニューロペプチドＹのいずれかを含有する介在ニューロンは、比較的ＨＤにおいて損傷を受けていないことは明らかである。【００１７】ＨＤにおいてみられるものを模倣する病理学的および神経化学的変化は、グルタミン酸作用性アゴニスト薬物の線状体への注入によって模倣され得る。適切な条件下でのキノリン酸の注入は、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）をその神経伝達物質として利用する中程度の大きさの内因性線状体ニューロンの選択的涸渇を、大きなコリン作用性介在ニューロンに影響することなく、もたらす。【００１８】ＨＤにおける症状または神経保護的処置のいずれにも臨床試験で成功していない。しかし、疾患の進行および患者の機能をモニターし得る、有用な認証された評価装置および神経画像化技術が存在する。【００１９】ＣＮＴＦレセプター複合体は、３つのタンパク質を含む：特異性を決定するα成分（これは、ＣＮＴＦに直接結合する）、ならびに２つのシグナル伝達β成分（ＬＩＦＲβおよびｇｐ１３０）（これ自体では、ＣＮＴＦには結合し得ないが、ＣＮＴＦに対する応答でシグナル伝達を開始するのに必要である）。ＣＮＴＦＲ複合体のβ成分は、α成分よりもさらに広汎に身体に分布している。ＣＮＴＦＲ複合体の３つの成分は、通常、細胞表面に会合していない；ＣＮＴＦは、まずＣＮＴＦＲαに結合し、次にｇｐ１３０を連結し、そして最後にＬＩＦＲβを補充することによって、段階的に、完全なレセプター複合体の集合を誘発する。レセプター集合におけるこの最後の工程が生じる場合（β成分のヘテロ二量体化）、細胞内シグナル伝達が、β成分と会合した非レセプターチロシンキナーゼ（ＪＡＫキナーゼ）を活性化することによって開始される。ＪＡＫキナーゼは、互いにおよびまた、レセプターの細胞質ドメイン上のチロシン残基リン酸化することによって応答し、ＳＴＡＴタンパク質のＳｒｃ相同性２ドメインについてのホスホチロシン結合（ｄｏｃｋｉｎｇ）部位を作製する。そのリン酸化後、結合したＳＴＡＴタンパク質は、そのレセプターから脱離し、二量体化し、そして核へと移行し、そこで、それらはＤＮＡを結合し、そして転写を活性化する（総説：Ｆｒａｎｋ Ｄ．およびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．（１９９６）Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：３−１８；Ｓｔａｈｌ，Ｎ．およびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ．（１９９７）Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ２Ｂ，７７７−８０９）。アキソカイン（ａｘｏｋｉｎｅ）は、物理的特性および化学特性が改善された変異体ＣＮＴＦ分子であり、これは、ＣＮＴＦレセプターと相互作用し、そして活性化する能力を保持する（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）。【００２０】ｏｂ遺伝子の産物であるレプチンは、脂肪細胞から分泌され、そして脳への末梢シグナルとして機能して食餌摂取およびエネルギー代謝を調節する（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３１）。興味深いことに、一回膜貫通レセプターであるレプチンレセプター（ＯＢ−Ｒ）は、ｇｐ１３０と考慮すべき配列類似性を有する（Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．ら（１９９５）Ｃｅｌｌ ８３：１２６３−１２７１）、およびＣＮＴＦのように、レプチンは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達する（Ｂａｕｍａｎｎ，Ｈ．ら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８３７４−８３７８；Ｇｈｉｌａｒｄｉ，Ｎ．ら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６２３１−６２３５）。ＣＮＴＦおよびレプチンの両方の全身投与は、視床下部の満腹中枢においてｔｉｓ−１１の誘導を生じた（Ｇｌｏａｇｕｅｎ，Ｉ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６４５６−６４６１）およびＳＴＡＴ３（Ｖａｉｓｓｅ，Ｃ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．１４：９５−９７）。このことは、体重および摂食行動の調節におけるその役割を示す。実際、ＣＮＴＦのヒトへの投与によって、食餌摂取が減少し、そして体重減少がもたらされた（Ｇｒｏｕｐ、Ａ．Ｃ．Ｔ．Ｓ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４６：１２４４−１２４９）。【００２１】（発明の要旨）本発明の目的は、運動ニューロン疾患および筋肉変性疾患を含むがそれらに限定されない疾患または障害の処置のための新規ＣＮＴＦ関連栄養因子を提供することである。好ましい実施態様において、ＣＮＴＦおよび関連分子は、ハンティングトン病の処置のために利用される。【００２２】本発明のさらなる目的は、本明細書において具体的に記載したもののほかに、治療特性を改良されたＣＮＴＦ関連因子を同定するための方法を提供することである。【００２３】これらおよび他の目的は、本発明に従って達成される。ここで、ヒトＣＮＴＦタンパク質におけるアミノ酸置換は、その治療特性を増強する。１つの実施態様において、電気泳動の移動度における変化を使用して、潜在的に有用な改変ＣＮＴＦタンパク質を最初にスクリーニングする。【００２４】 好ましい実施態様において、ヒトＣＮＴＦにおける６３位のアミノ酸グルタミンを、アルギニン（６３Ｑ→Ｒと称する）または生物学的活性が改良された改変ＣＮＴＦ分子を生じる別のアミノ酸に置換する。さらなる実施態様において、ｒＨＣＮＴＦ改変体は、６３Ｑ→Ｒ変異と３つの他の新規の特徴を組み合わせる：１）最後の１３個のアミノ酸残基の欠失（ΔＣ１３と称する）。これは、ｒＨＣＮＴＦの可溶性の上昇をその活性を損なうことなく与える；２）１７位の独特なシステイン残基の置換。これは、生理的緩衝液中で、生理的ｐＨおよび温度条件下で、その活性に影響することなくｒＨＣＮＴＦの安定化をもたらす；または３）アミノ酸残基６４Ｗの置換。これは、ｒＨＣＮＴＦのインビトロでの生物学的活性を変化させ、そしてそのインビボでの治療指数に７倍の改良をもたらす。【００２５】別の好ましい実施態様において、ＲＧ２９７（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ６３ＱＲΔＣ１３）と称する分子は、６３Ｑ→Ｒ置換（これは、より大きな生物学的効力を与える）と、末端の１３アミノ酸残基の欠失（これは、生理的条件下での可溶性の上昇を与える）および１７ＣＡ置換（これは、特に３７℃での生理的条件下での安定性を与える）とを組合せ、そして動物モデルにおけるｒＨＣＮＴＦよりも２〜３倍良い治療指数を示す。【００２６】別の好ましい実施態様において、二重置換６３ＱＲ６４ＷＡを有するＲＧ２４２と称する分子が記載され、これは、生物学的効力の異なるスペクトルおよび７倍高い治療指数を生じる。【００２７】別の好ましい実施態様において、二重置換６３ＱＲΔＣ１３を有するＲＧ２９０と称する分子が記載され、これは、生理的条件下でのより大きな可溶性を与える。【００２８】（発明の詳細な説明）本発明は、ヒトまたは動物における神経学的疾患および障害を処置する方法に関する。これは、一部、組換えラットＣＮＴＦが、組換えヒトＣＮＴＦよりヒトＣＮＴＦレセプターにより効率的に結合するという最初の知見、引き続いて、ヒトＣＮＴＦをラットＣＮＴＦにより綿密に似せるアミノ酸置換が、改変されたＣＮＴＦのヒトＣＮＴＦレプセターへの結合の増強および付随する生物学的活性の増強を生じるという発見に基づく。【００２９】好ましい実施態様において、ヒトＣＮＴＦタンパク質の単一のアミノ酸の変更は、このタンパク質の毛様体神経節の生存性および増殖ならびに他のニューロンの生存性および増殖を促進する能力の有意な増強を生じる。【００３０】組換えヒトおよびラットＣＮＴＦは、同数のアミノ酸（１９９）および類似の質量（Ｎ末端メチオニンの除去後に、それぞれ、分子量２２，７９８および２２，７２１）を有する。しかし、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では、組換えヒトＣＮＴＦは、分子量＝２７，５００のタンパク質として移動する一方で、ラットＣＮＴＦは、予測した移動度で移動した。さらに、ヒトＣＮＴＦは、ニワトリ毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンに対して、ラットＣＮＴＦよりも４倍低い生物学的活性を有し、そしてヒトタンパク質は、ラットＣＮＴＦよりはるかに低い効率で、細胞表面上のヒトまたはラットレセプターへの結合と競合する。【００３１】上記の観察は、これらの相違の原因であるＣＮＴＦ分子上の領域を同定するためのある方向性をもった取り組みを導いた。この方法は、遺伝子工学方法によって、対応するラットＣＮＴＦ配列を有するヒトＣＮＴＦ配列（および逆も同様）の一部分の交換を包含した。これを達成するために、２つのＣＮＴＦ遺伝子に共通する制限部位およびそれらの対応する発現ベクターにおける独自の制限部位を利用した。必要な場合は、このような部位を、同じタンパク質配列をコードする領域において、２つの遺伝子のうちの一方または他方に操作した。このアプローチを用いて、発現ベクターを図１に示した改変タンパク質の各々について得た。少なくとも６０％純粋になるまで個々のタンパク質を単離した後、ヒトおよびラットＣＮＴＦのタンパク質を比較して、それらの特性を決定した。【００３２】ヒトおよびラットＣＮＴＦの電気泳動的移動度は有意に異なるので、各アミノ酸置換の効果を、タンパク質の移動度に対するこのような変化の効果を決定することによって最初にモニターした。本明細書中に記載されるように、電気泳動的移動度のデータは、ラットＣＮＴＦと同じ位置に移動する改変型ヒトＣＮＴＦ分子の全てが、単一のアミノ酸置換Ｇｌｎ６３→Ａｒｇ（Ｑ６３→Ｒ）を有したことを示した。【００３３】ラットＣＮＴＦ分子の電気泳動的移動度と類似する電気泳動的移動度を示した改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質を、生物学的活性およびレセプター結合について引き続き試験した。【００３４】ＣＮＴＦは、Ｅ８ニワトリ胚の解離した毛様体ニューロンの生存を助けるその能力によって特徴づけられる。この基準によって、精製された組換えラットＣＮＴＦは、ラット由来の天然のタンパク質と同じくらいに活性であるが、組換えヒトＣＮＴＦより４倍高く活性である［Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２および国際公開ＷＯ９１／０４３１６（１９９１年４月４日公開）］。同じアッセイを利用して、上記のように調製された改変した分子の生物学的活性を決定した。本明細書中で記載されるように、Ｑ６３→Ｒ置換を有する全ての改変型ＣＮＴＦ分子は、親ヒトＣＮＴＦタンパク質と比較して、毛様体神経節ニューロンの生存を助ける能力の増加を示した。このような結果は、電気泳動的移動度の変化と生物学的特性の増強との間の強い相関関係を示した。【００３５】ヒトＣＮＴＦに対する改変の生物学的効果を測定することに加えて、各々の分子の潜在的な生物学的活性の指標もまた、ＣＮＴＦレセプターに結合する分子の能力に対する各々の改変の効果を決定することによって獲得され得る。【００３６】１つの実施態様において、改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質の、ラット上頸神経節ニューロン（ＳＣＧ）への結合に対するラットＣＮＴＦとの競合する能力を測定する。本明細書中に記載されるように、ヒトＣＮＴＦは、これらの細胞から125Ｉ−標識ラットＣＮＴＦ結合と置換する際に、非標識ラットＣＮＴＦより、約９０倍能力が低い。しかし、本明細書中に記載される改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質のいくつかは、ラットタンパク質と置換する際に、ヒトＣＮＴＦより強力である。競合的結合能力のこのような増加を有する、本明細書中に記載されるこのような増強された競合的結合能力を有した分子の全ては、改変された電気泳動的移動度を示す分子であった。ここで、この分子は、ラットＣＮＴＦに類似した様式で移動した。【００３７】別の実施態様において、細胞（例えば、ＭＧ８７線維芽細胞）は、ヒトＣＮＴＦレセプターα成分を発現するように操作され、そしてこのような細胞は、ヒトレセプターに対する改変型タンパク質の結合能力をアッセイするために使用される。ヒトＣＮＴＦは、ヒトＣＮＴＦレセプターへの結合について125Ｉ標識したラットＣＮＴＦと競合して、ラットＣＮＴＦより約１２倍能力が低い。本明細書中に記載されるいくつかの改変型ヒトＣＮＴＦ分子（ヒトＣＮＴＦよりむしろラットＣＮＴＦに似ている電気泳動的移動度を有するそららの分子の全てを含む）は、ヒトＣＮＴＦレセプターを発現する細胞に対する125Ｉ−ラットＣＮＴＦの結合と競合して、ヒトＣＮＴＦよりより強力である。【００３８】別の実施態様において、特定の増殖の能力の指標および網膜光受容体の変性を防ぐ他の因子を提供することにおいて実証される有用性を有する動物モデルを使用して、本発明に従う改変型ＣＮＴＦ分子の治療的特性を評価する。実施例４に記載されるように、ｈＣＮＴＦ（Ｇｌｎ６３→Ａｒｇ）は、組換えヒトＣＮＴＦより１０倍高い、網膜変性の光誘導損傷モデルにおける光受容体の変性を防ぐ能力を有する。【００３９】従って、本発明に従えば、ヒトＣＮＴＦタンパク質の特性のアミノ酸置換は、ヒトＣＮＴＦレセプターに対して増強した結合を示す改変型ヒトＣＮＴＦタンパク質を生じるため、増強された治療特性を有すると予測される。【００４０】本発明の実施に有用な改変型ＣＮＴＦ分子は、例えば、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２および国際公開第ＷＯ９１／０４３１６号（１９９１年４月４日公開）に記載される原核生物発現系または真核生物発現系においてクローニングおよび発現することによって調製され得る。組換えニューロトロフィン遺伝子は、任意の数の方法を利用して発現および精製され得る。この因子をコードする遺伝子は、例えば、ｐＣＰ１１０のような細菌発現ベクター（これに限定されない）へサブクローニングし得る。【００４１】組換え因子は、引き続き、安定な、生物学的に活性なタンパク質の形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば、そして限定はされないが、この因子は、可溶性タンパク質または封入体としてのいずれかで細胞から回収され得る。ここから、この因子は、８Ｍグアニジン塩酸塩によって定量的に抽出され得、そして透析され得る。さらにこの因子を精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。【００４２】本発明に従って、本明細書中に記載されるように生成された改変型ＣＮＴＦ分子またはそれらのハイブリッドまたは変異体を使用して、ＣＮＴＦに応答性の細胞の、インビトロまたはインビボでの分化、増殖または生存を促進し得る。この細胞としては、ＣＮＴＦ／ＩＬ−６／ＬＩＦレセプターファミリーのレセプターを発現する細胞、または、例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：１１２１−１１３２に記載されるように適切なシグナル伝達成分を発現する任意の細胞が挙げられる。あるいは、変異体またはハイブリッドは、細胞分化または生存をアンタゴナイズし得る。【００４３】本発明を使用して、ＣＮＴＦまたはＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプター複合体に応答する任意の細胞の障害を処置し得る。本発明の好ましい実施態様において、ＣＮＴＦ／ＩＬ−６／ＬＩＦレセプターファミリーのメンバーを発現する細胞の障害は、これらの方法に従って処置され得る。このような障害の例としては、以下の細胞を含む障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病細胞、造血幹細胞、巨核球およびそれらの前駆体、ＤＡ１細胞、破骨細胞、骨芽細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎臓上皮細胞、胚性幹細胞、腎臓メサンギウム細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞など。【００４４】従って、本発明は、ＣＮＴＦ関連神経学的障害または疾患、分化障害または疾患、あるいは神経損傷に罹患している患者を、有効量の改変型ＣＮＴＦ、またはそのハイブリッドもしくは変異体で処置する方法を提供する。改変型ＣＮＴＦ分子を利用して、Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉらの国際公開第ＷＯ９１／０４３１６号（１９９１年４月４日公開）においてＣＮＴＦについて記載される障害または疾患、ならびにＤａｖｉｓらの国際公開第ＷＯ９１／１９００９号（１９９１年１２月１２日公開）においてＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲ複合体について記載される障害または疾患を処置し得る（これらの両方が、本明細書中にその全体が参考として援用される）。【００４５】このような疾患または障害としては、変性疾患（例えば、網膜変性）、脊髄、コリン作用性ニューロン、海馬ニューロンに関与する疾患または障害、あるいは運動ニューロンに関与する疾患または障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症または顔面神経の疾患および障害（例えば、ベル麻痺）が挙げられる。処置され得る他の疾患または障害としては、末梢神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病（ハンティングトン病またはＨＤ）または例えば、脱神経、慢性非活動、代謝ストレス、および栄養不良から、あるいは筋ジストロフィー症候群、先天性ミオパシー、筋の炎症性疾患、毒性のミオパシー、神経外傷、末梢神経障害、薬物もしくは毒素誘導性損傷、または運動神経障害のような状態から生じる筋萎縮症が挙げられる。【００４６】１つの実施態様において、本明細書中に記載されるＣＮＴＦまたはＣＮＴＦ関連分子は、ハンティングトン病を処置するために使用される。グルタミン酸レセプター媒介興奮毒性は、ハンティングトン病を含む多くの神経変性疾患または傷害においてある役割を果たすと仮説が立てられていた。ハンティングトン病の優性の神経病理学的特徴は、線条体介在ニューロンの実質的な損失がない、中間サイズのγアミノ酪酸作動性の、線条体出力ニューロンの大量の変性である（Ａｃｈｅｓｏｎ，Ａ．およびＲ．Ｌｉｎｄｓａｙ、１９９４、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：３３３−３４１０）。以下の実施例７において記載されるように、出願人は、動物モデルにおいて、ＣＮＴＦおよび本明細書中に記載される改変体の両方を使用して研究を続けている。ここで、ハンティングトン病で観察された線条体出力ニューロンの優先的な損失、および生じた運動異常は、齧歯類または霊長類モデルで模倣される。この動物モデルにおいてＮＭＤＡグルタミン酸レセプターアゴニストであるキノリン酸が線条体に注射される（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９０、１３：２８６−２８９）。これらの研究において、ＣＮＴＦおよびその改変体は、キノリン酸への曝露に対して防御を与えた。キノリン酸が損傷線条体の外観がＨＤで死んだ患者の線条体の外観と酷似していることは、キノリン酸が、ＨＤの容赦のない、かつ比較的緩慢な進行と矛盾して、急性かつ重篤な病変を生成することを示唆する（この破壊的な神経学的障害の適切な動物モデルを構成する）。【００４７】今日まで、組換えヒトＣＮＴＦ（ｒＨＣＮＴＦ）を使用したヒト臨床治験は、このタンパク質の皮下投与を筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の進行を遅延させることにおいてその有効性を試験する研究に限定されていた。このようなｒＨＣＮＴＦの投与は、咳、食欲不振および体重減少を含む全身的な副作用に関連し、そして少なくとも１つの研究において、ｒＨＣＮＴＦを受ける患者の８０％を超える患者が中和抗体を発生させ、その有意性は不確定である。しかし、副作用および抗体形成を有する問題にもかかわらず、ＡＬＳの初期段階の患者亜群は、これらの患者が類似した疾患期間でのプラシーボ処置患者と比較して、肺機能の低減した割合を示した点において、ｒＨＣＮＴＦ投与から利点を得られたようである。