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| タイトル： | 特許公報(B2)_エキソポリガラクツロナーゼ |
| 出願番号： | 2000073580 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C12N 9/26,C12N 1/20,C12R 1/07 |
特許情報キャッシュ
桧垣 紀彦 海藤 洋子 谷島 則幸 凉松 淳 小林 徹 川合 修次 JP 4382952 特許公報(B2) 20091002 2000073580 20000316 エキソポリガラクツロナーゼ 花王株式会社 000000918 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 的場 ひろみ 100101317 山本 博人 100111028 桧垣 紀彦 海藤 洋子 谷島 則幸 凉松 淳 小林 徹 川合 修次 20091216 C12N 9/26 20060101AFI20091126BHJP C12N 1/20 20060101ALI20091126BHJP C12R 1/07 20060101ALN20091126BHJP JPC12N9/26 ZC12N1/20 AC12N1/20 AC12R1:07 C12N 1/00 - 7/08 C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 C12P 1/00 - 41/00 CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) PubMed 特開２００１−１７８４５４（ＪＰ，Ａ） 特開２００１−２５８５５２（ＪＰ，Ａ） 特開昭５６−１３１３７６（ＪＰ，Ａ） 特開昭５６−０６８３９３（ＪＰ，Ａ） 国際公開第９８／００６８０９（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第９９／０２７０８３（ＷＯ，Ａ１） 特開２００１−２５８５５３（ＪＰ，Ａ） Archives of Biochemistry and Biophysics，１９６１年，Vol.94，p.328-332 Agri. Biol. Chem.，１９７２年，Vol.36, No.2，p.285-293 Enzyme and Microbial Technology，１９９９年，Vol.25，p.420-425 3 FERM P-17561 2001258554 20010925 11 20060803 ▲高▼ 美葉子 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、ガラクツロン酸の調製、洗浄剤等に有用なエキソポリガラクツロナーゼに関する。【０００２】【従来の技術】ペクチン質を分解する酵素にはポリガラクツロナーゼ（ペクチナーゼ）、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ等が知られている。食品工業分野ではこれらの酵素を有効に利用し、果汁、ワイン等の清澄化、柑橘類ジュースの搾汁率の向上、果物残渣から可溶性成分の回収、みかん果皮の剥皮等に応用している。特に食品工業分野においては一般的に作用ｐＨの低い領域で効率良く働くポリガラクツロナーゼが使用されるが、事実、従来公知のポリガラクツロナーゼの最適反応ｐＨは殆どが酸性側に存在している。【０００３】一方、ジャム、ケチャップ、ジュースなどのペクチン質含量の高い食物の衣服についた食べこぼしや染み汚れの除去にポリガラクツロナーゼを衣料洗剤用酵素として利用しようとする試みもあり、例えば、特開昭６０−２２６５９９号公報、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９８／０６８０９号等が開示されている。【０００４】【発明が解決しようとする課題】衣料用洗剤や他の洗浄剤等にポリガラクツロナーゼを用いる場合には、酵素が中性からアルカリ性領域で作用すること、洗浄剤の成分である界面活性剤等に対し安定であることが必要である。また、ペクチン酸からガラクツロン酸やジガラクツロン酸を効率的に得るためエキソタイプのガラクツロナーゼの利用が考えられるが、この際ペクチン酸の溶解性を考慮すると中性付近で最も良好に作用するエキソポリガラクツロナーゼが望まれる。【０００５】しかしながら、従来公知のエキソポリガラクツロナーゼは、ほとんどその最適反応ｐＨが６以下である。このような状況下、高い最適反応ｐＨを示すエキソポリガラクツロナーゼが２種類知られている。このうち、セレノモナス ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）由来の酵素は、最適反応ｐＨを７付近に示すが、作用ｐＨならびに安定ｐＨ範囲が非常に狭いことが特徴であり、最適反応温度は４０℃付近で、反応産物はジガラクツロン酸である（Heinrichova et al.,J. Appl. Bacteriol., 66, 169-174, 1989）。一方、フザリウム オキシスポラム（Fusarium oxysporum）株由来の酵素はポリガラクツロン酸を基質にした場合の最適反応ｐＨは５付近に存在する。反応生成物はモノガラクツロン酸であるが、ＳＤＳにより著しく阻害されること、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛等の金属イオンによって阻害されることなど（Maceira et al., FEMS Microbiol. Lett., 154, 37-43, 1997）洗浄剤用酵素としては適さない。【０００６】従って本発明の目的は、中性付近に最適反応ｐＨを有し、キレート剤、界面活性剤に耐性を示すエキソポリガラクツロナーゼを提供することにある。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素の中から、ｐＨ７に最適反応ｐＨを有し、キレート剤、界面活性剤耐性のエキソポリガラクツロナーゼを生産する微生物を見出し本発明を完成した。【０００８】すなわち本発明は、下記の酵素学的性質を有するエキソポリガラクツロナーゼ、それを生産する微生物及びその製造法を提供するものである。（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）及びペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７（ＭＯＰＳ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液）（３）最適反応温度：約６０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）（４）ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１２（４０℃、６０分間処理）（５）耐熱性：約５５℃まで安定（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０、１５分間処理）（６）分子量：約４５０００（ＳＤＳ電気泳動法）（７）等電点：ｐＨ５．