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| タイトル： | 特許公報(B2)_酵母染色体に外来遺伝子を挿入する方法 |
| 出願番号： | 2000356617 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12N15/09 |
特許情報キャッシュ
山本 歩 JP 3612559 特許公報(B2) 20041105 2000356617 20001122 酵母染色体に外来遺伝子を挿入する方法 独立行政法人情報通信研究機構 301022471 芳村 武彦 100102299 山本 歩 20050119 7 C12N15/09 C12N15/09 C12R1:645 JP C12N15/00 A C12N15/00 A C12R1:645 7 C12N 15/09 BIOSIS/WPI(DIALOG) JSTPlus(JOIS) 日本農芸化学会誌，1994, Vol.68, No.7, p.1126-1129 6 2002153273 20020528 28 20001122 七條 里美 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、医学、生物学における基礎研究に有用な、酵母染色体の任意の位置に外来遺伝子を挿入する方法に関する。【０００２】【従来の技術】酵母は遺伝子工学を用いた解析が容易であり、しかもその細胞内の構造、機能などが人間などの高等真核生物と類似点が多く、真核生物のあらゆる研究のモデル生物として、医学、あるいは生物学の分野で広く利用されている。酵母染色体に外来遺伝子を挿入して染色体を改変する従来の方法は、挿入したいＤＮＡ断片の両端に挿入したい染色体部位と同じ配列を持つＤＮＡ断片を作製し、この断片を細胞内に導入し、細胞内の相同組み換えを利用して任意の部位に挿入するというものである。そして、染色体と同じ配列を両端に持つＤＮＡ断片を作製するには（１）酵素処理によって染色体と同じ配列を持つ断片を結合させてプラスミドベクターに挿入し、大腸菌等の宿主を用いて増やす、あるいは（２）ＰＣＲ法のプライマーとして染色体と同じ配列を持つものを用いて挿入断片の両端に染色体の配列を持つものをＰＣＲ法を用いて増やし、それを酵母内に形質転換によって導入し、相同組み換えによって染色体の任意の部位に挿入する方法が使用されている。（図１５参照）【０００３】しかしながら、（１）の場合、外来遺伝子を染色体のいろいろな部位に挿入したい場合にはその都度、酵素処理を行ったあと、宿主で増やさなければならない。このとき挿入断片が大きい、あるいは宿主内で組み換えが起りやすく操作しづらい場合には、目的とする外来遺伝子が挿入された染色体を得ることは非常に困難である。また（２）の場合、挿入しようとするＤＮＡ断片のサイズが大きかったり、反復配列を持つ断片ではＰＣＲ法で増やすことは非常に難しい。【０００４】【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技術の問題点を解消して、酵母染色体の任意の位置に、所望の外来遺伝子を簡単な操作で効率良く挿入することのできる方法を提供することを目的とする。【０００５】【課題を解決するための手段】本発明では、上記課題を解決するために、次のような構成をとるものである。１．以下の工程を含むことを特徴とする酵母染色体に外来遺伝子を挿入する方法：（１）ターゲット配列となるＤＮＡ断片の両側に、酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を作製する工程、（２）該ＤＮＡ断片と酵母染色体の相同組み換えによって、ターゲット配列を導入した酵母染色体を得る工程、（３）ターゲット配列と相同組み換え可能なＤＮＡ断片とマルチクローニングサイトを有するプラスミドに、外来遺伝子を挿入する工程、（４）ターゲット配列を導入した酵母染色体と外来遺伝子を挿入したプラスミドの相同組み換えによって、外来遺伝子を挿入した酵母染色体を得る工程。２．ターゲット配列として、第１のマーカー遺伝子の部分断片及び第２のマーカー遺伝子を使用し、第２のマーカー遺伝子によってターゲット配列を導入した酵母染色体を選別することを特徴とする１に記載の方法。３．ターゲット配列と相同組み換え可能なＤＮＡ断片として、第１のマーカー遺伝子を使用することを特徴とする２に記載の方法。４．酵母染色体が分裂酵母の染色体であることを特徴とする１〜３にいずれかに記載の方法。５．第１のマーカー遺伝子が分裂酵母のura４遺伝子であり、第２のマーカー遺伝子がkanamycine耐性遺伝子であることを特徴とする４に記載の方法。６．工程（１）の酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法によって作製することを特徴とする１〜５にいずれかに記載の方法。