【００４８】出願人が行った、ＣＳＦおよびＡＬＳ患者へｒＨＣＮＴＦの断続的な、区分分けした投与を用いた予備研究は、全身的な副作用および抗体形成の証拠がないことを実証した。このような研究は、標準的な技術を用いて一般的な感覚脱失下で移植した、ＣＳＦをサンプリングするためのサイドポートを伴った、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃによって製造された注入ポンプ（ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ Ｍｏｄｅｌ ８６１５／シリーズＤＡＡ）の使用を含む（Ｐｅｎｎら、１９８５、２：１２５−１２７）。このポンプをクモ膜下カテーテルに取り付け、その先端を蛍光透視法下でＬ１レベルで配置した。各週、４８時間にわたって、１時間当たり１〜８μｇのｒＨＣＮＴＦの投与を、４人のＡＬＳ患者において１年までの期間、許容した。これらの患者は、全身的なｒＨＣＮＴＦ投与でみられた範囲の有害な事象を経験しなかった。この患者群における副作用は、２名の患者の坐骨神経痛および１名の患者の頭痛から構成された。白血球およびタンパク質の上昇がＣＳＦにおいてみられた。この研究において、ｒＨＣＮＴＦは、クモ膜下腔へ注入したバクロフェンおよびモルヒネのような低分子薬物に類似した分布および薬物動態学的特性を示した。不運にも、ｒＨＣＮＴＦは、連続的なＣＮＳ注入治療または局所的デポー投与のためにはあまりにも不安定である。なぜなら、その対形成していないシステイン残基によって共有結合ダイマーを形成し、これによって、凝集形成および沈降を導く傾向にあるからである。従って、中枢神経系に直接注射するために利用され得るＣＮＴＦの安定な調製物についての必要性が存在する。【００４９】Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらとの共同研究において（結果は未公開）、出願人は、ｒｈＣＮＴＦを分泌する、カプセル化されたＢＨＫ細胞を１０名のＡＬＳ患者のクモ膜下腔へ移植した。６ｎｇ／ｍｌまでの定常状態のＣＳＦ濃度を達成した。全ての患者が無力および疲労を訴えたが、体重減少、食欲不振および急性期応答タンパク質の活性化は観察されなかった。ＣＳＦプレオサイトーシスも白血球数の増加も、認められなかった。ＣＮＴＦは、これらの患者の末梢血において検出され得ない。今日まで、有効性測定の結果はあまりに貧弱すぎて、有効性に関する結果を結論づけられなかった。ポンプ注入したｒＨＣＮＴＦでみられる応答と比較して、カプセル化された細胞の移植による、合成されたｒＨＣＮＴＦを受けた患者におけるｈＣＮＴＦに対する炎症性応答の欠失は、ｒＨＣＮＴＦのポンプ送達後にみられる変化が、この特定のタンパク質を取り囲む処方および安定性の問題に十分関連し得ることを示唆する。【００５０】従って、ＣＮＴＦの全身注射を用いて観察された副作用および抗体形成が、ＣＮＴＦもしくはその改変体をＣＮＳへ直接送達することによって避けられ得るという本出願人らの発見と合わせて、ハンティングトン病の当該分野で認識されたモデルにおける線条体ニューロンの細胞外毒素損傷についての保護剤として、ＣＮＴＦおよびその改変体の有効性を実証する動物モデルデータに基づいて、本出願人は、ハンティングトン病を処理する有用な方法を発見した。従って、本出願人の発明は、ＣＮＴＦまたはその改変体の、ＣＮＴＦを分泌する移植細胞または細胞様小胞（例えば、リポソーム）を介するＣＮＳへの直接送達を企図する。あるいは、本明細書中に記載されるＣＮＴＦ改変体（これは、ＣＮＴＦと比較して、改善された安定性および可溶性を有する）は、例えば、上記のＣＮＳへの、浸透圧ポンプを介するＣＮＴＦの送達のための好ましい処方物を提供する。体温での溶液中のｒＨＣＮＴＦの不安定性は、クモ膜下腔または脳室内注入により慢性的に投与されるその能力を妨げるので、本明細書中に記載されるｒＨＣＮＴＦの改変体は、それらの改善された安定性、可溶性、および減少した抗原性を考慮すると、そのような使用のために好ましい。【００５１】従って、本発明は、治療的適用において使用され得る改善された可溶性を有するＣＮＴＦの改変体を企図する。この適用において、例えば、浸透圧ポンプを介した注入が薬物送達のために用いられる。組換えヒトＣＮＴＦ（ｒＨＣＮＴＦ）の可溶性は、生理学的緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ））中では非常に制限されている。さらに、少なくともｐＨ４．５〜８．０の範囲を超える可溶性は、温度およびインキュベーションの時間に強く依存する。５℃では、ＰＢＳ中のｒＨＣＮＴＦの可溶性は、１ｍｇ／ｍｌであり、そして溶液は数時間安定であるが、３７℃では、その安定性は、２時間後にわずか０．１ｍｇ／ｍｌであり、そして４８時間後には０．０５ｍｇ／ｍｌである。この制限された可溶性および熱安定性は、生理学的緩衝液中のｒＨＣＮＴＦの安定な処方を妨害する。このような処方物は、ＣＮＳへの連続投与のために特に所望される。【００５２】カルボキシル末端から最後の１３アミノ酸残基を欠失するｒＨＣＮＴＦ（ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３は、ＲＰＮ１６０またはＲＧ１６０とも呼ばれる）は十分な生物学的活性を保持し、そして低温（５〜１０℃）で少なくとも１２ｍｇ／ｍｌまで可溶性であることが発見された。しかし、このはるかに大きな可溶性にもかかわらず、ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３は、０．１ｍｇ／ｍｌほどの低濃度であっても３７℃で数時間のインキュベーションの際に、ＰＢＳ溶液にさらに不溶になる。【００５３】 ｒＨＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３の熱不安定性が、分子間ジスルフィド結合形成によって開始され、そしてタンパク質濃度および温度に強く依存した凝集の結果であることが決定された。ヒトＣＮＴＦの１７位の単一のシステイン残基をアラニン残基で置換することによって、はるかにより大きな安定性を示し、かつＰＢＳ中３７℃で少なくとも７日間インキュベートした後にそれらの生物学的活性を維持するタンパク質が得られた。この特性は、ｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ改変体において維持され、この改変体は、６３位のグルタミン残基のアルギニンにへの置換に起因してより高い効力を有する。特定の例において、ｒＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，６３ＱＲ，ΔＣ１３（ＲＧ２９７とも呼ばれる）は、６３ＱＲ置換によって、ｒＨＣＮＴＦよりも、より高い生物学的効力を示し、ΔＣ１３欠失のためにより高い可溶性を示し、そして１７ＣＡ置換のためにより高い安定性を示す。【００５４】本発明は、本明細書中に記載するＣＮＴＦまたは改変体の治療的な有効量を用いる、ＨＤを有する患者の処置を意図する。ＣＮＴＦまたはその改変体の有効量は、疾患の進行の遅延を生じる量、または疾患と関連する副作用の減少を生じる量である。処置の効力は、処置を受けないコントロールと比較して、処置の効果を比較することによって測定され得る。ＨＤの臨床経過および天然の経歴は、広範囲にわたって、フィールド研究において（Ｙｏｕｎｇら、１９９６、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２０：２９６〜３０３；ＰｅｎｎｅｙおよびＹｏｕｎｇ、１９９０、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ５：９３〜９９）、臨床的評価機器の開発において（ＳｈｏｕｌｓｏｎおよびＦａｈｎ、１９７９、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２９：１〜３；Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ、ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４；Ｆｅｉｇｉｎら、１９９５、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １０：２１１〜２１４）、およびコンピューター化されたＸ線断層撮影法を使用する疾患の進行の放射線写真法の相関において（Ｔｅｒｒｅｎｃｅら、１９７７、Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ １３：１７３〜１７５；Ｂａｒｒら、１９７８、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２８：１１９６〜１２００；Ｎｅｏｐｈｙｔｉｄｅｓら、１９７９、２３：１８５〜１９１；Ｓｔｏｂｅｒら、１９８４、Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２６：２５〜２８）、磁気共鳴画像法において（Ｇｒａｆｆｏｎら、１９９２、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４９：１１６１〜１１６７）、ならびにポジトロン放出断層撮影技術（Ｈａｒｒｉｓら、１９９６、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：３１６〜３２４）において、両方が特徴付けられてきた。【００５５】ハンティングトン病の進行の臨床的な速度は、ＳｈｏｕｌｓｏｎおよびＦａｈｎ（１９７９、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２９：１〜３）によって開発されたＨＤ機能的容量スケール（ＨＤＦＣ）を使用して評価されてきた。十分に機能的な患者は、このスケールにおいて１３のスコアを受け取る；０のスコアは、全体の不可能性を反映する。Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４。このスケールを用いる、患者の進行の平均速度は、約０．６５単位／年である。Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４；Ｆｅｉｇｉｎら、１９９５、Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １０：２１１〜２１４。このスケールが本当に直線である場合（試験されていない仮説）、この進行の速度は、患者におけるＨＤの症状の平均２０年間の期間によく対応する。ＨＤＦＣスコアは、おおざっぱには５の臨床的段階にグループ分けされ得る（Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４）。【００５６】神経画像化研究は、神経的な損失の正味の病理学的結果、および基本的な神経節構造の結果的な萎縮に集中してきた。ＨＤが進行するにつれて、尾状核は縮み、側方の室に、特徴的な「ボックスカー（ｂｏｘ ｃａｒ）」の外見を与える。尾状核萎縮の程度は、「二尾状核指標（ｂｉｃａｕｄａｔｅ ｉｎｄｅｘ）」を用いて定量され得る。【００５７】磁気共鳴画像法は、ＣＴによって与えられるのと同様の指標を生成するために使用され得る。しかし、比較的新しい技術であるインビボＮＭＲスペクトル測定法は、生きている脳の中の代謝的プロセスを評価する能力を提供する。１つの予備的な研究（Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３：２６８９〜２６９５）は、乳酸の量の増加を検出した。これはおそらく、ＨＤ患者の脳における中間代謝の、神経細胞の損失または欠失のいずれかを反映している。【００５８】ポジトロン放出断層撮影技術（ＰＥＴ）は、生きている患者において行われる機能的な画像化を可能にする。代謝状態の変化は、２−デオキシグルコース（これは、シナプス活性を反映する）または選択された神経の集団を標識する選択的な放射性リガンドの使用によって評価され得る。グルコース代謝の変化の速度、およびハンティングトン病の危険がある個人における尾状核サイズを決定するために、Ｇｒａｆｔｏｎら（１９９２、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．４９：１１６１〜１１６７）は、４２（＋／− ９）ヶ月の間隔をあけて、２回のポジトロン放出断層撮影技術グルコース代謝研究、および２回の核磁気共鳴画像化スキャンを用いて、ハンティングトン病の危険がある１８人の個人を評価した。７例の個体が、ハンティングトン病遺伝子陰性であった；残りは遺伝子試験または研究参加後の舞踏病の発症によって、遺伝子陽性であった。この遺伝子陽性群は、遺伝子陰性群と比較して、尾状核において１年あたりグルコース代謝速度の３．１％の有意な損失を実証した（９５％の信頼区間［ＣＩ］−４．６４、−１．４８）。核磁気共鳴画像化法二尾状核速度において、１年あたり３．６％の増加が存在した（９５％ ＣＩ、１．８１、５．３７）。これは、尾状核萎縮の直線測定であった。しかし、尾状核サイズの変化の速度は、尾状核代謝の変化の速度とは相関しなかった。これは、代謝の損失および萎縮は、独立して発達し得ることを示唆する。従って、連続的なポジトロン放出断層撮影技術または磁気共鳴画像法は、臨床速度スケールにおいて観察されるもの（１年あたり約５％、上記を参照のこと）とはさほど違わない速度の損失の割合を産生し、従って、ＨＤの危険性にある前症状的な個体における実験的な薬理的介入をモニターするための有用な手段であり得る。臨床的な試みは、このような患者集団を組込むように設計されるべきである。【００５９】グルコース代謝のマッピングに加えて、他の放射性リガンドがＨＤにおける線条体完全性をモニターするために使用され得る。例えば、ＨＤにおいて失われた固有の線条体ニューロンは、均一的にドーパミンレセプターを保有するので、ドーパミンレセプターについてのリガンドは、ＨＤの進行をモニターするために使用されてきた。これらの研究は、ＨＤ患者において確かに線条体Ｄ１およびＤ２レセプター両方の平行した減少を示す（Ｔｕｒｊａｎｓｋｉら、１９９５、Ｂｒａｉｎ １１８：６８９〜６９６）。【００６０】同様の代謝的および神経化学的知見が、線条においてキノリン酸で処理した霊長類のＰＥＴ研究において得られてきた。Ｂｒｏｗｎｅｌｌら（１９９４、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２５：４１〜５１）は、３例の非ヒト霊長類の線条体のキノリン酸損傷後、ハンティングトン病の症状に類似した症状が、ドーパミンアゴニスト処理によって誘導され得ることを報告した。すべての動物が、［１９Ｆ］フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース ポジトロン放出断層撮影技術（ＰＥＴ）による尾状核におけるグルコース利用の長期的な４０〜５０％の減少を示した。Ｄ１レセプターについての尾状核−被殻取り込み速度定数は、ニューロンの損失および平均４０〜４８％の減少を反映した。ＰＥＴによって評価されたドーパミン再取り込み部位および線維は、穏やかなニューロン損失を有する領域において一時的な減少を示し、そして重篤な破壊を有する線条体領域においては長期の減少を示した。行動変化および死後の試験において見られる神経病理学と一致したこれらの結果は、ハンティングトン病の患者の臨床研究において観察された結果と類似し、そしてキノリン酸モデルをさらに評価するために働き、そしてこれらの測定がヒトの臨床試験において有用であり得ることを示唆する。【００６１】ＨＤにおける臨床試験は、精神医学的症状および不随意運動についての待機的な症候性の治療の評価に多くは限定されてきた（Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８１、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２９：１〜３）。しかし、強力な神経保護剤を試験する１つの試みが存在した。この試みは、この薬剤が線条中の皮質の線条体末端からのグルタミン酸の放出を減少させ、それによってＨＤの進行を遅らせるという理論に基づく、ＧＡＢＡ−Ｂレセプターアンタゴニストであるバクロフェンの使用を含んだ（Ｓｈｏｕｌｓｏｎら、１９８９、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｉｃｉｔ，ＴＬ Ｍｕｎｓａｔ（編）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ ２７１〜２８４）。この試みの結果は、バクロフェン処理した患者が、試験の３０か月の期間にわたってコントロールよりもよくならなかったという意味で、失敗であった。それにもかかわらず、この試みは、ＨＤＦＣの使用および確認についての確信的な根拠を提供した。この研究の１つの重要な結果は、この研究の患者において疾患の進行の固有の速度が、もともと研究者らによって見積もられた速度のわずか半分であったことである。この情報は、今やこの測定機器を使用する未来の臨床試験の設計において使用され得る。【００６２】現在、ＨＤにおける主要な進行中の臨床試験は存在しない。しかし、臨床試験組織である、ハンティングトン病研究グループが組織され、そしてＨＤにおける臨床試験の実行のためのその場所での構造基盤を有している。このグループは現在、以下を含む種々の臨床試験オプションを研究している。１）中間代謝を増強するためのコエンザイムＱの使用および２）グルタミン酸アンタゴニストおよび／またはグルタミン酸放出ブロッカー（Ｗ．Ｋｏｒｏｓｈｅｔｚ、個人的情報）の使用。同様のグループがヨーロッパで設立され、そしてこのグループは、胎児の線条体移植物の潜在的な効力、および最終的には異種移植の移植物の使用を同様に試験するために、ＰＥＴ方法論を使用する。【００６３】ＨＤにおける疾患の進行を評価するための、確認された臨床的評価機器の利用可能性および相関する放射線画像化測定の存在は、２つの大きな組織化されたマルチセンター臨床試験組織の存在と組み合わせて、ＨＤにおける臨床試験の実施を直接的に行う。【００６４】出願人らは、Ａｘ−１３またはＡｘ−１（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ６３ＱＲΔＣ１３と呼ばれる）として公知の改変されたＣＮＴＦ分子の産生を本明細書中に記載する。これは、６３Ｑ→Ｒ置換（これは、より強力な生物学的能力を有する）を、末端の１３アミノ酸残基の欠失（これは、生理学的条件下で、より高い溶解度を有する）および１７ＣＡ置換（これは、特に３７℃の生理学的条件下で安定性を有する）と組み合わせ、そして動物モデルにおけるｒＨＣＮＴＦよりも２〜３倍良好な治療指数を示す。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた場合、産生される発現されたタンパク質の実質的な部分は、Ｃ末端においてデカペプチドでタグ化されている。このことにより、Ａｘ−１３の精製は困難であり、そして精製されタグ化されていない産物の低収量を生じる。このデカペプチドタグ化は、Ａｘ−１３が哺乳動物発現系において発現された場合には起こらないようである。さらに、このデカペプチドタグは、分子の免疫原性の増加に寄与し得、そしてまた、おそらく安定性についての問題を引き起こし得ることがあり得る。【００６５】しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系の使用は、費用および有効性の見地から好ましい。従って、出願人らは、Ａｘ−１３の改善された強度、可溶性、および安定性特性を保持する一方、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された場合に、デカペプチドタグ化の問題を回避する、切断されたＣＮＴＦ分子の開発に着手した。本明細書中に記載されるように、出願人らはＡｘ−１５（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ６３ＱＲΔＣ１５と呼ばれる）として公知の分子を産生することに成功した。この分子は、Ａｘ−１３の改善された特性を保持するが、これはまた付加されるアミノ酸タグが減少して、Ｅ．ｃｏｌｉによって発現される、追加された利点を有する。従って、この新規な分子Ａｘ−１５は、より高い収率でより容易に精製される利点を有する。さらに、細菌のアミノ酸タグ化が非常に減少しているので、Ａｘ−１５は、Ａｘ−１３によって起こされ得る分子の免疫原性または安定性に関する心配を生じない。【００６６】従って、本発明の目的は、改善された改変された毛様体神経栄養因子分子を提供することである。特に、本発明の１つの実施態様は、Ｃｙｓ１７→Ａｌａ、Ｇｌｎ６３→Ａｒｇの改変、および末端１５アミノ酸残基の欠失を有する改変されたヒト毛様体神経栄養因子である。本発明はまた、本発明の改変されたヒト毛様体神経栄養因子をコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明によってまた意図されるものは、本発明の改変されたヒト毛様体神経栄養因子をコードし、そして発現制御配列に作動可能に連結されている組換えＤＮＡ分子、ならびに組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞である。 この宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得、従って、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、またはＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞であり得る。このような宿主細胞は、改変された毛様体神経栄養因子分子を産生する方法において使用され得る。この方法は以下の工程を含む：（ａ）本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を増殖させ、その結果、そのＤＮＡ分子が宿主細胞によって発現され、本発明の改変された毛様体神経栄養因子分子を産生する工程、および（ｂ）その発現された、改変された毛様体神経栄養因子分子を単離する工程。【００６７】本発明はさらに、本発明の改変された毛様体神経栄養因子分子（Ａｘ−１５）およびキャリアを含む組成物を意図する。【００６８】本発明の別の目的は、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された毛様体神経栄養因子を投与する工程を包含する神経系の疾患または障害を処置する方法を提供することである。処置される疾患または障害は、変性性疾患であり得るか、そして／または脊髄、運動ニューロン、コリン作用性ニューロン、または海馬の細胞を含む。あるいは、処置の方法は、外傷、手術、梗塞、感染、悪性疾患、および毒性因子への暴露からなる群から選択される事象によって引き起こされる神経系への損傷を含む、神経系の疾患または障害の処置をするためであり得る。本発明によってまた意図されるものは、筋萎縮を含む疾患または障害の処置の方法であり得る。【００６９】本発明のさらなる目的は、変性から線条体ニューロンを保護する方法を提供することであり、これは、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された毛様体神経栄養因子の有効量でこの線条体ニューロンを処置する工程を含む。【００７０】本発明によってまた意図されるものは、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された毛様体神経栄養因子の中枢神経系への直接投与を含む、ハンティングトン病の処置の方法である。【００７１】本発明のさらなる目的は、本明細書中ではＡｘ−１５と記載される改変された毛様体神経栄養因子の哺乳動物への投与を含む、哺乳動物における体重損失を誘導する方法を提供することである。本発明の特定の実施態様は、ヒトにおける体重損失を誘導する工程を含む。【００７２】Ａｘ−１５の投与方法は、遺伝的に決定された起源の病的な肥満または肥満の処置において使用され得る。本明細書中で記載されるＡｘ−１５はまた、ヒトにおける妊娠発症糖尿病または成人発症糖尿病の発生を予防／または処置する方法において使用され得る。【００７３】Ａｘ−１５の投与を含む上記の方法のいずれかは、静脈内、筋肉内、皮下、クモ膜下腔、脳室内、および実質内からなる群から選択される送達の経路を介して、Ａｘ−１５を投与することによって実行され得る。あるいは、Ａｘ−１５は、改変された毛様体神経栄養因子を放出する細胞の移植を介して投与され得る。【００７４】本発明はまた、神経系への損傷から生じる疾患または障害を意図し、ここでこのような損傷は、外傷、手術、梗塞、感染、および悪性疾患によって、または、毒性因子への暴露によって引き起こされ得る。【００７５】本発明はまた、適切な薬理学的キャリアにおいて、単一の治療剤として、またはＣＮＴＦレセプターとの複合体において、本明細書中に記載されるように、改変されたＣＮＴＦ分子またはそのハイブリッドもしくはその変異体を含む、薬学的組成物を提供する。【００７６】本明細書中に記載されるＣＮＴＦ分子または改変されたＣＮＴＦ分子を含み得る活性成分は、任意の適切な経路（以下を含むがこれらに限定されない：実質内、心室内または脳室内送達）によるまたは徐放性移植物（例えば、公開出願、１９９６年２月１日に公開されたＷＯ９６／０２６４６、１９９５年１０月２６日に公開されたＷＯ９５／２８１６６、または１９９５年２月２３日に公開されたＷＯ９５／５０５４５２に記載されるような、細胞または組織移植物を含む）によるインビボでの投与のために適切な薬学的キャリア中で処方されるべきである。【００７７】投与の様式に依存して、活性成分は、液体キャリア（例えば、生理食塩水）中に処方され得るか、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー、またはワックスに基づきそして制御された放出調製物に組込まれ得る。好ましい実施態様において、改変されたＣＮＴＦ調製物は、安定であるか、または錠剤、丸薬、もしくはカプセル形態に処方される。【００７８】処方物において使用される活性成分の濃度は、必要とされる有効用量および使用される投与の様式に依存する。使用される用量は、有効である活性成分の循環血漿濃度を達成するに十分であるベきである。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量−反応曲線から外挿され得る。有効用量は、約．００１〜約１ｍｇ／日の範囲内にあることが予測される。【００７９】（実施例）（実施例１−改変ヒトＣＮＴＦ分子の電気泳動の移動度）（材料と方法）（改変ＣＮＴＦ分子の調製）（細菌株およびプラスミド）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＲＦＪ２６は、ラクトースオペロンリプレッサーを過剰産生する株である。【００８０】ヒトＣＮＴＦ遺伝子およびｐＲＰＮ１１０（これは、ラットＣＮＴＦ遺伝子を保有する）を保有する発現ベクターｐＲＰＮ３３は、ほぼ同一である（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月４日に公開された、国際公開番号ＷＯ ９１／０４３１６）。【００８１】プラスミドｐＲＰＮ２１９を、制限酵素Ｎｈｅ１プラスＨｉｎｄ３を用いたｐＲＰＮ３３の最初の消化、および４，０８１ｂｐのフラグメントのゲル精製により構築した。第２に、ヒトＣＮＴＦ遺伝子の部分をコードする、ずっと小さいフラグメントを、引き続き、ＲＡＴ−ＩＩＩ−ｄｎｉＨプライマー：５’ＡＣＧＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣ ３’；およびＲＡＴ−Ｎｈｅ−Ｉ−Ｍプライマー：５’ＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣ ＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＧＴＴＣＡ ＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧ ＣＴＣＴＴＡＣＧ ３’を用いたラット遺伝子からのＰＣＲ増幅により得た１６７ｂｐのＮｈｅ１−Ｈｉｎｄ３フラグメントで置換した。【００８２】プラスミドｐＲＰＮ２２８は、１６７ｂｐの置換フラグメントをＤＮＡプライマーＲａｔ−ＩＩＩ−ｄｎｉＨ−Ｌ−Ｒ：５’ＡＡＧ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＴＣ ＣＡＡ ＣＧＡ ＴＣＡ ＧＴＧ ３’およびＲａｔ−Ｎｈｅ−Ｉ：５’ＴＣＴ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＧＣＡ ＡＧＧ ＡＡＧ ３’を用いて増幅したこと以外は、ｐＲＰＮ２１９と同じ様式で構築した。【００８３】プラスミドｐＲＰＮ１８６、ｐＲＰＮ１８７、ｐＲＰＮ１８８、ｐＲＰＮ１８９、ｐＲＰＮ１９２、ｐＲＰＮ２１８およびｐＲＰＮ２２２を、類似の方法により、または図１に示した特有の制限部位を用いるＤＮＡフラグメントの直接交換により生成した。【００８４】すべてのプラスミドの同一性を、制限解析およびＤＮＡ配列決定により確認した。【００８５】（タンパク質精製）タンパク質合成の誘導、選択的抽出、可溶化および封入体からの精製は、ラットおよびヒトＣＮＴＦについて記載された（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月４日公開、国際出願番号ＷＯ９１／０４３１６）。ただし、イオン交換クロマトグラフィーにかわって、または追加してゲル濾過を時に用いた。あるいは、タンパク質は、他のタンパク質について記載（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５０６６〜１５０６９）のように、ストレプトマイシンおよび硫酸アンモニウム分画により、次にカラムクロマトグラフィーにより細胞溶解物の上清から精製した。すべてのタンパク質を、少なくとも６０％の純度まで単離した。【００８６】酵素反応、ＤＮＡ電気泳動、およびこれらの研究で用いられる他の技術のための条件は、詳細に記載されている（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．１９８７，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｒｄｙ，Ｋ．Ｇ．編）１６３〜１７６頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）。【００８７】（結果）還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおけるヒト、ラットおよびいくつかのキメラＣＮＴＦ分子の移動度を、図２に示す。キメラ分子ＲＰＮ１８６、ＲＰＮ１８９、ＲＰＮ２１８およびＲＰＮ２２８は、ラットＣＮＴＦに匹敵する移動度を示す、一方、ＲＰＮ１８７、ＲＰＮ１８８、ＲＰＮ１９２およびＲＰＮ２２２は、ヒトＣＮＴＦに匹敵する移動度を示す。図１におけるこれらのタンパク質の整列配列に対するこれらの結果の相互参照は、６３位（Ｒ６３）でアルギニン残基を保有するすべてのタンパク質がラットＣＮＴＦの移動度を示すことを明らかにする。ＲＰＮ２２８の場合、単一アミノ酸置換（Ｑ６３−＞Ｒ）は、ヒトＣＮＴＦに対してラットＣＮＴＦの正常な移動度を与えるのに十分である。【００８８】図２はまた、異なる組換えタンパク質の純度測定を提供する。視覚的検査により、純度は、ＲＰＮ１８９についての６０％からＲＰＮ２２８についての９０％より良好まで変化する。【００８９】（実施例２−改変ＣＮＴＦ分子の結合活性の測定）（材料および方法）（１２５Ｉ−ＣＮＴＦの調製）３７μｌの０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中の組換えのラットＣＮＴＦ（２８μｇ）を、窒素の穏やかな流れのもとで乾燥された４ｍＣｉ（２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ；ＮＥＮ）の125Ｉおよび試薬（ＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ，１９７３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１３３：５２９〜５３９）を含有するバイアルに移した。反応物を、０℃で４５分間、続いて室温で１５分間インキュベートし、そして３０ｍｌの０．２Ｍグリシン溶液の添加により停止した。１５分後、０．０８％ゼラチンを含む０．２ｍｌＰＢＳをまた添加し、そしてこの混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させ、二量体誘導体および他の多量体誘導体から標識単量体ＣＮＴＦを分離した。組み込みのパーセンテージは、代表的には、薄層クロマトグラフィーにより決定されたように２０％であり、そして比活性は、代表的には約１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅであった。単量体125Ｉ−ＣＮＴＦは、４℃で保管し、そして調製後１週間までに使い切った。構造的整合性および立体配置的な整合性の試験として、125Ｉ−ＣＮＴＦ（およそ、１０，０００ｃｐｍ）を５μｇの未標識のＣＮＴＦと混合し、そして未変性のゲル電気泳動により分析した。１つのメジャーなバンドがクマシー染色またはオートラジオグラフィーのいずれかによって見られた。125Ｉ−ＣＮＴＦはまた、培養においてＥ８ニワトリ毛様体（ｃｈｉｃｋ ｃｉｌｉａｒｙ）神経細胞の生存の支持において、天然のＣＮＴＦと匹敵する活性を示した。【００９０】（組織培養技術）新生仔ラット由来の上頸神経節（ＳＣＧ）を、トリプシン（０．１％）で処理し、機械的に分離し、そしてポリ−オルニチン（３０μｇ／ｍｌ）基層に置いた。増殖培地は、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）含有Ｈａｍ’ｓ栄養混合物Ｆ１２、神経発育因子（ＮＧＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）から構成された。培養物は、加湿した９５％空気／５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で維持した。神経節の非神経細胞を培養の第１および３日目にａｒａＣ（１０μＭ）での処理により取り除いた。培養には、３回／１週給餌し、そして２週間以内に結合アッセイに慣用的に用いた。【００９１】ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲは、ヒトＣＮＴＦαレセプター遺伝子で形質転換した線維芽細胞株である（Ｓｑｕｉｎｔｏら，１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ ５：７５７〜７６６；Ｄａｖｉｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９〜６３）。【００９２】（結合アッセイ）結合を、細胞単層で直接実施した。培養ウエル中の細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）、０．１ｍＭバシトラシン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡからなるアッセイ緩衝液で１回洗浄した。室温での２時間の125Ｉ−ＣＮＴＦとのインキュベーションの後、細胞をアッセイ緩衝液で２回すばやく洗浄し、１％ＳＤＳ含有ＰＢＳで溶解し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒで計数した。非特異的な結合を未標識のＣＮＴＦの１，０００倍過剰の存在下で決定した。ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲへの特異的結合は、８０〜９０％であった。データは、ＧＲＡＰＨＰＡＤプログラム（ＩＳＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を用いて解析した。【００９３】（結果）ラットＳＣＧ神経細胞への結合についての125Ｉ−ラットＣＮＴＦに対する精製組換えヒト、ラットおよびＣＮＴＦ ＲＰＮ２１９の競合カーブを図４ａに示す。ラットＣＮＴＦおよびヒトＣＮＴＦの両方は、ＳＣＧ神経細胞への結合について125Ｉ−ラットＣＮＴＦと競合するが、ヒトＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝２５ｎＭ）は、未標識ラットＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝０．２８ｎＭ）よりも125Ｉ−ラットＣＮＴＦ結合への置換が９０倍弱い。対照的に、ＲＰＮ２１９は、ラットＣＮＴＦとほぼ同等に強力であり、そしてヒトＣＮＴＦより明確により強力である（ＩＣ５０＝０．３ｎＭ）。【００９４】同様の結果を、ヒトＣＮＴＦレセプターの発現を指向するプラスミドで形質転換されたマウス線維芽細胞を用いた競合実験から得た（図４ｂ）。ラット、ヒトおよびＲＰＮ２２８の両方は、ＭＧ８７／ＣＮＴＦＲ細胞への結合について125Ｉ−ラットＣＮＴＦと競合する。ヒトＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝３０ｎＭ）は、ラットＣＮＴＦ（ＩＣ５０＝２.８ｎＭ）よりも１２倍弱いが、一方、ＲＰＮ２２８は、ヒトタンパク質よりも明白により強力である（ＩＣ５０＝５．６ｎＭ）。【００９５】図１に示された他の改変ＣＮＴＦタンパク質を用いた競合結合実験はまた、Ｒ６３を有するタンパク質がラットＣＮＴＦの生物学的活性を示し、一方、Ｑ６３を有するタンパク質がヒトＣＮＴＦの結合特性を示したことを実証する（データ示さず）。これらの結果は、単一アミノ酸置換（Ｑ６３−＞Ｒ）がヒトＣＮＴＦに対して、ラットＣＮＴＦの特徴であるレセプター結合特性を与えるのに十分であることを示す。【００９６】（実施例３−改変ＣＮＴＦ分子の生物学的活性の測定）（材料および方法）組換えＣＮＴＦを、記載されているように（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月４日公開、国際公開番号 ＷＯ９１／０４３１６）、ニワトリ毛様体神経節（ＣＧ）神経細胞の分離培養においてアッセイした。ただし、生存細胞はＭＴＴで染色した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．１９８３；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５〜６３）。【００９７】（結果）図３は、精製した組換えヒト、ラットおよび改変ＣＮＴＦタンパク質ＲＰＮ２１９およびＰＲＮ２２８についてのＥ８ニワトリ胚毛様体神経節の分離され、神経細胞富化された培養物の用量反応曲線を示す。このアッセイにより、キメラタンパク質の生物学的活性は、精製組換えラットＣＮＴＦの活性と識別不能であり、そして組換えヒトＣＮＴＦの活性より明白に高い。図３の用量反応曲線の比較はまた、ＲＰＮ２１９、ＲＰＮ２２８またはラットＣＮＴＦで得られた生存神経細胞の最大レベルが、ヒトＣＮＴＦで得られたレベルより高いことを示す。これらの結果は、ラットＣＮＴＦのようにＲＰＮ２１９およびＲＰＮ２２８がヒトＣＮＴＦよりも神経細胞のより大きい集団に対して活性であることを示唆する。並行した実験において、図１に示される他の改変ＣＮＴＦタンパク質の生物学的活性を試験した。どの場合においても、置換（Ｑ６３→Ｒ）を保有する改変ＣＮＴＦタンパク質は、ラットＣＮＴＦの生物学的活性を示し、一方、Ｑ６３を有するタンパク質は、ヒトＣＮＴＦの活性を示した（データ示さず）。【００９８】全般に、これらの結果は、単一のアミノ酸置換（Ｑ６３→Ｒ）がヒトＣＮＴＦにラットＣＮＴＦの生物学的活性を与えるのに十分であることを示す。【００９９】（実施例４：光誘導性光受容器損傷を防ぐ改変ＣＮＴＦの使用）Ｆ３４４またはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系統のいずれかのシロネズミを２〜５月齢で用いた。このラットを定常光に曝露する前、９日以上、周期的な光環境（２５ｆｔ−ｃ未満のケージ内照度で、１２時間オン：１２時間オフ）において維持した。このラットをケージの床上６０ｃｍに吊るした白色反射板で２つの４０ワットＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ「ｃｏｏｌ−ｗｈｉｔｅ」蛍光電球により提供される１１５〜２００ｆｔ−ｃの照度レベル（ほとんどのラットは１２５〜１７０ｆｔ−ｃを受けた）で定常光に１〜２週間曝露した。光曝露の間、ラットをステンレス鋼ワイヤー棒カバーを備える透明なポリカーボネートケージに維持した。【０１００】定常光曝露の２日前、ケタミン−キシラジン混合物で麻酔したラットに１μｌのラットＣＮＴＦ、ヒトＣＮＴＦまたは改変ＣＮＴＦ［ｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ）］（０．１〜５００ｎｇ／μｌの濃度でリン酸緩衝液化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解している）を硝子体内に注射した。この注射は、眼の鋸状縁と赤道との間のほぼ中心経路の強膜、脈絡膜および網膜を通じた３２ゲージの針の挿入を用いて行った。すべての場合、注射は、眼の上位半球に行った。【０１０１】定常光の曝露直後、そのラットを二酸化炭素の過剰投与により屠殺し、直後に混合アルデヒドを血管灌流した。眼を眼の垂直経線にそった全網膜の切片を提供するための１μｍの厚さに切片化するためにエポキシリジンに埋め込んだ。光誘導性網膜変性の程度を、０〜４＋の病理学スケールのレスキューによる光受容体レスキューの程度を評価することにより定量した（ここで４＋は、最大レスキューであり、そしてほとんど正常な網膜整合性である）。同じラットにおけるコントロールの眼との比較に基づいて、それぞれの切片における光受容体レスキューの程度を、４人の個人によりスコアづけした。