８付近（等電点電気泳動法）（８）キレート剤：ＥＤＴＡ（１０mM）により阻害されない。（９）界面活性剤耐性：界面活性剤（０．１％）に対し安定である。【０００９】【発明の実施の形態】本発明のエキソポリガラクツロナーゼは、例えばエキソポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、その培養液から採取することにより製造できる。かかる生産菌としては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ４４３株が挙げられる。【００１０】Ａ 形態学的性質（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．６〜０．８×２．４〜３．２μｍ）（ｂ）多形性：無し（ｃ）運動性：有り（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）：楕円形、０．６〜０．８×０．８〜１．０μｍ、準端、膨潤無し）（ｅ）グラム染色：不定（ＣＶＴ寒天培地には生育せず、水酸化カリウム法で粘性を示さず）（ｆ）抗酸性：陰性（ｇ）肉汁寒天培地上での生育（培地１）：乳白色、葉状のコロニーを形成【００１１】Ｂ 生理学的性質（ａ）硝酸塩の還元（培地２）：＋（ｂ）脱窒反応（培地２）：−（ｃ）ＭＲテスト（培地３）：−（ｄ）ＶＰテスト（培地３）：＋（ｅ）インドール生成（培地４）：−（ｆ）硫化水素の生成（培地５）：−（ｇ）デンプン加水分解（培地６）：＋（ｈ）ゼラチン加水分解（培地７）：＋（ｉ）カゼイン加水分解（培地８）：＋（ｊ）クエン酸の利用（培地９）：＋（ｋ）無機窒素の利用（培地１０）：＋（ｌ）ウレアーゼ（培地１１）：−（ｍ）オキシダーゼ（培地１２）：＋（ｎ）カタラーゼ：＋（ｏ）リトマスミルク（培地１３）：酸を産生し、ペプトン化する（ｐ）生育温度範囲（培地１４）：１２〜５９℃（ｑ）生育ｐＨ範囲（培地１５）：ｐＨ４〜１０（ｒ）嫌気条件下での生育（培地１６）：生育する（ｓ）ＯＦテスト（培地１７）：−（ｔ）グルコースからのガス産生（培地１８）：−（ｕ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１９）：１０％で生育（ｖ）糖からの酸生成（培地２０）：以下の糖類から酸生成を認めた。ガラクトース、リボース、キシロース、アラビノース、シュークロース、グルコース、マンニトール、マンノース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、ラフィノース、サリシン、可溶性デンプン、メリビオース、ラムノース【００１２】培地１：ニュートリエントアガー（ディフコ）培地２：ニュートリエントブロス（ディフコ）、硝酸カリウム０．１重量％培地３：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、リン酸１水素カリウム０．５重量％、グルコース（別滅菌）０．５重量％培地４：ＳＩＭ培地（日水製薬）、コバック試薬培地５：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）培地６：ニュートリエントアガー、可溶性デンプン１．０重量％培地７：ニュートリエントアガー、ゼラチン１．０重量％培地８：ニュートリエントアガー、カゼイン１．０重量％培地９：Simmons培地（栄研化学）培地１０：酵母エキス０．０５重量％、硫酸ナトリウム０．１重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、グルコース（別滅菌）１．０重量％、硝酸ナトリウム０．２５重量％又は塩化アンモニウム０．１６重量％培地１１：尿素培地（栄研化学）培地１２：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）培地１３：バクトリトマスミルク（ディフコ）培地１４：ＳＣＤ培地（日本製薬）培地１５：ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、塩酸を別滅菌後に添加し、ｐＨを調整培地１６：アナエロビックアガー（ディフコ）培地１７：ＯＦ基礎培地（ディフコ）培地１８：ニュートリエントブロス、グルコース（別滅菌）１．０重量％培地１９：ＳＣＤ培地、塩化ナトリウム２〜１０重量％培地２０：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、塩化カリウム０．０２重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、酵母エキス０．０２重量％、寒天１．５重量％、ブロモクレゾールパープル０．０００６重量％、糖類（別滅菌）１．０重量％【００１３】以上、ＫＳＭ−Ｐ４４３株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins社、1984年)の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス リケニホルミスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス リケニホルミスとは一致せず、他のバチルス属細菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１７５６１）として寄託した。【００１４】ＫＳＭ−Ｐ４４３株等のエキソポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のエキソポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。使用する炭素源、窒素源には特に制限は無く資化しうる炭素源、例えばペクチン、ペクチン酸、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコース、シュークロース、マルトース等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられる。その他リン酸塩、金属塩、有機無機微量栄養源を適宜添加することができる。培地のｐＨは、本発明の酵素生産に適したｐＨに炭酸ナトリウム等を用いて調整すれば良い。【００１５】かくして得られた培養液中からのエキソポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。すなわち、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、例えば塩析法、溶剤沈殿法、限外濃縮等により目的酵素を濃縮することができる。