【０００６】【発明の実施の形態】本発明では、はじめにターゲット配列となるＤＮＡ断片の両端に、外来遺伝子を挿入する部位の染色体配列を持たせ、相同組み換えによって酵母染色体にターゲット配列を導入する。つぎに、得られた酵母染色体のターゲット配列に、所望の外来遺伝子の挿入を行なうものである。すなわち、酵母染色体に挿入可能なＤＮＡ断片を得るための大腸菌等の宿主での操作、或いはＰＣＲ法による操作は、その操作が簡単なターゲット配列に対して行うものである。そして、目的とする外来遺伝子は、単にプラスミドのマルチクローニングサイトに組み込むことによって、相同組み換えによってターゲット配列を導入した酵母染色体に挿入することが可能となる。したがって、本発明の方法によれば、ターゲット配列の両側に設ける酵母染色体と相同な配列を選択することによって、酵母染色体の任意の部位に外来遺伝子を挿入することが可能となり、またその際に、従来技術で生じる種々の問題点を解消することができる。【０００７】つぎに、図に基づいて、本発明をさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。図１は、本発明の方法における工程の概略を示す模式図である。本発明では、２種類のプラスミドベクターを使用する。プラスミド１は、酵母染色体に導入するターゲット配列を含むプラスミドであり、プラスミド２は、ターゲット配列を導入した酵母染色体に目的とする外来遺伝子を組み込むためのプラスミドである。この例では、プラスミド１のターゲット配列として、第１のマーカー遺伝子（図１のマーカー遺伝子Ｂ）の部分断片と、これに接続する第２のマーカー遺伝子（図１のマーカー遺伝子Ａ）を使用する。そして、例えばＰＣＲ法によって、このプラスミド１のターゲット配列の両側に、酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を作製する。つぎに、得られたＤＮＡ断片と酵母染色体の相同組み換えによって、ターゲット配列を導入した酵母染色体を得る。その際に、目的とする酵母染色体はマーカー遺伝子Ａによって選別する。【０００８】一方、プラスミド２は、マルチクローニングサイトと第１のマーカー遺伝子Ｂを有するものであり、マルチクローニングサイトに酵母染色体に挿入する外来遺伝子を挿入する。この外来遺伝子を挿入したプラスミド２を、上記のターゲット配列を導入した酵母染色体と、第１のマーカー遺伝子Ｂの部位で相同組み換えすることによって、目的とする外来遺伝子を挿入した酵母染色体を得る。上記の工程をとることによって、酵母染色体に挿入する外来遺伝子は、プラスミド２のマルチクローニングサイトに単にクローニングするだけで、それ以上操作する必要はない。また、酵母染色体に導入可能なターゲット配列を有するＤＮＡ断片を得るための、ＰＣＲ法や大腸菌等の宿主による操作は、小型のプラスミド１に対して行なえばよく、操作が容易になる。したがって、本発明の方法では、従来技術の問題点を解消し、酵母染色体の任意の部位に、任意の外来遺伝子を挿入することが可能となる。【０００９】【実施例】（実施例１）分裂酵母のａｄｅ８遺伝子座へ外来遺伝子としてｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ反復配列を組み込む例について、以下に説明する。（ｐＣＴ３３−６の構築、およびその構造）分裂酵母のｕｒａ４遺伝子を持つｐＲＥＰ２ベクター（Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ， Ｋ． １９９３． Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｐＲＥＰ ａｎｄ ｐＲＩＰ ｆｏｒ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ． Ｇｅｎｅ． １２３：１２７−１３０）を鋳型とし、プライマー１：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号１）及びプライマー２：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＣＣ（配列番号２）をそれぞれ使用しｕｒａ４遺伝子のＣ末側、２４２アミノ酸を含み、両端にＢａｍＨＩサイト（プライマー中の下線部）を有するＤＮＡ断片を増幅、取得する。その後この断片をＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩ断片を得る。また、ｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ６ベクター（Ｗａｃｈ， ｅｔ ａｌ． １９９４． Ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｄｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｙｅａｓｔ． １０：１７９３−１８０８）をＢｇｌＩ（図２中、枠囲い）で切断する。その後、このＢａｍＨＩ断片とｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ６ベクターをライゲーションしてｐＣＴ３３−６を取得する。ｐＣＴ３３−６を取得する手順を図２に、また得られたｐＣＴ３３−６の制限酵素地図を図３に示す。図中、ＡｍｐＲはアンピシリン耐性遺伝子、ｕｒａ４−ｐａｒｔｉａｌはｕｒａ４代謝系遺伝子部分断片、ｋａｎＲはカナマイシン耐性遺伝子、ＰｔｅｆはＡ．ｇｏｓｙｐｉｉＴＥＦ遺伝子プロモーター、そしてＴｔｅｆはＡ．ｇｏｓｙｐｉｉＴＥＦ遺伝子ターミネーターを表す。また、挿入されたｕｒａ４遺伝子断片のＤＮＡ配列を図４及び配列番号３に示す。【００１０】（ｐＣＴ３０の構築およびその構造）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）をＮａｅＩで（図５中、枠囲い）消化後、ＢｇｌＩＩリンカー（宝酒造製）を挿入する。その後ＢｇｌＩＩで切断する。また、分裂酵母のｕｒａ４遺伝子を持つｐＲＥＰ２ベクターを鋳型とし、プライマー３：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号４）プライマー４：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号５）をそれぞれ使用し、ＰＣＲ法によりｕｒａ４遺伝子を含み、両端にＢａｍＨＩサイト（プライマー中の下線部）を有するＤＮＡ断片を増幅、取得する。その後この断片をＢａｍＨＩで切断し、このＢａｍＨＩ断片をＢｇｌＩＩで切断したベクターとライゲーションを行ってｐＣＴ３０を取得する。ｐＣＴ３０を取得する手順を図５に、そして、得られたｐＣＴ３０の制限酵素地図を図６に示す。また、挿入されたｕｒａ４遺伝子を含む断片のＤＮＡ配列を図７及び配列番号６に示す。【００１１】（ｐＣＴ３１の構築およびその構造）ｐＳＶ２ｄｈｆｒ８．３２プラスミド（Ｒｏｂｉｎｅｔｔ， Ｃ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ／ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３５：１６８５−１７００．）より制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｌＩでｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ配列が２５６コピーつながったＤＮＡ配列を持つ断片を切り出す。ｐＣＴ３０をＸｈｏＩ（図８中、枠囲い）で切断後、この断片をライゲーションによって挿入し、ｐＣＴ３１を構築する。プラスミドｐＣＴ３１の構築手順を図８に示す。図８において、ｕｒａ４はウラシル代謝系遺伝子、ＭＣＳはマルチクローニングサイト、そしてｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｒはｌａｃオペレータ反復配列を表す。【００１２】（分裂酵母のａｄｅ８遺伝子座への組み込み）分裂酵母のａｄｅ８遺伝子領域と相同な配列を有する以下の二つのプライマー５（配列番号７）及びプライマー６（配列番号８）を用い、ｐＣＴ３３−６を鋳型としてＰＣＲ法によって増幅する。これによって両端にａｄｅ８遺伝子領域と相同な配列を持ち、ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子とｕｒａ４遺伝子断片を有するＤＮＡ断片を取得する。以下のプライマーの下線部はａｄｅ８領域と相同な配列を示し、下線のない配列はｐＣＴ３３−６と相同な領域である。また、ａｄｅ８領域のＤＮＡ配列を図９及び配列番号９に示し、図９中の下線部はプライマー５、６に使用した配列を示す。ｐｒｉｍｅｒ５（配列番号７）：ＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＡＣＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＡＧ ＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡｐｒｉｍｅｒ６（配列番号８）：ＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＴＡＧＣＡＣＣＧＴＧＣＴＴＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣ ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＡ【００１３】得られたＤＮＡ断片をｕｒａ４−Ｄ１８というｕｒａ４遺伝子を欠失した変異をもつ分裂酵母の株に、リチウムクロライド法（Ｍｏｒｅｎｏ， Ｓ， ｅｔ． ａｌ． １９９１． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９４： ７９３−８２３．）による形質転換によって導入した。ｋａｎａｍｙｃｉｎｅにより選別して得られたｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性形質転換株のうち、〜３０％がａｄｅ８領域に正しくＤＮＡ断片が挿入されたものであった。次にプラスミドｐＣＴ３１をｕｒａ４遺伝子内に存在するＳｔｕＩで切断し、直鎖状とした。この直鎖プラスミドをリチウムクロライド法により、ａｄｅ８遺伝子座にｕｒａ４遺伝子断片とｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子が組み込まれた分裂酵母の株に導入した。相同組換えにより得られたｕｒａ＋形質転換株の〜１００％が、ａｄｅ８遺伝子座にｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ反復配列をもつｐＣＴ３１が正しく組み込まれたものであった。【００１４】（実施例２）つぎに、分裂酵母のａｄｅ６遺伝子座へ外来遺伝子としてｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ反復配列を組み込む例について説明する。ａｄｅ６遺伝子座への組み込みにはまず、ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子＋ｕｒａ４遺伝子断片の両側にａｄｅ６領域と相同なＤＮＡ配列をもつプラスミドｐＣＴ３４を作製し、そこからその断片を切り出して細胞へ導入することによって行った。以下にｐＣＴ３４の作製法、および組み込み法を示す。【００１５】（ｐＣＴ３４の作製）ａｄｅ６−４６９の変異のあるａｄｅ６遺伝子（Ｓｚａｎｓｋｉ， Ｐ， ｅｔ． ａｌ． １９８８． ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅ６ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｏｔ ｓｐｏｔ ａｌｌｅｌｅ ａｄｅ６−Ｍ２６． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０４：９１７−９２５．）を持つプラスミド、ｐａｄｅ６−４６９より、ａｄｅ６遺伝子領域をＰｖｕＩＩ−ＳｐｅＩで切り出す。切り出したＤＮＡの配列を図１０、１１及び配列番号１０に示す。図１０、１１において、白四角はＰｖｕＩＩあるいはＳｐｅＩサイトを示し、＊は停止コドンを示す。また、括弧内は変異のないａｄｅ６のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。切り出した断片をｐＲＳ３０６（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ． Ｓ． ａｎｄ Ｈｉｅｔｅｒ， Ｐ． １９８９． Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｓｈｙｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｓｉｎｇｎｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １２２： １９−２７．）のＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳｐｅＩサイトにライゲーションによって挿入し、プラスミドｐＣＴ３２を得た。（図１２）。得られたプラスミド、ｐＣＴ３２よりａｄｅ６蛋白質のコード領域の約４分の３にあたるＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出して除く。（図１３）。そしてｐＣＴ３３−６より切り出したｕｒａ４遺伝子断片とｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を含むＢａｎＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をこの部分にライゲーションによって挿入し、プラスミドｐＣＴ３４を作製した。ｐＣＴ３４を作製する手順を図１２及び図１３に示す。【００１６】（ａｄｅ６遺伝子座への組み込み）ｐＣＴ３４よりａｄｅ６の領域と相同な配列を両端に持ち、しかもｕｒａ４遺伝子断片とｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を持つＤＮＡ断片をＸｈｏＩによって切り出す。