この方法は、ＯＮＬの厚さだけでなく光受容器内側および外側セグメントに対するよりわずかな変性的変化ならびに眼の内部における空間的な変性性勾配を考慮する利点を有する。３つの眼を、用量反応曲線を生成するために、それぞれの時間点について試験した。【０１０２】（結果）レスキューの程度を、ヒト、ラットおよびｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ）について測定した。このデータは、ラットおよびｈＣＮＴＦ（Ｑ６３→Ｒ）の両方が組換えヒトＣＮＴＦがレスキューするよりも光損傷モデルにおいて光受容体をレスキューする能力が１０倍大きいことを示した。【０１０３】好ましい特定の実施態様と組み合わせて、本発明が上記で記載される場合、その詳細な説明および実施例は、例証を意図し、そして添付の請求の範囲の範囲により規定される本発明の範囲を制限しないことが理解される。【０１０４】（実施例５）（材料と方法）組換えヒトＣＮＴＦ改変体を、以前に記載（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月４日公開、国際公開番号ＷＯ９１／０４３１６；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００〜１９００３）のように、遺伝子的に操作し、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、そして９０％より大きい純度で回収した。【０１０５】以下の保存溶液を５℃でＰＢＳ中に新鮮に調製した。ｒＨＣＮＴＦ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５ｍｇ／ｍｌＲＧ１６０（ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３）・・・・・・・・０．５ｍｇ／ｍｌＲＧ１６２（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ、ΔＣ１３）・・・０．５ｍｇ／ｍｌＲＧ２９０（ｒＨＣＮＴＦ、６３ＱＲ、ΔＣ１３）・・・１．２ｍｇ／ｍｌＲＧ２９７（ｒＨＣＮＴＦ、１７ＣＡ、６３ＱＲ、ΔＣ１３）０．４ｍｇ／ｍｌ。【０１０６】３７℃での生理学的緩衝液におけるｒＨＣＮＴＦおよびいくつかの誘導体の安定性を決定するために、保存溶液を５℃でＰＢＳに対して徹底的に透析し、０．１ｍｇ／ｍｌまでＰＢＳで希釈し、そして濾過により滅菌した。アリコート（０．２ｍｌ）を、０．５ｍｌ容積のポリプロピレン遠心チューブに移した。このチューブを３７℃のインキュベーターに入れ、そして指示された時間で個々のチューブを取りだし、そして室温で３分間１５，０００ｒｐｍで遠心し不溶性の沈査から可溶性のタンパク質を分離した。上清をピペットでとり、２×タンパク質ゲルサンプル緩衝液の等量を含有するきれいなチューブに入れ、２分間、８５℃の水槽に置き、混合し、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析まで−２０℃で保管した。ペレットを水の１／１０のもとの容量に再懸濁し、２×タンパク質ゲルサンプル緩衝液の等量と混合し、そして上記のように処理した。【０１０７】Ｅ８ニワトリ毛様体神経細胞での生物学的活性のアッセイのため、およびタンパク質ゲル電気泳動のための方法は記載されている（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３〜１０１２および１９９１年４月４日公開、国際公開番号ＷＯ９１／０４３１６；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００〜１９００３）。タンパク質ゲルサンプル緩衝液（２×）は、１２．５ｍｌのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８−２０ｍｌ グリセロール−４０ｍｌの１０％ＳＤＳおよび５ｍｇのブロモフェノールブルー（１００ｍｌあたり）からなる。【０１０８】（結果）ｒＨＣＮＴＦの溶解度は、中性のｐＨで生理学的緩衝液においてとくに制限される。さらに、広いｐＨ範囲（４．５〜８．０）にわたる溶解度は、温度およびインキュベーション時間に強く依存する。５℃で、ＰＢＳにおけるｒＨＣＮＴＦの溶解度は、１．４ｍｇ／ｍｌであり、そしてタンパク質は２〜３時間溶液中に存在する。ｒＨＣＮＴＦの制限された溶解度と明白に対照的に、改変ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３は、５℃で少なくとも１２ｍｇ／ｍｌに濃縮され得る。しかし、このより大きい溶解度にかかわらず、ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３はなお、生理学的な緩衝液、ｐＨおよび温度条件において強い不安定性を示す。３７℃でのインキュベーションの際に、ｒＨＣＮＴＦ、ΔＣ１３は、最初の濃度に依存する速度で溶液から析出する。【０１０９】この不安定性の原因を決定するために、本発明者らは、並行実験において、ｒＨＣＮＴＦおよびいくつかの改変体の物理的完全性を分析した。図５は、生理的緩衝液中での、３７℃、０、２、７および１４日間のｒＨＣＮＴＦのインキュベーション（それぞれ、レーン１〜４）が、上清由来のタンパク質の進行性の消失を引き起こし、ペレットにおいて、同時の進行性の出現を伴うことを示す。さらに、ペレット中の良好な割合のｒＨＣＮＴＦが、二量体ｒＨＣＮＴＦの大きさに対応する４８ｋＤの種として現れた（図５、二重矢印）。より長いインキュベーション時間で、少ない割合のより高次の凝集体もまた、明らかになった。しかし、同じサンプルを同じ型のゲル上ではあるが、ジスルフィド還元剤の存在下で分析した場合、４８ｋＤの種は、単量体ｒＨＣＮＴＦに転換され、このことは、４８ｋＤの種が、ジスルフィド結合によって共有結合的に結合するｒＨＣＮＴＦの二量体を表すことを証明する。このような二量体は、ｒＨＣＮＴＦの唯一のシステイン残基を介して形成することが予期された。従って、これらの結果は、３７℃でのｒＨＣＮＴＦの不安定性が、分子間ジスルフィド結合の形成によって引き起こされる凝集によって生じることを示した。【０１１０】同様の結果を、２つのｒＨＣＮＴＦ改変体、ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３、およびｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ，ΔＣ１３を用いて得た（ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３の場合で、ペレット中の不溶性凝集体の出現が幾分遅かったことを除く）（図５）。ΔＣ１３欠失がｒＨＣＮＴＦに生理的緩衝液中でのより高い可溶性を与えるという事実を考慮すると、ｒＨＣＮＴＦ，ΔＣ１３の改善された安定性は、おそらく、そのより高い可溶性の間接的な結果である。【０１１１】 ３７℃でのｒＨＣＮＴＦの不安定性が、分子間ジスルフィド結合の形成により引き起こされる凝集によリ生じるという可能性をさらに試験するために、１７位の唯一のシステイン残基を、確立された遺伝子操作方法論を使用して、アラニンに置換した。このプロセスによって生成された、２つのｒＨＣＮＴＦ改変体、ｒＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，ΔＣ１３およびｒＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，６３ＱＲ，ΔＣ１３を、非還元的な１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同じ分析に供した。図５は、３７℃で１４日間のインキュベーション後でさえ、両方のタンパク質が、明らかな二量体化または凝集体形成を伴なわず、可溶性のままであったことを示す。ペレット中に見出された少ない割合のタンパク質（それはほとんど、上清の除去後の遠心管に残存している少量の可溶性タンパク質を示した）においてでさえ、二量体化がほとんど明らかにならなかった。これらの結果は、ｒＨＣＮＴＦの不安定性が、分子間ジスルフィド結合の形成によって引き起こされる凝集によって生じるという結論を確証し、そして他のｒＨＣＮＴＦ改変体（例えば、ＲＧ２９７）における遊離の−ＳＨ官能基の除去がまた、より高い安定性を生じることを実証した。【０１１２】３７℃でのインキュベーション後の溶液中に残存するタンパク質が、依然生物学的に活性であるか否かを試験するために、サンプルを、ニューロン生存活性について分析した。図６は、標準の、未処置のストック溶液、ならびに３７℃で７日間、インキュベーションした４つのｒＨＣＮＴＦ改変体を用いて得られた、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコントロール濃度の応答曲線を示す。後者に関して、１７ＣＡ変異を有するタンパク質、ＲＧ２９７およびＲＧ１６２を、それらの名目上の濃度でアッセイしたが、一方ＲＧ２９０およびＲＧ１６０は、溶液中に残存するタンパク質の量に対して、それらの濃度を補正した後にアッセイした。図６は、これらの化合物により提示された濃度応答曲線が、これらのタンパク質がそれらの完全な活性形態にあることから予期される曲線であることを示す：以前に観察された（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）ように、そして図７に示されるように、ＲＧ１６０およびＲＧ１６２は、実験的誤差内で、ｒＨＣＮＴＦと同じ効力を示すが、６３ＱＲ置換を有するＲＧ２９０およびＲＧ２９７は、ｒＨＣＮＴＦより４〜５倍高い効力を示す。従って、ｒＨＣＮＴＦおよびその誘導体の３７℃で７日間のインキュベーションは、生物学的活性の損失を生じず、二量体化後の沈殿によるタンパク質の損失のみを生じる。【０１１３】（実施例６）（材料および方法）（タンパク質の操作および精製）−以下のｒＨＣＮＴＦ改変体をｒＨＣＮＴＦと比較した：ＲＧ２２８（ｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ）；ＲＧ２９７（ｒＨＣＮＴＦ，１７ＣＡ，６３ＱＲ，ΔＣ１３）；ＲＧ２４２（ｒＨＣＮＴＦ，６３ＱＲ６４ＷＡ）。【０１１４】これらのタンパク質を、ｒＨＣＮＴＦについて記載された方法論（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５７：１００３−１０１２および１９９１年４月４日に公開された、国際公開番号ＷＯ９１／０４３１６；Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）によって、遺伝子的に操作して、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、そして９０％より高い精製度で回収した。【０１１５】（生物学的活性アッセイ）−Ｅ８ニワトリ毛様体ニューロンに対する生物学的活性アッセイの方法は、記載されている（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）。【０１１６】（薬物動態の決定）−ラットを、ｒＨＣＮＴＦ（ｎ＝１）およびＲＧ２４２（ｎ＝２）を１００μｇ／ｋｇで、ならびにＲＧ２２８（ｎ＝１）を２００μｇ／ｋｇｄで、静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。ラットをまた、ｒＨＣＮＴＦ（ｎ＝２）、ＲＧ２４２（ｎ＝２）およびＲＧ２２８（ｎ＝１）を２００μｇ／ｋｇで、皮下（ｓ．ｃ．）に注射した。血液試料を、投薬前および投薬後の種々の時点で収集し、そして血漿を得るために処理した。血漿試料を、げっ歯目血漿のためのｒＨＣＮＴＦ ＥＬＩＳＡ方法（Ｄ．Ｂ．Ｌａｋｉｎｇｓら、ＤＳＥＲ９３／ＤＭＡＰ／００６、「８つの投薬レベルでの皮下投与後の、ラットにおけるｒＨＣＮＴＦの容量比例性および絶対的なバイオアベイラビリティ」（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．９２０８４７）１９９３年１１月１０日）を使用して分析した。【０１１７】血漿濃度は、非区画技術を使用して評価した。各化合物に対する標準曲線は、各アッセイプレートについて含まれ、そしてそれを使用して、そのプレート上で分析した試料に存在するその化合物の量を計算する。このアッセイの感度は、化合物間で２倍未満まで変化した。【０１１８】（インビボでの効力および毒性の決定）−体重約２２０ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、手術前に麻酔した。右坐骨神経を、膝のレベルで切除し、そして神経の５ｍｍのセグメントを取り出した。偽手術を、各動物の左側で行った。手術後の朝に開始して、ラットを計量し、ビヒクル（ＰＢＳまたは乳酸／リン酸／マンニトールのいずれか、ｐＨ４．５）、あるいは試験されるｒＨＣＮＴＦ化合物（０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の容量で同じビヒクルに溶解させた）を皮下投与した。ラットを、１週間の間、毎日計量し、そして注射し、その時点で、ラットを屠殺して、そしてそのヒラメ筋を解剖して、そして計量した。各動物の左ヒラメ筋（偽）に対する右ヒラメ筋（除神経した）の湿重量の比を計算して、除神経により生じた萎縮症の程度および各化合物での処置によるそれらの防止を評価した。毒性の評価に関しては、その体重を、ビヒクルで処置したラットの体重増加のパーセントとして計算した。両方のビヒクル溶液は、萎縮症および体重増加において同様の結果を生じた。【０１１９】（結果）（インビトロでの生物学的活性）−ｒＨＣＮＴＦのインビトロでの活性を特徴付けるために、本発明者らは、原発性の解離したＥ８ニワトリ毛様体ニューロンの生存の媒介に対するその効果を測定した。漸増濃度の種々のヒトＣＮＴＦ改変体に対する応答におけるニューロン生存を、図６、７および８に示す。６３ＱＲ置換を有する改変体ＲＧ２２８（図７）およびＲＧ２９７（図８）は、ｒＨＣＮＴＦより４〜５倍のより高い効力を示したが、改変体ＲＧ２４２は、それが６３ＱＲ置換を有しているという事実にもかかわらず、ｒＨＣＮＴＦより１０倍弱い効力を示した。従って、ＣＮＴＦ配列の種々の位置での種々のアミノ酸側鎖の導入は、インビトロでの原発性ニューロンの生存に対して、非常に異なる効果を有し、それは、ｒＨＣＮＴＦと比較した、活性の大きな損失〜強い増大まで変化させる。【０１２０】（薬物動態）−化合物のセットのインビトロでの生物学的効力を、それらのインビボでの薬物動態学的効力に相関させる試みの前に、同じ動物モデルでのその絶対的なバイオアベイラビリティを決定することが有用である。以下に記載の実験において、静脈内投与後の配置動態、ならびにＲＧ２２８およびＲＧ２４２の皮下投与後の絶対的なバイオアベイラビリティを決定して、ｒＨＣＮＴＦのそれらに対して比較した。【０１２１】ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の静脈内投与後のラットにおける平均血漿濃度時間プロフィールを、図９に示す。これらは、３つ全ての化合物について１００μｇ／ｋｇ用量に正規化されている。平均薬物動態パラメーターを表１に要約する。【０１２２】ラットに対する静脈内投与後、ＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦおよびＲＧ２２８よりも幾分速い分布相αを有した。ＲＧ２４２およびＲＧ２２８についての配置相βは、ｒＨＣＮＴＦのそれよりも速い。従って、ＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦよりも幾分より迅速に体内に分布され、そして全身循環から排出されるようであったが、ＲＧ２２８は、ｒＨＣＮＴＦと同じ速さで体内に分布され、そして幾分速く全身循環から排出されるようであった。ＲＧ２４２についての濃度時間曲線下の領域（ＡＵＣ）は、ｒＨＣＮＴＦのそれに匹敵し、これは、全身のクリアランス（ＣｌT）が、２つの化合物についてほぼ同じであったことを示す。２倍大きい領域が、ＲＧ２２８で観察された。しかし、βおよびＡＵＣの両方の関数である、分布の見かけ上の容量（Ｖarea）は、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の両方について、ｒＨＣＮＴＦと比較して約２倍小さかった。これは、これらの改変体があまり広くは分布されていないことを示唆する。これらの推測で使用された限定数の動物は、これらの値の定量的区別を可能にしなかった。しかし、これらの結果は、静脈内投与後のＲＧ２２８およびＲＧ２４２の分布ならびに配置動態が、ｒＨＣＮＴＦのそれらと実質的に異ならないことを明らかに示す。【０１２３】皮下投与後、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦと比較して、２〜３倍長い吸収相（Ｋａ）を有した（図１０および表２）。ＲＧ２４２の配置相はまた、幾分長い。静脈内注入後と比較した、皮下投薬後のＲＧ２４２のより長い明らかな末端配置相は、静脈内注入後の末端相の不完全な特徴付けに起因され得る。全体的には、２つの以前の独立した研究において、ｒＨＣＮＴＦの絶対的なバイオアベイラビリティは、１４．２％（ｎ＝１８）および７．５％（ｎ＝８）であると見出されたという事実（Ｄ．Ｂ．Ｌａｋｉｎｇｓら、ＤＳＥＲ ９３／ＤＭＡＰ／００６，「８つの投薬レベルでの皮下投与後の、ラットに皮下投与したｒＨＣＮＴＦの容量比例性および絶対的なバイオアベイラビリティ」（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．９２０８４７）１９９３年１１月１０日；Ｄ．Ｂ．Ｌａｋｉｎｇｓら、ラットに皮下投与されたｒＨＣＮＴＦの容量比例性および絶対的なバイオアベイラビリティ、ＡＡＰＳ Ｎｉｎｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９４年１１月）を考慮すると、ＲＧ２２８の絶対的なバイオアベイラビリティ（１３．７％）およびＲＧ２４２の絶対的なバイオアベイラビリティ（１０．９％）は、ｒＨＣＮＴＦのそれ（６．０％）に匹敵する。従って、ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２のバイオアベイラビリティは、実験的誤差内で有意に異ならない。【０１２４】（インビボでの効力および毒性）−コントロール実験において、ヒラメ筋の除神経は、７日までに筋肉湿重量の４０％の損失を生じた。この値は、非常に正確であり、かつ再現性がある。なぜなら、それは、独立した実験の間で、ただ３％までしか変化しないからである。ｒＨＣＮＴＦの毎日の投与は、ＥＤ50＝０．１２ｍｇ／ｋｇで筋肉湿重量の容量依存性のレスキューを生じ、０．３ｍｇ／ｋｇで最大効果を生じた（図１１）。同時に、動物が、これらの実験の過程の間で体重を増加し続けた場合でも、その動物は明らかに、それらのビヒクル処置した対照と、特に最大の有効用量で、同じくらい多く増加しなかった（ｐ＜０．０１；図１２）。【０１２５】ｒＨＣＮＴＦで並行して行なわれたいくつかの実験の過程において、６３ＱＲ置換は、インビボでの効力で２倍の増加を生じた（図１１）が、また毒性においても同時に２倍の増加を生じたことが決定された（図１２）。対照的に、さらなるＣ１７ＡおよびΔＣ１３改変を有するＲＧ２９７は、ｒＨＣＮＴＦと比較して２．６倍のより大きな効力を示すが、同じ毒性を示す。最後に、ＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦと比較して、２．８倍の増加した効力、および２．４倍減少した毒性を生成した。これらの結果を、表３に要約する。【０１２６】これらの化合物の各々に対する相対的治療的指数（Ｔ．Ｉ．）を、ＴＤ25おおびＥＤ50値の比として計算し、ｒＨＣＮＴＦの値に対して正規化した。ＲＧ２２８のＴ．Ｉ．は、ｒＨＣＮＴＦの値と等しいが、ＲＧ２９７およびＲＧ２４２のＴ．Ｉは、ｒＨＣＮＴＦの値より、それぞれ、２．５倍および６．８倍優れている。【０１２７】従って、ＲＧ２９７およびＲＧ２４２は、ｒＨＣＮＴＦより優れた薬理学的特性を有する。これは、ヒトにおけるｒＨＣＮＴＦ処置の際に、体重の減少が観察される臨床状況に非常に適切である。【０１２８】当業者は、ＣＮＴＦのアミノ酸配列における他の変更が、増強された特性を有し得る生物学的に活性な分子を生じ得ることを認識する。例えば、出願人は、１７位のシステイン残基の代わりにセリン残基を有し、そして生物学的に活性である１７ＣＳ変異体を調製した。出願人はまた、生物学的に活性な、４重の変異体、１７ＣＡ，ΔＣ１３，６３ＱＲ，６４ＷＡを調製した。さらなるＣＮＴＦ変異体（その全てが生物学的活性を保持する）を、表４に示す。【０１２９】【表１】【０１３０】【表２】【０１３１】【表３】【０１３２】【表４】（実施例７−ハンティングトン病の動物モデルにおけるＣＮＴＦおよび改変体の効力）（背景）グルタミン酸レセプター媒介興奮毒性は、多くの神経変性疾患（ハンティングトン病および運動ニューロン疾患を含む）において役割を果たすことが仮定されてきた（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２８６−２８９；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５：６４３−６５１）。