塩析法の例として硫酸アンモニウム（３０〜９０％飽和画分）、溶剤沈殿の例として冷アセトン（５０％以上）等の条件下において酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、セファデックスＧ−１０等を用いるゲル濾過、限外濾過等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。【００１６】本発明のエキソポリガラクツロナーゼの一例であるバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３株由来のエキソポリガラクツロナーゼは、以下のような性質を有する。尚、酵素活性の測定は以下のように行った。【００１７】［標準酵素活性測定法］試験管に０．２mLの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、０．２mLの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ６．８に調整）、０．５mLの脱イオン水を添加し、３０℃で５分間恒温した。これに０．１mLの適当に希釈した酵素液［希釈は１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った］を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmolのガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。【００１８】（１）基質特異性ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン（２８、６７、９３％）を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。本酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２）に対し最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ；ｌｏｔ１１２Ｈ３７８０、フルカ；ｌｏｔ５３９９８）を用いた場合、その反応速度は最大活性のそれぞれ８２％、７０％程度であった。エステル化度２８％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９２）では約４０％、エステル化度６７％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９３）に対して約４％の分解活性を示したが、エステル化度９３％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ１２５Ｈ０１２３）に対しては、殆ど分解活性を示さなかった。【００１９】（２）基質の分解様式５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２％ポリガラクツロン酸、０．２mM塩化カルシウムからなる反応液に０．０５Ｕの本酵素を添加し、全量を０．２５mLとした。３０℃、３０分間反応させた液を薄層クロマトプレート（ｋｉｅｓｅｌ ｇｅｌ ６０：メルク）に約１０μＬスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５：２：３（ｖ／ｖ）の展開液を用い展開を行った。反応物の検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用い、プレート噴霧後、１００℃、１０分間乾燥器中で発色させた。その結果、反応生成物としてモノガラクツロン酸のみが検出され、本酵素はエキソ型のポリガラクツロナーゼと判断された。【００２０】（３）最適反応ｐＨ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９．５）の各緩衝液（１００mM）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、本酵素はｐＨ７のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ６から８の間で最大活性の５０％以上の活性を示した（図１）。【００２１】（４）最適反応温度１００mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０℃〜９０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は６０℃付近に最適反応温度を示した（図２）。また、１mMの塩化カルシウムを添加した場合においても最適反応温度及び反応速度は全く変わらなかった。【００２２】（５）安定ｐＨ範囲酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム酸緩衝液（ｐＨ８〜１１）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２．７）の各緩衝液（５０mM）酵素を加え、４０℃、６０分間恒温した後の残存活性を測定した。処理前の活性を１００％とした場合、本酵素はｐＨ７〜１２の範囲で８０％以上の残存活性を示した（図３）。尚、１mMの塩化カルシウムを添加した場合、酵素の安定性には何ら影響を与えなかった。【００２３】（６）耐熱性５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に本酵素を添加し、３０℃〜７０℃の各温度で１５分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において５５℃まで安定であった（図４）。また、塩化カルシウム（１mM）を添加した場合も同じ安定性を示した。【００２４】（７）分子量（ＳＤＳ電気泳動法）酵素にＳＤＳ処理液を加え１００℃、２分間の熱処理を行った後、１２．５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ電気泳動を行った。標準タンパク質としてホスホリラーゼｂ（９７４００）、血清アルブミン（６７０００）、卵白アルブミン（４３０００）、カルボニックアンヒドロラーゼ（３００００）、トリプシンインヒビター（２１５００）、α−ラクトアルブミン（１４５００）を用い、それぞれの移動度と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約４５０００と推定された。【００２５】（８）等電点ＰＡＧ−Ｐｌａｔｅ（ファルマシア；ｐＨ３．５〜９．５）を用いて本酵素の等電点電気泳動を行った。泳動後、クマーシーブリリアントブルーＧ２５０によりタンパク質を染色した。標準タンパク質（バイオラッド）の等電点と移動度から得た検量線より本酵素の等電点は、ｐＨ５．８付近であると決定された。【００２６】（９）界面活性剤の影響各種界面活性剤を０．１％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素活性を測定した。その結果、０．１％という高濃度の各界面活性剤の存在下においても本酵素は、対照に比べ約６０％以上の活性を発現しうることが判った（表１）。