（図１４、枠囲い）。このＸｈｏＩ断片をリチウムクロライド法によってｕｒａ４−Ｄ１８の変異を持つ分裂酵母の株に導入する。ｋａｎａｍｙｃｉｎｅにより選別して得られたｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性形質転換株のうち、〜９０％がａｄｅ６領域に正しくＤＮＡ断片が挿入されたものであった。次にａｄｅ８への組み込みの時と同様に、プラスミドｐＣＴ３１をＳｔｕＩで切断し、直鎖状とし、ａｄｅ６遺伝子座にｕｒａ４遺伝子断片とｋａｎａｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子が組み込まれた分裂酵母の株に導入した。相同組換えにより得られたｕｒａ＋形質転換株の〜１００％が、ａｄｅ６遺伝子座にｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒ反復配列をもつｐＣＴ３１が正しく組み込まれたものであった。【００１７】上記の実施例では、本発明を分裂酵母の染色体に適用した例について説明したが、本発明は出芽酵母の染色体にも適用することができるものである。【００１８】【発明の効果】本発明では、酵母染色体への外来遺伝子の組み込みを２段階で行うものであり、酵母染色体に挿入可能なＤＮＡ断片を得るための大腸菌等の宿主での操作、或いはＰＣＲ法による操作は、その操作が簡単なターゲット配列に対して行う。そして、目的とする外来遺伝子は、単にプラスミドのマルチクローニングサイトに組み込むことによって、相同組み換えによってターゲット配列を導入した酵母染色体に挿入するものである。したがって、本発明の方法によれば、ターゲット配列の両側に設ける酵母染色体と相同な配列を選択することによって、酵母染色体の任意の部位に外来遺伝子を挿入することが可能となり、またその際に、従来技術で生じる種々の問題点を解消することができる。【配列表】【図面の簡単な説明】【図１】本発明の工程の概略を示す模式図である。【図２】プラスミドｐＣＴ３３−６を取得する手順を示す図である。【図３】プラスミドｐＣＴ３３−６の制限酵素地図を示す図である。【図４】ｕｒａ４遺伝子断片のＤＮＡ配列を示す図である。【図５】プラスミドｐＣＴ３０を取得する手順を示す図である。【図６】プラスミドｐＴＣ３０の制限酵素地図を示す図である。【図７】ｕｒａ４遺伝子を含む断片のＤＮＡ配列を示す図である。【図８】プラスミドｐＣＴ３１を取得する手順を示す図である。【図９】ａｄｅ８領域のＤＮＡ配列を示す図である。【図１０】ａｄｅ６領域のＤＮＡ配列を示す図である。【図１１】ａｄｅ６領域（図１０の配列の続き）のＤＮＡ配列を示す図である。【図１２】プラスミドｐＣＴ３２を取得する手順を示す図である。【図１３】プラスミドｐＣＴ３４を取得する手順を示す図である。【図１４】ａｄｅ６遺伝子座へ外来遺伝子を組み込む手順を示す図である。【図１５】染色体に外来遺伝子を挿入する従来の方法を示す図である。 以下の工程を含むことを特徴とする酵母染色体に外来遺伝子を挿入する方法：（１）ターゲット配列となるＤＮＡ断片の両側に、酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を作製する工程、（２）該ＤＮＡ断片と酵母染色体の相同組み換えによって、ターゲット配列を導入した酵母染色体を得る工程、（３）ターゲット配列と相同組み換え可能なＤＮＡ断片とマルチクローニングサイトを有するプラスミドに、外来遺伝子を挿入する工程、（４）ターゲット配列を導入した酵母染色体と外来遺伝子を挿入したプラスミドの相同組み換えによって、外来遺伝子を挿入した酵母染色体を得る工程。 ターゲット配列として、第１のマーカー遺伝子の部分断片及び第２のマーカー遺伝子を使用し、第２のマーカー遺伝子によってターゲット配列を導入した酵母染色体を選別することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ターゲット配列と相同組み換え可能なＤＮＡ断片として、第１のマーカー遺伝子を使用することを特徴とする請求項２に記載の方法。 酵母染色体が分裂酵母の染色体であることを特徴とする請求項１〜３にいずれかに記載の方法。 第１のマーカー遺伝子が分裂酵母のura４遺伝子であり、第２のマーカー遺伝子がkanamycine耐性遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載の方法。 工程（１）の酵母染色体の外来遺伝子を挿入する部位と相同な配列を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法によって作製することを特徴とする請求項１〜５にいずれかに記載の方法。