ハンティングトン病の優勢な神経病理学的特徴は、中程度のサイズのＧＡＢＡ作動性線条体出力ニューロン（ｓｔｒｉａｔａｌ ｏｕｔｐｕｔ ｎｅｕｒｏｎ）が、線条体介在ニューロンの実質的な損失なしに、大量に変性することである（Ａｌｂｉｎら、１９８９、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３６６−３７５；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：３０９）。ハンティングトン病において観察される線条体出力ニューロンの優先的な損失、およびその結果としての運動障害は、ＮＭＤＡグルタミン酸レセプターアゴニスト、キノリン酸が線条体に注射される齧歯類または霊長類モデルにおいて模倣される（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２８６−２８９）。【０１３３】ＨＤについての遺伝的動物モデルの非存在下で、神経科学者は、ＨＤ表現型の研究については、急性の病変モデルに依存し続けている。ＨＤの古典的な動物モデルには、ＮＭＤＡレセプタークラスのグルタミン酸アゴニストを使用するラットの線条体の興奮毒性病変の産生が関与している。このような病変パラダイムにおいて、神経毒を直接線条体に注射することは、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）をその神経伝達物質として利用する中程度のサイズの内因性線条体ニューロンの損失を生じ、そして神経伝達物質としてアセチルコリンまたはソマトスタチンのいずれかおよびニューロペプチドＹを利用する２つのクラスの線条体介在ニューロンの相対的な保存を生じる。最近の研究は、キノリン酸の線条体内注射に依存しており、これはＨＤ線条体の出現を最も忠実に再現するようである。【０１３４】Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓら（１９９４，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ １２９：３７−５６）は、キノリン酸（ＱＡ）を、成体ラットの線条体中へ注射し、そして病変後の２〜４ヶ月目には、種々の異なる型の線条体投射ニューロンおよび介在ニューロンならびに異なる線条体投射領域における線条体遠心性神経線維の生存の相対的なパターンを探索した。全ての投射ニューロン型（線条体淡蒼球系（ｓｔｒｉａｔｏｐａｌｌｉｄａｌ）、線条体黒質系、および線条体脚内（ｓｔｒｉａｔｏ−ｅｎｔｏｐｅｄｕｎｃｕｌａｒ））の神経細胞形質は、コリン作動性介在ニューロンよりも脆弱である。投射ニューロン神経細胞形質のうち、異なる脆弱性の証拠が存在した。そして線条体黒質系のニューロンが最も脆弱であるようである。線条体標的領域における免疫標識した線条体繊維の検査は、線条体脚内繊維が、線条体内ＱＡを線条体淡蒼球系または線条体黒質系の繊維よりも良好に生存したことを示した。この研究において投射ニューロンおよび／またはそれらの遠心性神経線維叢の間で観察された見かけの脆弱性の順序、ならびにコリン作動性介在ニューロンのこの研究において観察された非脆弱性は、ＨＤにおいて観察されたものと類似している。【０１３５】別の動物モデルにおいて、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）の全身性の投与により、ハンティングトン病（ＨＤ）において観察されるものと類似する神経病理学的変化が導かれる。これらの動物において観察される行動機能低下は、ＨＤのほとんどの興奮毒性のモデルにおいて観察される機能亢進とは異なるが、３−ＮＰは、若年型の発症および進行したＨＤのよりよいモデルを提供すると考える者もいる。３−ＮＰの神経病理学的効果には、内因性の線条体コリン作動性ニューロンの損失が含まれるが、大きなＡＣｈＥ陽性ニューロンのいくつかの保持、ＮＡＤＰＨジアホラーゼ含有ニューロンの最小の損傷およびグリアの浸潤が含まれる（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、１９９５、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．３６５：４９−５６）。３−ＮＰをＨＤの神経毒性モデルとして用いる比較的少数の研究が行われてきた。その忠実さおよび効用は、依然として研究されるべきである。【０１３６】最近の研究は、線条体における興奮毒性傷害とハンティングトン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）の役割との間の関係を追求し始めている。マウスにおけるキノリン酸の線条体注射は、いくつかの残存するニューロンにおいて、ハンティングトン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）についての増大した免疫反応性を誘導するが、しかしグリア細胞においては誘導しない。この増大は、興奮毒性チャレンジ後６時間における白質におけるニューロン細胞体と細胞プロセスの両方において明らかである。従って、ハンティングトン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）は、これらのニューロンにおける興奮毒性ストレスへの応答に関与され得る（Ｔａｔｔｅｒら、１９９５、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ６：１１２５−１１２９）。１時間と６時間の間の初期増加に続いて、ＩＴ１５ ｍＲＮＡレベルは、ニューロン特異的遺伝子の群に相同なパターンで減少した。２４時間後の減少したｍＲＮＡレベルは、グリア転写が神経変性または神経膠症によって活性化されないことを実証した。１時間および２４時間のｍＲＮＡレベルは、ＩＴ１５転写が、変性ニューロンに優先的に局在することを強力に示唆する。Ｃａｒｌｏｃｋら、１９９５、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ６：１１２１−１１２４。【０１３７】線条体に対する興奮毒性傷害はまた、ＨＤ脳において観察される細胞死の特定の局面を模倣する（Ｂｅａｌら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：１６８−１７１）。ＨＤを有する個体の新線条体において、ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンおよびグリアの分布のパターンは、神経系の正常な発達の間のアポトーシス細胞死において見られるものを思い起こさせた；同じ領域において、ふぞろいでないＤＮＡ断片化が、ときどき観察された。ラットの線条体の興奮毒性傷害の後に、ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化（アポトーシスの証拠）を、初期の時間間隔で観察し、そしてランダムＤＮＡ断片化（壊死の証拠）を後の時点で観察した。さらに、ＥＭにより、中程度の棘のあるニューロンの壊死プロフィールが、病変ラットにおいて検出された。従って、アポトーシスは、ＨＤおよび興奮毒性動物モデルの両方において生じる。さらに、ニューロン死のアポトーシスおよび壊死の機構は、細胞毒性的に傷害を受けた脳における個々の死にゆく細胞において同時に生じ得る（Ｐｏｒｔｅｒａら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５：３７７５−３７８７）。【０１３８】Ｔｄｔ媒介ｄＵＴＰビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）技術は、ヒト脳の種々の病理学的状態の予備的研究において調査されている（例えば、神経膠腫、外傷性脳傷害、パーキンソン病、パーキンソン−アルツハイマー複合症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｃｏｍｐｅｘ）、多系統萎縮症、線条体黒質変性症）。ハンティングトン病のみが、この方法により有意かつ定常的な標識を明らかにした（Ｔｈｏｍａｓら、１９９５、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３３：２６５−２７２）。ｃ−ｆｏｓ発現は、キノリン酸注入のすぐ後に増大し、ラット脳において広範に広がるが、しかし注射後２４時間で実質的に存在しなくなる。しかし、ＤＮＡの断片化は、線条体に限定され、そして注射の２４時間後に最大となる。これらの結果は、領域神経病理学の検出のためのインサイチュニックトランスレーションの感度を実証し、そして興奮毒性ニューロン死に対するｃ−ｆｏｓ発現の時間的および空間的関係を例示する（Ｄｕｒｅら、１９９５、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３３：２０７−２１４）。【０１３９】興奮毒性病変はまた、ＨＤにおける可能な治療的手段を探索するために使用されてきた。キノリン酸によって誘導される興奮毒性線条体病変は、ハンティングトン病のモデルであり、キノリン酸病変（１５０ｎｍｏｌ）の後に、成体ラットにおいて線条体コリン作動性およびＧＡＢＡ作動性ニューロンに対する神経発育因子（ＮＧＦ）の神経保護作用を試験するために使用されてきた。１週間の毎日の線条体内ＮＧＦ投与により、コリンアセチルトランスフェラーゼメッセンジャーＲＮＡの細胞内発現を、コントロールレベルの３倍増大させ、そしてＴｒｋ ＡメッセンジャーＲＮＡ発現のレベルをコントロールレベルまで回復した。コリン作動性細胞に対する保護的効果とは対照的に、ＮＧＦ処理は、グルタミン酸デカルボキシラーゼメッセンジャーＲＮＡレベルにおけるキノリン酸誘導性減少を弱められなかった。従って、ハンティングトン病において変性する線条体グルタミン酸デカルボキシラーゼメッセンジャーＲＮＡ発現ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＮＧＦに対して応答性ではない。【０１４０】Ｆｒｉｍら（１９９３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７８：２６７−２７３）は、線維芽細胞分泌ＮＧＦを、キノリン酸病変ラット線条体へと移植した。彼らは、脳梁内に配置されたＮＧＦ分泌線維芽細胞の予備的移植が、同側性の線条体における引き続く興奮毒性病変の最大断面積を、非ＮＧＦ分泌線維芽細胞移植片の効果と比較した場合、８０％、そして移植されていない動物における興奮毒性病変と比較した場合、８３％減少させたことを見出した（ｐ＜０．００３）。【０１４１】（材料および方法）（栄養性因子） 組換えヒトＢＤＮＦ、神経発育因子（ＮＧＦ）およびＮＴ−３、および組換えラットＣＮＴＦを、記載のように（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４４６−１４５１；Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１０１２）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて調製し、そして特徴づけた。アキソカイン１（Ａｘｏｋｉｎｅ１）（Ａｘ１）は、以下の改変を有する組換えヒトＣＮＴＦについての命名である：１７位のシステインのアラニンでの置換および６３位のグルタミンのアルギニンでの置換、１３個のＣ末端アミノ酸の欠失。このＣＮＴＦアナログは、増大した可溶性を有し、生理学的緩衝液中で少なくとも１週間３７℃で安定であり、そして天然のヒトＣＮＴＦに対してインビトロで４〜５倍より大きい効力を示す（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３）。【０１４２】動物の処理。全ての動物手順を、施設動物保護および用途委員会によって承認されたプロトコルを厳格に遵守して実施した。【０１４３】（浸透圧ポンプによる栄養性因子送達） ３０ゲージの浸透圧ポンプ注入カニューレおよび２２ゲージガイドカニューレ（それぞれ、長さ５．０ｍｍおよび２．２ｍｍ）を、２５０〜３００ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの左半球（ブレグマに対して定位固定の座標ＡＰ０．７、ＭＬ３．２；耳間線（ｉｎｔｅｒａｕｒａｌ ｌｉｎｅ）の下３．３ｍｍの切歯バー）に、抱水クロラールおよびペントバルビタール（３５ｍｇ／ｋｇ）の深い麻酔下で、平行に並べて長期的に移植した。３０日後、ラットを再び麻酔し、そして０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）または組換えヒトＮＧＦのＰＢＳ溶液（０．９ｍｇ／ｍｌ）、ヒトＢＤＮＦ（１ｍｇ／ｍｌ）、ヒトＮＴ−３（１ｍｇ／ｍｌ）、ラットＣＮＴＦ（０．７８ｍｇ／ｍｌ）、またはＡｘ１（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＡｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプ２００２（０．５μｌ／ｈｒの送達速度で２週間容量）を、プラスチックチューブによって注入カニューレに連結し、そして皮下移植した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５７：２９６−３１７）。注入カニューレおよびチューブのデッドボリュームのために、神経栄養性因子の脳への送達は、ポンプ移植の約１日後に始まった。３７℃で、１２日間、浸透圧ポンプにおいて維持されたニューロトロフィンは、バイオアッセイによって決定したところ、完全に安定であり、そしてニューロトロフィンの有効な線条体内送達は、適切な因子についての切片の免疫組織化学染色によって評価された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５７：２９６−３１７）。ポンプ移植の３〜４日後、麻酔したラットに、キノリン酸の注射（１μｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２中、１０分間にわたって５０ｎｍｏｌ）を、ガイドカニューレを通して、２８ゲージの先端が鋭くないニードルを備えた１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して与えた。【０１４４】（毎日の注射による栄養因子送達） ２２ゲージガイドカニューレ（２．２ｍｍ長）を、上記のように、麻酔したラットの左半球（定位固定の座標ＡＰ０．５、ＭＬ３．０）へと長期的に移植した。１週間後から開始して、麻酔したラットに、Ａｘ１（１μｌ中０．４μｇを１０分間にわたって）またはビヒクルの毎日線条体内注射をガイドカニューレを通して、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して与えた。Ａｘ１を、３日連続で、上記のように注射されたキノリン酸の注射１日前および１日後に注射した。【０１４５】（組織学的手順および分析） ４％パラホルムアルデヒドで還流固定した脳を、キノリン酸注射後８または９日目に収集し、そして前頭面をチオニンで染色した４０ミクロン厚の切片に切り出した。各実験において、一連の、１２Ｎｉｓｓｌ染色した切片のうちの１つを、処理条件を知らされていない調査員により評価し、そして中程度のサイズの線条体ニューロンの相対的な損失を以下のスケールで格付けした：０（ニューロン損失なし）、１（明確であるがわずかなニューロンの損失）、２（中程度のニューロンの損失）、３（重篤であるが、ニューロンの全損失ではない）、４（キノリン酸注射の範囲内での中程度のサイズのニューロンの全損失）。ニューロン損失が２つの基準に対して中間であるように見える場合、２つの最も近接するスコア間の半分のスコアが割り当てられた。ＢＤＮＦおよびＮＴ−３を使用する実験における２つの異なる観察者によって独立して割り当てられたニューロンの損失スコアは、４２匹のラットのうち４０のラットについて互いに０〜０．５ポイント内であった（相関係数＝０．８；ｐ＝０．０００１）。【０１４６】ＣＮＴＦを使用する実験において、ニューロンの損失はまた、注入カニューレに対して０．５ｍｍ吻側で得られた切片におけるニューロンを計数することによって評価された。各切片について、処理された線条体内の７つの視野（０．４×０．４ｍｍ）上に配置された１０×１０サンプリンググリッドの全ての垂直線を横切るニューロンを計数した。第一の視野は、線条体の中心に対してわずかに外側に、代表的なキノリン酸誘導病変の中心（すなわち、注入カニューレの先端に対してすぐ吻側）に配置された。６個の他の視野を、第一の視野から対角線上に、背側正中の方向および腹側正中の方向にそれぞれ２回、ならびに側背の方向および腹外側の方向にそれぞれ１回、移動させることによって選択した。切片の厚みにおける可能な変動について制御するために、等価な位置における７つの視野を対側線条体（約６００ニューロンが７つの視野において計数された）においてサンプリングし、そしてニューロン生存を、インタクト側に対して、処理側のニューロンのパーセンテージとして表した。実際のニューロン計数の結果（ＣＮＴＦ処理群およびＰＢＳ処理群のそれぞれについて、３１および６１％ニューロン損失）は、回帰分析（Ｓｐｅａｒｍａｎランク相関係数＝０．８２、ｐ＜０．０５）により評価したところ、ニューロン損失スコアリングシステムの結果と密接に一致していることを示した（それぞれ、１．６７および３．２５の平均ニューロン損失スコア）。【０１４７】実験群とそれらのそれぞれのコントロール群との間の差異を、対応のないｔ検定により評価した。【０１４８】（結果）一連の実験において、キノリン酸（５０ｎｍｏｌ）を、浸透圧ポンプ（名目上の送達速度：ヒトＮＧＦ、１０．８μｇ／日；ヒトＢＤＮＦまたはＮＴ−３、１２．０μｇ／日；ラットＣＮＴＦ、９．４μｇ／日）による神経栄養因子の線条体内注入の開始後３日目または４日目に、成体ラットの左線条体へと注射した。キノリン酸のこの用量は、中程度のサイズの線条体出力ニューロン（これは全ての線条体ニューロンの９０％より多くを構成する）に対して毒性であるが、なおコリン作動性介在ニューロンおよびパルブアルブミン／ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの線条体集団をほとんどインタクトなまま残す（Ｑｉｎら、１９９２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １１５：２００−２１１；Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓら、１９９４、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２９：３７−５６）。キノリン酸の注入後８〜９日目に収集した脳由来のＮｉｓｓｌ染色切片の顕微鏡分析は、ＢＤＮＦ−、ＮＧＦ−、またはＮＴ−３処理脳における中程度のサイズの線条体ニューロンの有意な保持を示さなかった（図１３）。更なるセットの実験において、キノリン酸をＢＤＮＦまたはＮＧＦ注入開始の７日後に注入したとき、ニューロンの保持は、明らかではなかった。【０１４９】著しく対照的に、ニューロンの生存は、それぞれ６９±１７および２９±１１％の平均パーセント生存（±ＳＥＭ）を示したニューロン計数（対応のないｔ検定、ｔ（５）＝２．１２、ｐ＝０．０４）によって決定されるように、または半定量的ニューロン損失スコアの割り当てによって評価されるように（図１５）、ビヒクル単独で処理されたラットと比較して、ＣＮＴＦで処理されたラットにおいて有意により大きかった（図１４）。ＣＮＴＦ処理脳において生存しているニューロンは、キノリン酸注入によって影響を及ぼされる線条体領域全体に広まった。【０１５０】ＣＮＴＦによって実証された有利な効果があったと仮定して、類似の実験を、ポリペプチドＣＮＴＦレセプターアゴニスト、アキソカイン１（Ａｘ１）を使用して行った（２４）。ＣＮＴＦの投与後に観察されるように、Ａｘ１（４．８μｇ／日）の注入は、キノリン酸に曝露された中程度のサイズの線条体ニューロンの有意な保持を生じた（図１５）。この結果は、ＣＮＴＦレセプター媒介機構が、ＮＭＤＡレセプター媒介興奮毒性由来の線条体ニューロンの保護をもたらすという結論を支持する。【０１５１】ＣＮＴＦまたはＡｘ１の神経保護効果は、例えば、体重によって示されるような、行動または健康に対して明らかな有害な効果なしに達成された。実験の最後に測定される体重は、ＣＮＴＦまたはＡｘ１処理によって有意には影響されなかった（対応のないｔ検定）。ＣＮＴＦ実験における栄養因子処理群およびビヒクル処理群の平均の体重（±ＳＥＭ）は、それぞれ３６９±２０ｇおよび３３１±１５ｇであった（ｐ＝０．２１）；Ａｘ１実験における平均体重は、それぞれ４３１±２６ｇおよび４５３±１４ｇであった（ｐ＝０．４４）。【０１５２】ＣＮＴＦレセプターリガンドの神経保護的効果が、神経栄養性因子投与の終結後に持続可能であるか否か、および低用量の栄養性因子が断続的に送達される場合に、処置が有効であるか否かを決定するために、２つのさらなる実験を実施した。第１の実験において、ラットに、Ａｘ１（４．８μｇ／日）またはビヒクルを３日間線条体内に注入し、次いで浸透圧ポンプの除去によって送達を終結した。その後、キノリン酸を線条体内に３日間注入した（図１６Ａ）。第２の実験において、ラットに、キノリン酸の線条体内注入の前３日間およびその後１日間の間に毎日、Ａｘ１（０．４μｇ／日）またはビヒクルを線条体内注入した（図１６Ｂ）；従って、これらのラットは合計でわずか１．６μｇのＡｘ１を投与されたにすぎなかった。両方の実験において、ニッスル染色した切片の顕微鏡解析により、ＣＮＴＦまたはＡｘ１を実験の続く間連続的に注入した場合に観察される保持（ｓｐａｒｉｎｇ）に匹敵する、Ａｘ１処置した脳における中程度のサイズの線条体ニューロンの有意な保持が示された（図１６）。【０１５３】（考察）線条体内の９０％を超えるニューロンが、中程度の大きさであり、ＧＡＢＡ作動性であり、線条体黒質性であり、そして線条体淡蒼球系の（ｓｔｒｉａｔｏｐａｌｌｉｄａｌ）投射路ニューロンであるので（Ｇｒａｙｂｉｅｌ，Ａ．Ｍ．、１９９０、ＴＩＮＳ １３：２４４−２５４）、この結果は、ＣＮＴＦまたはＣＮＴＦレセプターアゴニストでの処置が、興奮毒性発作に対して線条体出力ニューロン（ｏｕｔｐｕｔ ｎｅｕｒｏｎ）を保護することを示す。従って、ＣＮＴＦは、ハンティングトン病の成体動物モデルにおける薬理学的な適用後に線条体出力ニューロンを保護することが実証された、最初の精製された栄養性因子の１つである。特徴付けられた他の因子の中で、とりわけ、塩基性線維芽細胞成長因子での処置のみが、成体ラットおよび新生児ラットでＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）またはマロン酸の注入後に誘導される線条体病変の大きさを減少することが報告されている（Ｎｏｚａｋｉら、１９９３、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１３：２２１−２２８；Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、１９９５、J．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１５：６１９−６２３）。ラットにおいて、線条体付近に移植されたＮＧＦ分泌線維芽細胞が、キノリン酸から中程度の大きさの線条体ニューロンを保護することが示されているが（Ｆｒｉｍら、１９９３、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ４：３６７−３７０；Ｅｍｅｒｉｃｈら、１９９４、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３０：１４１−１５０）、本発明者らは、いくつかの初期の研究（Ｄａｖｉｅｓら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４０：１６１−１６４；Ｖｅｎｅｒｏら、１９９４、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６１：２５７−２６８；Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０７７−９０８０）と一致して、精製されたＮＧＦでこれらのニューロンに対する生存促進効果を全く得られなかった。この知見は、ＮＧＦが、ＮＧＦ分泌線維芽細胞によって提供される神経保護の唯一のメディエイタではないことを示唆する。しかし、本発明者らは、大きな暗く染色する、おそらくコリン作用性の介在ニューロンが、以前に報告されたように（Ｄａｖｉｅｓら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１４０：１６１−１６４；Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０７７−９０８０；Ｐｅｒｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：７０６−７１１）、ＮＧＦで処置された脳内においてより顕著であることを観察した。高親和性ＮＧＦレセプターであるＴｒｋＡの線条体の発現は、コリン作用性の介在ニューロンに制限され（Ｓｔｅｉｎｉｎｇｅｒら、１９９３、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６１２：３３０−３３５）、これはこれらのニューロンに対するＮＧＦの選択的作用の知見と一致するが、一方、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３についての高親和性レセプター（ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）は、多くの中程度の大きさの線条体ニューロンによって発現される（Ａｌｔａｒら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１３８９−１４０５）。ＢＤＮＦおよびＮＴ−３は（ＮＧＦと異なり）、胚の、ＧＡＢＡ作動性の、線条体出力ニューロンのインビトロでの生存および表現型分化を促進する（Ｍｉｚｕｎｏら、１９９４、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６５：２４３−２５６；Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）。さらに、これらのニューロトロフィンは、インビトロでグルタミン酸毒性から特定のニューロン集団を保護し得る（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１４５５−１４６４；Ｓｈｉｍｏｈａｍａら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１６４：５５−５８；Ｃｈｅｎｇら、１９９４、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６４０：５６−６７）。それにもかかわらず、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３の注入は、インビボでのＮＭＤＡレセプター媒介性興奮毒性に対して線条体出力ニューロンを保護するようではないが、同等の用量でのＢＤＮＦまたはＮＴ−３の大脳内注入は、線条体および脳内の他の箇所において明白な生物学的効果を誘発する（Ｌｉｎｄｓａｙら、１９９４、ＴＩＮＳ １７：１８２−１９０）。インビボ研究とインビトロ研究との間での対照的な結果は、ニューロン型の差異（線条体対海馬、皮質または小脳）、ニューロンの発達段階における差異（成体対胚性）、またはインビボでのグルタミン酸作動性のシナプスの投入（ｉｎｐｕｔ）によって説明され得る。【０１５４】ＣＮＴＦレセプターリガンドによって提示される神経保護効果は、中程度の大きさの線条体ニューロン上での直接的な作用を通して生じ得る。なぜなら、線条体には、ＣＮＴＦレセプターの成分（ＣＮＴＦＲα、ＬＩＦＲβ、ｇｐ１３０）についてのｍＲＮＡが豊富に発現しているからである（ｌｐら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｎ １０：８９−１０２；Ｒｕｄｇｅら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：６９３−７０５）。潜在的なメカニズムとしては、グルタミン酸レセプターの発現または機能の改変（それによってグルタミン酸作動性刺激に対するニューロンの感受性を改変する）か、または細胞質内のカルシウムイオン濃度を調節するニューロンの能力の増強を含み得、ここにおける増加は、神経変性プロセスを開始する重要な事象であると考えられる（Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｗ．１９８８.Ｎｅｕｒｏｎ １：６２３−６３４）。ＣＮＴＦがグルタミン酸レセプターのアンタゴニストとして作用して、キノリン酸毒性をブロックする可能性は有りそうにない。なぜなら、ＣＮＴＦは、インビトロでグルタミン酸の毒性作用をブロックしないからである（Ｍａｔｔｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５：１７４０−１７５１）。【０１５５】他方で、ＣＮＴＦレセプターリガンドは、潜在的に、線条体の他の成分を介して間接的に作用に作用し得る。例えば、キノリン酸への曝露の前の線条体への黒質または皮質の投入の排除は、線条体ニューロンの喪失における有意な減少を生じ（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２８６−２８９；Ｂｕｉｓｓｏｎら、１９９１、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１３１：２５７−２５９）、このことは、外因性毒素および内因性神経伝達物質の組合わせ作用が細胞死を誘導するために必要とされることを示す。従って、グルタミン酸作動性シナプスまたはドーパミン作動性シナプスのいずれかでのシナプス伝達における減少が、キノリン酸の注入から線条体ニューロンを保護するようである。星状細胞は、通常はインビボで検出可能なＣＮＴＦＲαを発現しないが（ｌｐら、１９９３、Ｎｅｕｒｏｎ １０：８９−１０２）、脳損傷によって活性化される場合、またはインビトロで維持される場合には、星状細胞は全てのＣＮＴＦレセプター成分を発現する（Ｒｕｄｇｅら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：６９３−７０５）。さらに、ＣＮＴＦの大脳内送達は、グリア原線維の酸性タンパク質およびそのｍＲＮＡの含量の増加によって示されるように、曝露の１０〜４８時間後に星状細胞を活性化するようである（Ｌｅｖｉｓｏｎら、１９９５、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ．２１：４９７；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：５８６５−５８６９）。ＣＮＴＦによって間接的または直接的にのいずれで活性化されるにかかわらず、星状細胞は、興奮性アミノ酸の壊死巣分離の増加を通してか、またはニューロンを保護する物質の放出によってニューロンの生存を促進し得る。【０１５６】本研究において、ＣＮＴＦレセプター媒介性事象によって、興奮毒性損傷から保護される線条体ニューロンの集団は、ハンティングトン病において選択的に喪失されるものと同じ型である（Ａｌｂｉｎら、１９８９、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３６６−３７５）。興奮毒性刺激とハンティングトン病遺伝子の発現の増加との間の潜在的な関連が、近年示唆されてきた（Ｃａｒｌｏｃｋら、１９９５、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ６：１１２１−１１２４；Ｔａｔｔｅｒら、１９９５、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ６：１１２５−１１２９）。ハンティングトン病を導くメカニズムを同定するために、広範な研究が進行中であるが、現存の証拠の多くは、ＮＭＤＡレセプター媒介性興奮毒性についての役割を明らかに意味する（ＤｉＦｉｇｌｉａ，Ｍ．１９９０、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２８６−２８９）。【０１５７】（実施例８−アキソカイン（ａｘｏｋｉｎｅ）タンパク質のＰＥＧ化）タンパク質のＰＥＧ化は、安定性およびバイオアベイラビリティを増強する一方で免疫原性を最小化することによって、それらのインビボでの効力を増強することが示されている。特定のタンパク質の特性が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの付着によって調節され得ることは公知であり、これはタンパク質の流体力学的容積を増加して、それによって腎の濾過によるそのクリアランスを緩徐にする（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７を参照のこと）。本発明者らは、Ａｘ−１３に対してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合的に連結することによって、ＰＥＧ化したアキソカインを産生した。本発明者らはまた、改変されていない分子からアキソカインの種々のＰＥＧ化形態を分離するための精製方法を開発した。ＰＥＧ化Ａｘ−１３は、ＰＥＧ化されていないＡｘ−１３よりも、生理学的ｐＨにおいてより可溶性でありそして安定な特性を有する。ＰＥＧ化は、Ａｘ−１３の薬物速度論的特性を顕著に増強することが示されており、そして他のアキソカイン分子の特性を同様に増強することが期待される。【０１５８】Ｅ．ｃｏｌｉに由来する精製Ａｘ−１３を、これらの研究のために使用した。２０ｋＤのｍＰＥＧ−ＳＰＡをＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｂｉｃｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）、およびＴｒｉｓ−グリシンの成型済みゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＣＡ）から得た。小規模の反応研究を、反応条件を決定するために組み立てた。２０ｋＤのｍＰＥＧ ＳＰＡを、アミンを含まない緩衝液（ｐＨ８．１）中で４℃にて、精製Ａｘ−１３（最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）と反応させた。タンパク質に対するＰＥＧのモル濃度比を変化させ、そして２つの反応時間を使用した。大過剰の一級アミンの添加によって反応を停止した。反応産物を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。主要な改変種は、約６０ｋＤの分子量で泳動した。より高い分子量で泳動したより高次元の改変バンドもまた観察された。この研究に基づいて、タンパク質に対するＰＥＧの割合が４での一晩の反応を選択した。０．６ｍｇ／ｍｌでのＡｘ−１３は、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液中で２０ｋＤのｍＰＥＧ ＳＰＡと反応した（４℃にて一晩、ｐＨ８．１）。大過剰の一級アミンを添加することによって、反応を停止した。この反応産物を低塩緩衝液で希釈し、そしてイオン交換カラムにかけた。このカラムを低塩緩衝液で洗浄し、そしてＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。より高次元の形態（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で見かけ上の分子量が６６ｋＤを超える）間での良好な分離、約６０ｋＤに泳動した明確な改変種と改変されていないＡｘ−１３とが得られた。６０ｋＤのバンドに対応する画分を、バイオアッセイで試験した。６０ｋＤのバンドに対応する画分において、非常にわずかな改変されていないＡｘ−１３のバンドが認められた。バイオアッセイの結果がこの物質によって有意に影響されていないことを確証するために、６０ｋＤのバンドをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。このクロマトグラフィーは、改変されていないＡｘ−１３と６０ｋＤのバンドとの間で基線となる分離を生じた。この精製された改変Ａｘ−１３をバイオアッセイにおいて試験した。そしてこの結果は、ＳＥＣ前の材料で得られた結果と識別不可能であった。【０１５９】（実施例９−Ａｘ−１５発現プラスミドｐＲＧ６４３の構築）発現プラスミドｐＲＧ６３２は、アンピシリン耐性およびヒトＣＮＴＦ−Ｃ１７Ａ、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１３についての遺伝子（本明細書中で、Ａｘ１またはＡｘ−１３のいずれかともいわれる）をコードし、唯一のＥａｇＩ制限酵素認識配列を終止コドンに対して３’に有する高コピー数のプラスミドである。このプラスミドを使用して、ΔＣ１５変異を組み込んだ１８７ｂｐのＢｓｅＲＩ−ＥａｇＩ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することにより、ヒトＣＮＴＦ変異Ｃ１７Ａ、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１５（Ａｘ−１５と命名する）を構築した。５’プライマー｛ΔＣ１５−５’（５’−ＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＴＣＣＴ−３’）｝は、ＢｓｅＲＩ部位をコードし、そして３’プライマーであるΔＣ１５−３’｛（５’−ＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧ−３’）｝は、Ｇｌｙ１８５で終結するＡｘ−１５遺伝子のＣ−末端と、次いで２つの終止コドンおよびＥａｇＩ制限酵素認識配列をコードする。このＤＮＡフラグメントを、ＢｓｅＲＩおよびＥａｇＩで消化し、そしてｐＲＧ６３２中の同じ部位に連結した。得られたプラスミド（ｐＲＧ６３９）は、Ａｘ−１５（ヒトＣＮＴＦ Ｃ１７Ａ、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１５）についての遺伝子をコードする。次いで、このΔＣ１５変異を、３３９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥａｇＩ ＤＮＡフラグメントとして、ｐＲＧ４２１内の対応部位中に転移した。このｐＲＧ４２１は、カナマイシン耐性およびヒトＣＮＴＦ Ｃ１７Ａ、Ｑ６３Ｒ、ΔＣ１３についての遺伝子をコードする高コピー数の発現プラスミドである。得られたプラスミド（ｐＲＧ６４３）は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下でＡｘ−１５についての遺伝子をコードし、そしてカナマイシン耐性を付与する。このＡｘ−１５遺伝子のＤＮＡ配列を、配列決定分析によって確認した。【０１６０】（実施例１０−Ａｘ−１５タンパク質の小規模の発現および精製）ｐＲＧ６３９を含有するＥ．ｃｏｌｉのＲＦＪ１４１株を、ＬＢ培地中で増殖し、そしてＡｘ−１５タンパク質の発現を、ラクトースの１％（ｗ／ｖ）までの添加によって誘導した。誘導された細胞を遠心分離によって回収し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ中に再懸濁し、そして１０，０００ｐｓｉで細胞をフレンチプレスセルを通過させることによって溶解した。この細胞溶解物を遠心分離し、そしてペレットを８Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁し、次いで５容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）を用いて希釈し、次いで緩衝液Ａに対して透析した。透析物を、緩衝液Ａで平衡化したＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上にロードした。Ａｘ−１５タンパク質を、１０カラム容量の緩衝液中で１ＭのＮａＣｌに対する線形勾配によって溶出した。Ａｘ−１５を含有する画分をプールし、そして固形（ＮＨ4）2ＳＯ4の緩徐な添加とその一方でのＮａＯＨの添加によりｐＨを８．３に維持することによって、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4にした。このプールを、緩衝液Ａ中の１Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4を用いて平衡化されたフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上にロードした。このカラムを緩衝液Ａ中の０．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を用いて洗浄し、そしてＡｘ−１５タンパク質を、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を減少する線形勾配によって溶出した。Ａｘ−１５タンパク質を含有する画分をプールし、５ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ８．３）に対して透析し、次いで限界濾過によって濃縮した。濃縮されたプールを５ｍＭのＮａＰＯ4（ｐＨ８．３）を用いて平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００カラム上に分画した。【０１６１】（実施例１１−Ａｘ−１５タンパク質の大規模の発現および精製）ｌａｃプロモーターの制御下でＡｘ−１５タンパク質を発現する、組換えのカナマイシン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＦＪ１４１株（ｐＲＧ６４３）を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する最少塩のグルコース培地中で、３０〜３５のＡＵ550（５５０ｎＭの吸光度）の中間密度まで増殖させた。Ａｘ−１５タンパク質の発現をＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を１．０ｍＭまで添加することによって誘導し、そしてさらに８時間発酵を持続した。Ａｘ−１５タンパク質を、ＩＰＴＧ誘導後に可溶性の封入体として発現した。誘導後、細胞を回収し、細胞のペーストを濃縮し、そしてＡＧＴ５００，０００の分子量カットオフ（ｍｗｃｏ）の中空繊維ダイアフィルトレーション（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を介して、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１．０ｍＭのＤＴＴ，５．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）に緩衝液交換した。連続的フローの高圧（８，０００ｐｓｉを超える）Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉホモジナイザーを通して、冷却した（０〜１０℃）細胞ペースト懸濁物を繰り返し通過させて破壊することによって、封入体を、回収された細胞から放出した。ホモジネートを、冷却した（４〜８℃）連続フローの高速（１７，０００×Ｇを超える）Ｓｈａｒｐｌｅｓ遠心分離器（ｓｏｕｒｃｅ）を２回通過させて、封入体を回収した。回収された封入体を、１．０ｍＭのＤＴＴを伴う８．０ＭのグアニジンＨＣＬ中に抽出した。Ａｘ−１５タンパク質／グアニジン溶液を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．０ｍＭのＤＴＴ、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０〜８．３）中に希釈し、そしてＡＧＴ５，０００ｍｗｃｏ中空繊維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて希釈緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。再折り畳みされたＡｘ−１５を含有する得られた溶液を、クロマトグラフィー精製の前にＭｉｃｒｏｇｏｎの０．２２μｍ中空繊維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を通して濾過した。【０１６２】（実施例１２−再折り畳みされたＡｘ−１５のカラムクロマトグラフィー精製）上記のように濾過されたＡｘ−１５溶液を、１０．９ｍｇ／ｍｌ樹脂で１６．４ＬのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にロードし、そして５０Ｌの５０ｍＬ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０〜８．３）、１．０ｍＭのＤＴＴ、および０．０５ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。Ａｘ−１５タンパク質を同じＴｒｉｓ緩衝液中で、１２０ｍＭ ＮａＣｌの工程を用いてカラムから溶出した。以前に確立した、ピークの上昇部分にある最大Ａ280の４０％およびピークの下降部分にある最大Ａ280の２０％の２８０ｎＭ吸光度基準を超える溶出物をプールし、冷凍保存（−３０℃）するかまたは精製手順の次の工程に使用した。プールされた溶出Ａｘ−１５タンパク質を、ｐＨを８．０〜８．３に維持しつつ、固形化合物を段階的に添加することによって１．０Ｍの硫酸アンモニウムへと調整した。この溶液を０．２２μｍのＳａｒｔｏｒｉｏｕｓカプセルフィルターを通して濾過し、８．２４ｍｇ／ｍｌ樹脂で１２．５ＬのフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にロードし、そして０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０〜８．３）を有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中の５５Ｌの１．０Ｍの硫酸アンモニウムを用いて洗浄した。同じＴｒｉｓ緩衝液中の２５０ｍＭの硫酸アンモニウムを用いた１２．０Ｌの洗浄に続いて、Ａｘ−１５タンパク質を、１２５ｍＭの硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ緩衝液洗浄工程を用いて溶出した。以前に確立した、ピークの上昇部分にある最大Ａ280の１００％およびピークの下降部分にある最大Ａ280の２０％の２８０ｎＭ吸光度基準を超える溶出物をプールした。溶出物を、その伝導度を減少させるために、塩を含まない５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０〜８．３）緩衝液中に、１：４に同時に希釈した。プールされた物質を、冷凍保存（−３０℃）するか、または次の工程に使用した。プールされた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）物質を２５Ｌに濃縮し、そして５，０００ｍｗｃｏのＡＧＴ中空繊維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、５．０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜８．３）に対してダイアフィルトレーションした。濃縮（８５％）リン酸を段階的に添加することによって、スルフィル（ｓｕｌｆｙｌ）プロピル高速流（ＳＰ ＦＦ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーの直前にｐＨを７．０〜７．２に調整した。ｐＨを調整したプールされた物質を、９．０ｍｇ／ｍｌ樹脂まで７．７ＬのＳＰ ＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上にロードし、そして最少の２５Ｌの５．０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄した。Ａｘ−１５タンパク質を、５．０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０〜７．２）の７７．０Ｌの工程で溶出した。溶出物を、その伝導度を減少させそしてｐＨを上昇させるために、塩を含まない１０．０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ９．０〜９．２）緩衝液中に、１：５に同時に希釈した。ピークの上昇部分にある最大Ａ280の２０％およびピークの下降部分にある最大Ａ280の２０％を超えるピーク物質をプールした。プールしたＡｘ−１５タンパク質を、冷凍保存（−３０℃）するか、または次の工程に使用した。プールしたＳＰ ＦＦＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムＡｘ−１５タンパク質を濃縮し、そして５，０００ｍｗｃｏのＡＧＴ中空線維フィルター（ＡＣＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、５．０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０〜８．３）緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。プール（２４．６６ｇ）を、５．０Ｌ以下に濃縮した。濃縮され、ダイアフィルトレーションされたＡｘ−１５タンパク質を５０ＬのＳ−１００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイジングカラム上にロードし、そして２５０Ｌの同じ５．０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０〜８．３）を用いて溶出した。ピークの上昇部分にある最大Ａ280の４０％およびピークの下降部分にある最大Ａ280の４０％を超えるピーク物質をプールした。プールされたＡｘ−１５タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐａｋ ０．２２μｍフィルターを通して濾過し、そして調剤または処方の前に保存（−８０℃）した。作製されたＡｘ−１５のアミノ酸配列は、以下の通りである。あるいは、最初のアラニンの前にメチオニン残基を含む配列を作製し得る。【０１６３】【化１】（実施例１３−肥満症の処置のためのＡｘ−１５の使用）（動物モデル）（正常マウス）正常な（８週齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから入手した。このマウスに、ビヒクルまたはＡｘ−１５の皮下注射を毎日した。この動物を毎日計量し、そして２４時間の食物摂取量を、３〜４日間測定した。【０１６４】（ｏｂ／ｏｂマウス）第６染色体における単一遺伝子の突然変異の結果、ｏｂ／ｏｂマウスは、短縮された、非機能的遺伝子産物（レプチン）を産生する。これらのマウスは、摂食亢進症で、高インスリン血症で、および明らかに肥満であった。【０１６５】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｏｂ／ｏｂマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、そして１２〜１４週齢で実験に用いた。このマウスに、ビヒクル、Ａｘ−１５またはレプチンの皮下注射を毎日した。対で給餌した（ｐａｉｒ−ｆｅｄ）グループに、動物をＡｘ−１５（０．３ｍｇ／ｋｇ）で処置することによって消費される平均量（ｇ）の食物を与えた。体重を毎日入手し、そして２４時間の食物摂取量を、３日目と４日目との間に測定した。８日目に、この動物を屠殺し、そして屠体分析を行った。【０１６６】（食餌誘導性（Ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ）肥満症（ＤＩＯ）マウス）ＡＫＲ／Ｊマウスは、体脂肪含有量の増加によって、食餌誘導性肥満症に非常に感受性であることが示された。遺伝環境（食餌）相互作用は、この種の食餌の肥満症に関して完全には知られていないが、ヒト肥満症においても同様にこの遺伝子型は多遺伝子性である。【０１６７】ＡＫＲ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、そして１０〜１２週齢で高脂肪食餌（４５％脂肪；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を与えた。全ての実験は、高脂肪食餌の７週間後に開始した。このマウスに、ビヒクル、Ａｘ−１５またはレプチンの皮下注射を毎日した。対で給餌した（ｐａｉｒ−ｆｅｄ）グループに、Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物によって消費される平均量（ｇ）の食物を与えた。この動物を毎日計量し、そして２４時間の食物摂取量を、３日目〜４日目との間に測定した。８日目に、この動物を屠殺し、そして血清を、インスリン測定およびコルチコステロン測定のために得た。【０１６８】（ＩＩ．試薬：）組換えヒトＡｘ−１５を、上記に示されるように製作し、そしてレプチンをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。【０１６９】（結果）（正常マウス）Ａｘ−１５は、用量依存様式で正常マウスにおいて体重を減少した。６日目に、この動物は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇで、それぞれそれらの体重の約４％、１１％、および１６％を失った（図１７）。【０１７０】（ｏｂ／ｏｂマウス）ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｘ−１５処置後の体重において、用量に関連した（０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ）減少が存在した（図１８）。０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、体重の８％〜２５％の減少が存在した。特定の用量のＡｘ−１５（０．３ｍｇ／ｋｇ）を対で給餌した動物は、この用量のＡｘ−１５を与えられたマウスで同量の体重の減少を示した。このことは食物摂取量が、体重減少の主な原因であることを示唆する。【０１７１】レプチンはまた、ｏｂ／ｏｂマウスにおける体重の減少に有効であった。１ｍｇ／ｋｇでレプチンは、７日目までに６％の体重を減少し、これは０．１ｍｇ／ｋｇでＡｘ−１５を与えた経過とほぼ同じ経過に従った（図１８）。【０１７２】屠体分析は、Ａｘ−１５処置およびレプチン処置で、ならびに対で給餌したコントロールにおいて、総体脂肪の有意な減少が存在したことを示した（表５）。ビヒクルコントロール動物と比較して、全てのグループにおいて、除脂肪量の少量だが有意ではない減少が存在した。食餌制限（対で給餌した）のみを受けたマウスは、ビヒクルコントロールと違いのない脂肪量／除脂肪量の割合を有した。このことは、それらが、脂肪量および除脂肪量を等しく減少したことを示した。しかし、Ａｘ−１５およびレプチン処置した動物は、脂肪量／除脂肪量の割合の減少によって反映されるように体脂肪の優先的な減少を示した（表５）。【０１７３】（ＤＩＯマウス）Ａｘ−１５は、ＤＩＯマウスにおける体重を用量依存的に減少した。１週間以内で、この動物は、Ａｘ−１５を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１ｍｇ／ｋｇで与えた場合、それぞれ、それらの体重の約１４％、２６％、および３３％を失った（図１９）。Ａｘ−１５処置動物の効果と、対で給餌したコントロール動物の効果とを比較すると、２グループの間に小さいが有意な差異が存在した。このことは、食物摂取量の低下がおそらく主要であるが、それのみではない、Ａｘ−１５処置での体重の減少の原因となることを示唆する。実際、Ａｘ−１５は、ＤＩＯマウスにおける肥満症に関連した高インスリン血症を有意に減衰させるが、単なる食物摂取量の減少（対で給餌した）は、減衰させなかった（図２０Ａ）。さらに、Ａｘ−１５は、食餌制限の一般的な効果であるコルチコステロンレベルの上昇を引き起こさなかった（図２０Ｂ）。【０１７４】Ａｘ−１５を同じ用量範囲（０．１〜１ｍｇ／ｋｇ）で投与した場合、ＤＩＯマウスは、正常なマウスと比較した場合より２倍を超えて体重を減少した（図１７を参照のこと）。食餌誘導性肥満動物のＡｘ−１５に対するこのより高い感受性は、肥満症が標準化された後に、Ａｘ−１５が持続的な体重減少を引き起こさないように、肥満症がＡｘ−１５の効力を調節し得ることを示唆する。【０１７５】ＤＩＯマウスは、レプチン耐性であり；体重減少効果は、毎日レプチンの注射（１ｍｇ／ｋｇ；図１９）を行ったこれらの動物では観察されなかった。【０１７６】本発明者らは、以下のように結論づける。【０１７７】１．Ａｘ−１５は、用量依存様式で正常なマウスにおいて体重減少を引き起こした。【０１７８】２．Ａｘ−１５は、用量依存様式でｏｂ／ｏｂマウスにおいて体重減少を誘導した。Ａｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて体重減少を引き起こす際にレプチン（１ｍｇ／ｋｇ）と同じくらい有効であった。Ａｘ−１５処置およびレプチン処置の両方は、除脂肪量より多く総体脂肪を優先的に減少したか、対で食餌した処置は、減少しなかった。【０１７９】３．Ａｘ−１５は、用量依存様式で、食餌誘導性肥満症マウスにおいて体重減少を引き起こした。一方レプチンは効果が無かった。Ａｘ−１５処置は、ＤＩＯマウスにおける肥満症に関連した高インスリン血症を減衰させた。この効果は、対で給餌したコントロール動物においては観察されなかった。さらに、Ａｘ−１５は、正常マウスまたはｏｂ／ｏｂマウスよりもＤＩＯマウスにおいて体重減少を誘導する際により有効であった。ひとまとめにして考えると、本発明者らの結果は、ＩＩ型糖尿病に関連した肥満症のようなレプチン耐性の肥満症の処置におけるＡｘ−１５の特定の有用な適用を示唆する。【０１８０】４．レプチン耐性マウスモデルにおいて体重を減少する際のＡｘ−１５の有効性は、Ａｘ−１５がまた、レプチンに対して耐性かまたは非応答である肥満のヒトにおいて体重を減少する際に有効であり得ることを示唆する。【０１８１】表５：ｏｂ／ｏｂマウスの屠体分析の結果【０１８２】【表５】（実施例１４−ＰＥＧ化Ａｘ−１５）出願人らは、Ａｘ−１５ポリペプチド分子に対して異なる長さおよびタイプのポリエチレングリコール鎖を共有結合的に連結することによって、いくつかの異なるＰＥＧ化をされたＡｘ−１５分子を生成した。【０１８３】出願人らはまた、非改変化Ａｘ−１５分子からＡｘ−１５の異なるＰＥＧ化された形態を分離するための精製方法論を開発した。【０１８４】（材料および方法）Ｅ．ｃｏｌｉ（前出）由来の精製されたＡｘ−１５を、これらの研究に用いた。アミンに特異的な末端部分で機能化された種々の分子量のＰＥＧ鎖を、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＬから入手した。ＢｉｃｉｎｅをＳｉｇｍａ，ＭＯから入手し、そしてＢｉｓ−ＴｒｉｓプレキャストゲルをＮｏｖｅｘ，ＣＡから入手した。小スケール反応研究を準備し種々の反応条件を試験した。異なる反応条件を用いかつ以下のように変えた：１． Ａｘ−１５タンパク質濃度：０．６ｍｇ／ｍｌ〜６．０ｍｇ／ｍｌの範囲。２． ＰＥＧ／Ａｘ−１５タンパク質モル比、３０：１まで。３． 温度：４℃〜室温。【０１８５】さらに、例えば、アルデヒド化学を用いた場合、異なる濃度の還元剤（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｉｅｅ，ＷＩからナトリウムシアノボロハイドライド）を用いてシッフ塩基を還元した。この反応を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手した１Ｍ保存溶液からの大過剰のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の添加によって停止した。代表的には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を、タンパク質濃度がμＭ範囲にあったので用いる。【０１８６】精製のために、代表的には反応生成物を低塩緩衝液で希釈し、そしてイオン交換カラムに適用した。このカラムを低塩緩衝液で洗浄し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪより入手したＱ−ＨＰアニオン交換樹脂を充填したカラム通じて、１５ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液中の０〜３００ｍＭ ＮａＣｌの範囲のＮａＣｌ勾配で溶出した。異なる数の結合化ＰＥＧ鎖に対応する非改変化Ａｘ−１５とＰＥＧ化された形態との間の良好な分離が、観察された。イオン交換精製からの異なるプールを濃縮し、さらに標準的な分取サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。いくつかの場合では、ＰＥＧ Ａｘ−１５タンパク質の２つの近い形態が、共にプールされ、そして１つのサンプルとして処理された（例えば、ＰＥＧ ５Ｋ（３，４）−２°Ａｍｉｎｅ−Ａｘ １５とマークされたサンプルは、２級アミン結合を用いて約５ＫＤ ＰＥＧ分子の３または４鎖と結合したＡｘ−１５分子から主に成る）。【０１８７】精製の実行からの反応生成物およびサンプルを、以下の標準的な方法のいずれかまたは全てによって分析した：１．還元条件下および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ２．分析用イオン交換クロマトグラフィー３．分析用サイズ排除クロマトグラフィー。【０１８８】各Ａｘ−１５分子に結合した鎖の数をまず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンドパターンに基づいてサンプルに割り当てた。確証を遊離アミンアッセイを用いて公開されている技法に基づいて、１級アミンを検出することでか（Ｋａｒｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２２８：３７７−３９０（１９９４））、または一連のＵＶ、ＲＩ（屈折率）およびＭＡＬＬＳ検出器を有するＭＡＬＬＳ（多角レーザー光散乱）システムと連結した分析用サイズ排除カラムを用いることによって得た。光散乱は、巨大分子の質量および濃度の関数である。分子量を決定するために、このタンパク質サンプルを、ゲル濾過カラムに注入し、そして溶出物をオンラインの光散乱検出器ならびに屈折率検出器および／またはＵＶ検出器でモニタリングする。光散乱検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）からのＭｉｎｉＤａｗｎレーザー光散乱検出器である。この機器は、静的光を３つの異なる角度で測定する。オンラインの屈折率検出器またはＵＶ検出器は、タンパク質濃度を測定するために働く。Ａｓｔｒａ ４．７ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ｄｎ／ｄｃ（ｄｎ＝屈折率の変化；ｄｃ＝濃度）か、またはタンパク質の吸光係数のいずれかに基づいてタンパク質濃度を算出する。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳシステムもまた用い、ＰＥＧ Ａｘ−１５調製物の純度または分子量を決定した。【０１８９】種々のＰＥＧ Ａｘ−１５分子を、以下のようにインビボにおける実験で試験した。【０１９０】（実施例１５−ＰＥＧ Ａｘ−１５を用いた肥満症を処置するためのインビボでの実験）ＡＫＲ／Ｊマウスは、体脂肪含有量の増加により食餌誘導性肥満症に対して感受性であることが示されている。この遺伝子環境（食餌）相互作用は、この種の食餌性肥満症に関しては完全に理解されてはいないが、ヒト肥満症の場合、遺伝子型は多遺伝子である。以下の実験を、食餌誘導性肥満症のこの実験動物モデルのにおいて体重および食物摂取量に対するＰＥＧ Ａｘ−１５の効果を試験するために行った。実験に記載されるこの特定の分子は、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５と呼ばれ、そして上記の手順によって生成されそしてインビボ実験で試験される多くのＰＥＧ化Ａｘ−１５分子のまさに１つである。この分子は、２級アミン結合を介して２０ＫＤ ＰＥＧ鎖とモノＰＥＧ化されている。表６は、種々のＰＥＧ化されたＡｘ−１５調製物のインビボ活性の比較を示す。【０１９１】（表６ ＰＥＧ−Ａｘ−１５の種々の調製物のインビボ活性比較）【０１９２】【表６】（実験手順）雄ＡＫＲ／Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、１０週齢で始めて、高脂肪食餌（脂肪から４５ｋｃａｌ％を有する）を給餌した。１７週齢までに、マウスは、通常の固形試料を給餌したやせた同腹子の約３０％を超える重さであり、これを食餌誘導性肥満症（ＤＩＯ）マウスと称した。６匹のＤＩＯマウスの４つのグループは、ビヒクル（ＰＢＳ）、非ＰＥＧ化されたＡｘ−１５（０．７ｍｇ／ｋｇ）、または１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５（０．２３または０．７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの皮下注射を毎週受けた。処置期間の間の体重測定および２４時間の食物摂取量測定を毎日、１３日間記録した。【０１９３】（結果）１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５処置は、用量依存様式でＤＩＯマウスにおいて体重を減少した（図２１）。０．７ｍｇ／ｋｇで、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５はおよそ３２％体重減少を引き起こし、一方同じ用量での非ＰＥＧ化Ａｘ−１５は体重をわずか８％減少したにすぎなかった。さらに、体重減少は、食物摂取量の減少に密接に関連しており、最高の食欲の減退を伴うことが高用量（０．７ｍｇ／ｋｇ １−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５）処置グループで観察された（図２２）。同様に食欲抑制の持続期間は、この処置グループにおいて最も長かった（図２２）。これらの知見は、ＰＥＧ化がＤＩＯマウスの体重減少においてＡｘ−１５の効力を４倍増強することを示唆する（図２１）。従って、Ａｘ−１５のＰＥＧ化は、より少ない用量かつ少ない頻度の投与養生を可能にし得る。【０１９４】前述の発明は、明確に理解する目的のために例証および例示の方法によって、いくつかについて詳細に記載されているが、本発明の教示を考慮すると、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくそれらに対してなされ得ることが当業者に容易に明白である。【図面の簡単な説明】【図１】 ＣＮＴＦタンパク質配列の整列。Ａ．ヒト、ラット、ウサギ、マウスおよびニワトリ（Ｌｅｕｎｇら、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ ８：１０４５〜１０５３）の配列。点は、ヒト配列中に見出される残基を示す。パネルＢ．ヒトＣＮＴＦアミノ酸残基（点）およびラットＣＮＴＦ（示される残基）を示す、改変されたＣＮＴＦ分子。各配列に対応する精製された組換えタンパク質の名前を左に示す。【図２】 還元ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上の、ヒト、ラットおよびいくつかの改変されたＣＮＴＦ分子の移動度。精製された組換えタンパク質を、示したように充填した。示されたＭＷのマーカーを、レーンＭに充填した。【図３】 ２つの改変されたＣＮＴＦ分子の生物学的活性。Ａ．ヒトＣＮＴＦ（黒菱形）、ラットＣＮＴＦ（白四角）、およびＲＰＮ２１９（黒四角）。Ｂ．ヒトＣＮＴＦ（黒菱形）、ラットＣＮＴＦ（白四角）、およびＲＰＮ２２８（黒四角）。２ｎｇ／ｍｌのラットＣＮＴＦ存在下で生存するニューロン数の百分率として、示されたタンパク質濃度で生存する、解離したＥ８ニワトリ毛様体ニューロンの用量応答。各実験の点は、３つの測定の平均を示す。【図４】 Ａ．）ＳＣＧニューロン、およびＢ．）ＭＧ８７／ｈｕＣＮＴＦＲ線維芽細胞に対する、競合的リガンド結合。３つの測定の平均からの標準偏差を垂直なバーで示す。【図５】 ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上のヒトＣＮＴＦ分子およびいくつかの改変されたＣＮＴＦ分子の移動度。組換えヒトＣＮＴＦ（ＨＣＮＴＦと命名）およびいくつかの改変されたＣＮＴＦタンパク質の上清（Ａ）調製物およびペレット（Ｂ）調製物を、示されるように充填した。示される改変されたタンパク質は、ΔＣ１３（ＲＧ１６０としても公知）；１７ＣＡ、ΔＣ１３（ＲＧ１６２）；ΔＣ１３、６３ＱＲ（ＲＧ２９０）；および１７ＣＡ、ΔＣ１３、６３ＱＲ（ＲＧ２９７）である。示されたＭＷのマーカーをレーンＭに充填した。０日目、２日目、７日目および１４日目の３７℃での生理的緩衝液中のインキュベーションを、それぞれレーン１〜４に示す。【図６】 種々のＣＮＴＦ改変体の濃度の上昇に対する応答における、解離した初代Ｅ８ニワトリ毛様体ニューロンの生存。標準的な非処置ストック溶液を用いて、ならびに４つのｒＨＣＮＴＦ改変体（ＲＧ２９７、ＲＧ２９０、ＲＧ１６０およびＲＧ１６２）を用いて得られる、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコントロール濃度応答曲線。【図７】 種々のＣＮＴＦ改変体の濃度の上昇に対する応答における、解離した初代Ｅ８ニワトリ毛様体ニューロンの生存。標準的な非処置ストック溶液を用いて、ならびにｒＨＣＮＴＦ改変体ＲＧ２２８（ＲＰＮ２２８としても公知であり、そして変異６３ＱＲを有する）を用いて得られる、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコントロール濃度応答曲線。【図８】 種々のＣＮＴＦ改変体の濃度の上昇に対する応答において、解離した初代Ｅ８ニワトリ毛様体ニューロンの生存。標準的な非処置ストック溶液を用いて、ならびに４つのｒＨＣＮＴＦ改変体ＲＧ２４２（これは、変異６３ＱＲ、６４ＷＡを有する。）を用いて得られる、ラットＣＮＴＦおよびｒＨＣＮＴＦについてのコントロール濃度応答曲線。【図９】 ラットにおいて、全ての３つの化合物について１００μｇ／ｋｇ用量に正規化した、ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の静脈内（ｉｖ）投与後の平均血漿濃度の時間プロフィール。【図１０】 ラットにおいて、全ての３つの化合物について２００μｇ／ｋｇ用量に正規化した、ｒＨＣＮＴＦ、ＲＧ２２８およびＲＧ２４２の皮下（ＳＣ）投与後の平均血漿濃度の時間プロフィール。【図１１】 （Ａ）ｈＣＮＴＦ対ＲＧ２２８；（Ｂ）ｈＣＮＴＦ対ＲＧ２９７および（Ｃ）ｈＣＮＴＦ対ＲＧ２４２、のラット筋肉湿性重量の用量依存性レスキューの比較。【図１２】 ｈＣＮＴＦ、ＲＧ２２８、ＲＧ２４２およびＲＧ２９７についてのインビボでの毒性の比較。【図１３】 ニューロトロフィンで処置し、そしてキノリン酸を注射した脳からの代表的なＮｉｓｓｌ染色切片（冠状平面）。一番上の左：インタクトな尾状の被殻（ＣＰｕ）の表示。近接するパネル：ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３で処置され、そしてキノリン酸を注射された脳からの切片の比較表示。ニューロトロフィンで処置された脳において、周囲の領域（白矢印で示される）は、中程度のサイズのニューロンを実質的に欠く。ＣＰｕにおける２つのトラックを、注入カニューレ（ｃ）およびキノリン酸注射針（矢印頭部）により残した。ｅｃは、外部カプセル；ＬＶは、外側脳室。目盛りバー＝０．５ｍｍ。【図１４】 ＣＮＴＦまたはＰＢＳで処置し、そしてキノリン酸を注射した脳からの代表的なＮｉｓｓｌ染色切片（冠状平面）。一番上の左：インタクトな尾状の被殻（ＣＰｕ）の表示。一番上の右：多数の中程度のサイズのニューロン（これらの少数を矢印で示す）を示す外側のＣＰｕのより拡大した表示。中段および一番下の左：ＰＢＳまたはＣＮＴＦで処置し、そしてキノリン酸を注射した脳における左ＣＰｕ。ＣＰｕにおける２つのトラックは、ＰＢＳまたはＣＮＴＦ注入カニューレ（Ｃ）およびキノリン酸注射針（矢印頭部）により残る；白矢印は、病変の内側の境界を示す。中部および一番下の右：ＰＢＳで処置した脳において培地サイズの線条体ニューロンの実質的な完全な非存在（ニューロンスコア＝４）、およびＣＮＴＦで処置した脳において多数の正常のようであるニューロンの存在（いくつかの生存しているニューロンを矢印で示す；ニューロン損失スコア＝２）を例示するカニューレの２５０μｍ外側の拡大表示。ｅｃは、外部カプセル；ＬＶは、外側の脳室。左の目盛りのバー＝０．５ｍｍ；右の目盛りバー＝３０μｍ。【図１５】 キノリン酸（ＱＡ）の線条体内注射により誘導される中程度のサイズの線条体ニューロン損失における神経栄養因子での処置の効果。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ。神経栄養性因子またはＰＢＳで処置およびキノリン酸を注射され、そしてキノリン酸で処置された群についての平均ニューロン損失スコア（±ＳＥＭ）。各々の栄養因子で処置された群におけるラットの数は、以下の通りである：ＮＧＦ＝５；ＢＤＮＦ＝１２；ＮＴ−３＝１０；ＣＮＴＦ＝３；Ａｘ１＝７；等価な数を、各実験においてＰＢＳ処置したコントロール群に使用した。統計学的比較を、片側ｔ検定によった。ＮＴ−３処置は、ＰＢＳで処置した群と比較して、有意に大きい（＋）平均ニューロン損失スコア）を生じた：ｔ（１７）＝２．７５、ｐ＝０．０１。ＣＮＴＦまたはＡｘ１処置は、ＰＢＳで処置した群と比較して、有意により低い（*）平均ニューロン損失スコアを生じた：それぞれ、ｔ（５）＝２．７、ｐ＝０．０４およびｔ（１３）＝４．２、Ｐ＝０．００１。【図１６】 キノリン酸（ＱＡ）の線条体内注射により誘導される培地サイズの線条体ニューロン損失における神経栄養因子での処置の効果。各グラフの上の時間系列は、実験計画を示す。Ａ．浸透ポンプを、４日間だけ移植し、そしてキノリン酸の注射を、ポンプの除去した３日後に与えたことを除いて、図１の解説に記載されたものと類似する実験概念図においてＡｘ１（ｎ＝６）またはＰＢＳ（ｎ＝５）で処置された群についての平均ニューロン損失スコア（±ＳＥＭ）。Ｂ．キノリン酸の注射の３日前および１日後にＡ×１（ｎ＝６）またはＰＢＳ（ｎ＝６）の線条体内注射を毎日受けている群についての平均ニューロン損失スコア。*片側ｔ検定、Ａ：ｔ（９）＝２．５、ｐ＝０．０３；Ｂ：ｔ（１０）＝２．３、ｐ＝０．０４。【図１７】 正常なマウスにおけるアキソカイン−１５（Ａｘ−１５）の効果。正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．１ｍｇ/ｋｇ、０．３ｍｇ/ｋｇ、または１．０ｍｇ/ｋｇでビヒクルまたはＡｘ−１５のいずれかを、６日間毎日皮下に注射した。ビヒクルで処置したコントロールに対するＡｘ−１５で処置した場合の体重の変化の百分率を示す。【図１８】 ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡｘ−１５の効果。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｏｂ／ｏｂマウスは、ビヒクル、レプチン（１．０ｍｇ／ｋｇ）あるいは０．１ｍｇ/ｋｇ、０．３ｍｇ/ｋｇ、または１．０ｍｇ/ｋｇのＡｘ−１５のいずれかを用いて７日間毎日皮下に注射された。食餌制限した対で餌を与えられたマウスに、体重の減少における食物摂取の効果を調査するために、０．３ｍｇ/ｋｇのＡｘ−１５を注射した。ビヒクルで処置したコントロールに対する、Ａｘ−１５で処置した場合およびレプチンで処置した場合の変化の百分率を示す。【図１９】 マウスにおいて食餌で誘導した肥満におけるＡｘ−１５の効果。ＡＫＲ／Ｊマウスは、ビヒクル、レプチン（１．０ｍｇ／ｋｇ）あるいは０．０３ｍｇ/ｋｇ、０．１ｍｇ/ｋｇ、０．３ｍｇ/ｋｇ、または１．０ｍｇ/ｋｇでＡｘ−１５のいずれかを用いる処置の前に７日間高脂肪食に置いた。食餌制限し、対で餌を与えられたＡＫＲ／Ｊマウスに、体重の減少における食物摂取の効果を調査するために、０．３ｍｇ/ｋｇのＡｘ−１５を注射した。ビヒクルで処置したコントロールに対する、Ａｘ−１５で処置した場合およびレプチンで処置した場合の変化の百分率を示す。【図２０】 食餌で誘導した肥満ＡＫＲ／Ｊマウスにおける血清インスリンおよびコルチコステロンのレベルにおけるＡｘ−１５および食餌制限の効果。図２０Ａ．ＡＲＫ／Ｊ食餌誘導肥満マウスにおいて、肥満関連高インスリン血症における食餌および／またはＡｘ−１５処置の効果を決定するために、ビヒクル、食事制限およびＡｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）またはＡｘ−１５単独（０．１ｍｇ／ｍｌ）での処置の後に、血清インスリンレベルを測定した。図２０Ｂ．ＡＲＫ／Ｊ食餌誘導肥満マウスにおいて、肥満関連高インスリン血症における食餌および／またはＡｘ−１５処置の効果を決定するために、ビヒクル、食事制限およびＡｘ−１５（０．１ｍｇ／ｋｇ）またはＡｘ−１５単独（０．１ｍｇ／ｍｌ）での処置の後に、血清コルチコステロンレベルを測定した。【図２１】 食餌で誘導された肥満を有するマウスにおいて、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５（モノ−２０Ｋ−ＰＥＧ−Ａｘ−１５）は、体重減少を生じる際に非ＰＥＧ化Ａｘ−１５よりも４倍効果的であった。ＤＩＯマウスは、１３日間にわたって、ＰＢＳ、Ａｘ−１５（０．７ｍｇ／ｋｇ）、または１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５（０．２３および０．７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかに毎週皮下注射（*）を与えた。この動物の体重を毎日測定し、そして平均体重の変化を、基準からの変化の百分率＋／−ＳＥＭ（１群当たりｎ＝６）として表した。【図２２】 食餌で誘導された肥満を有するマウスにおいて、１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５は、非ＰＥＧ化Ａｘ−１５よりも効果的に食物摂取を減少させた。１３日間にわたって毎日、ＰＢＳ、Ａｘ−１５（０．７ｍｇ／ｋｇ）、または１−２０−ＰＥＧ Ａｘ−１５（０．２３および０．７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、ＤＩＯマウスに皮下注射（*）を与えた。食物摂取を２４時間毎に記録し、そして結果を、消費されたペレットの平均ｇ体重＋／−ＳＥＭ（１群当たりｎ＝６）として表した。 １７位のシステイン残基のアラニン残基への置換、６３位のグルタミン残基のアルギニン残基への置換、および、カルボキシル末端１５アミノ酸残基の欠失を有する、改変されたヒト毛様体神経栄養因子。 請求項１に記載の改変されたヒト毛様体神経栄養因子をコードする、単離された核酸分子。 発現制御配列に作動可能に連結された、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。 請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された、宿主細胞。 改変された毛様体神経栄養因子分子を産生するための方法であって、以下：（ａ）請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を増殖させる工程であって、その結果、該ＤＮＡ分子が該宿主細胞により発現されて、該改変された毛様体神経栄養因子分子を産生する、工程、および（ｂ）該発現され、改変された毛様体神経栄養因子分子を単離する工程、を含む、方法。 前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項５に記載の方法。 前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項５に記載の方法。 前記真核生物細胞が細菌細胞である、請求項７に記載の方法。 前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項８に記載の方法。 ポリエチレングリコールでＰＥＧ化されている、請求項１に記載の改変されたヒト毛様体神経栄養因子。 １７位のシステイン残基のアラニン残基への置換、６３位のグルタミン残基のアルギニン残基への置換、および、カルボキシル末端１３アミノ酸残基の欠失を有し、ポリエチレングリコールでＰＥＧ化されている、改変されたヒト毛様体神経栄養因子。 ２０ｋＤのＰＥＧでモノＰＥＧ化されている、請求項１０または１１に記載の改変されたヒト毛様体神経栄養因子。 請求項１、１０、１１または１２に記載の改変された毛様体神経栄養因子分子、およびキャリアを含む、組成物。 神経系の疾患または障害の処置において使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１、１０、１１もしくは１２に記載の改変された毛様体神経栄養因子分子または請求項１３に記載の組成物を含む、組成物。 前記疾患または障害が変性疾患である、請求項１４に記載の組成物。 前記疾患または障害が脊髄、運動ニューロン、コリン作用性ニューロンまたは海馬の細胞に関する、請求項１４に記載の組成物。 請求項１４に記載の組成物であって、ここで前記神経系の疾患または障害が外傷、手術、梗塞形成、感染、悪性疾患および毒性因子への曝露から選択される事象により生じる神経系に対する損傷を含む、組成物。 前記疾患または障害が筋萎縮症を含む、請求項１４に記載の組成物。 線条体ニューロンを変性から保護するために使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１、１０、１１もしくは１２に記載の改変された毛様体神経栄養因子分子または請求項１３に記載の組成物を含む、組成物。 中枢神経系への直接投与によりハンティングトン病の処置において使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１、１０、１１もしくは１２に記載の改変された毛様体神経栄養因子分子または請求項１３に記載の組成物を含む、組成物。 哺乳動物において体重の減少の誘導に使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１、１０、１１もしくは１２に記載の改変された毛様体神経栄養因子分子または請求項１３に記載の組成物を含む、組成物。 前記哺乳動物がヒトである、請求項２１に記載の組成物。 前記組成物が、病的な肥満または遺伝的に決定された起源の肥満の処置に使用される、請求項２２に記載の組成物。 ヒトにおける妊娠発症糖尿病または成人発症糖尿病の発生の予防または処置に使用するための組成物であって、該組成物は、請求項１、１０、１１もしくは１２に記載の改変された毛様体神経栄養因子分子または請求項１３に記載の組成物を含む、組成物。 投与が、静脈内、皮下、筋肉内、クモ膜下腔、脳室内および実質内から選択される送達経路を介するか、または前記改変された毛様体神経栄養因子を放出する細胞の移植を介する、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の組成物。