【００２７】【表１】【００２８】（１０）キレート剤の影響本酵素を１０mM ＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０℃、３０分間恒温した後、１０倍に希釈し残存活性を測定した。標準活性測定法において塩化カルシウムを添加した場合と無添加の場合においての残存活性を比較すると双方ともに活性が９０％以上残存することから本酵素は反応、安定性にカルシウムイオンを要求しないことが判った。【００２９】このように本発明のエキソポリガラクツロナーゼは、最適反応ｐＨを７付近に、最適反応温度を６０℃付近に有するモノガラクツロン酸生成型の新規な酵素である。【００３０】【実施例】実施例１ エキソポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、２０分間熱処理し、下記の組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜７日間静置培養し、菌の生育後、０．２％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１％塩化ナトリウム、０．２Ｍクエン酸３ナトリウム、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．８％寒天から成る軟寒天を重層し、３７℃で１時間恒温した。コロニー周辺にポリガラクツロン酸の分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラクツロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３株を得た。【００３１】【表２】【００３２】実施例２ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３株によるエキソポリガラクツロナーゼの生産上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン酸、２．０％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１．０％魚肉エキス、０．１５％リン酸１水素カリウム、０．００５％硫酸マンガン、５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）であった。本培養条件においてエキソポリガラクツロナーゼの生産性は約２３０Ｕ／Ｌであった。【００３３】実施例３ エキソポリガラクツロナーゼの精製バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３株の培養液を遠心分離（９０００×ｇ、２０分間、４℃）し上清液（２．８Ｌ）を得た。これを限外濾過用モジュール（ＡＣＰ１３０００：旭化成）により濃縮、脱塩を行った（４９０mL）。得られた濃縮液は２mMβ−メルカプトエタノール、０．５mM塩化カルシウムを含む１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化しておいたＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×５０cm：東ソー）に添着した。約７５０mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させたところ、エキソポリガラクツロナーゼ活性はこの部分に溶出された。活性画分を集め（６００mL）限外濾過（ＰＭ１０メンブレン：アミコン）により濃縮、脱塩を行った（１００mL）。この濃縮液を予め２mMβ−メルカプトエタノール、１mM塩化カルシウムを含む２５mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱトヨパールカラム（２．５×３０cm：東ソー）に添着した。約４５０mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させたところ、エキソポリガラクツロナーゼ活性はこの部分に溶出された。活性画分を集め（１００mL）、限外濾過（ＰＭ１０メンブレン）により濃縮、脱塩を行った（１０mL）。この濃縮液を脱イオン水にて１０倍に希釈し、予め２mMβ−メルカプトエタノール、１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−バイオゲルＡカラム（２．５×１２cm：バイオラッド）へ添着した。平衡化緩衝液にて洗浄した後、０から０．１Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（３００mLずつ）を用い吸着タンパク質を濃度勾配法にて溶出させた。エキソポリガラクツロナーゼ活性は約７５mMの塩化カリウム濃度付近で溶出され、その画分を集め、限外濾過により濃縮、希釈を繰り返した。これを予め２mMβ−メルカプトエタノール、１mM塩化カルシウムを含む１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−バイオゲルＡカラム（２．５×１０．５cm：バイオラッド）へ添着した。平衡化緩衝液にて洗浄した後、０から０．２Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（２００mLずつ）を用い吸着タンパク質を濃度勾配法にて溶出させた。エキソポリガラクツロナーゼ活性は約８０mMの塩化カリウム濃度付近で溶出され、その画分を集め、限外濾過により濃縮した（１．７５mL）。この濃縮液を予め０．１Ｍ塩化カリウム、２mMβ−メルカプトエタノール、１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたバイオゲルＡ０５ｍカラム（１．５×７３cm：バイオラッド）へ載せゲル濾過を行った。得られた活性画分を集め限外濾過により濃縮した（１．５mL、３３．９Ｕ、１．０１mgタンパク質）。以上の操作により電気泳動的に均一なエキソポリガラクツロナーゼを活性収率約６％、比活性約１６５倍までに精製した。上記精製操作により得られたエキソポリガラクツロナーゼ画分は、前述の酵素学的性質を示した。【００３４】【発明の効果】本発明のエキソポリガラクツロナーゼは、ｐＨ７付近に最適反応ｐＨを有し、界面活性剤耐性、キレート剤耐性を有する新規酵素であり、ガラクツロン酸の調製あるいは衣料用他、洗浄剤用酵素として有用である。【図面の簡単な説明】【図１】本発明のエキソポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。【図２】本発明のエキソポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。【図３】本発明のエキソポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。【図４】本発明のエキソポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。 次の酵素学的性質を有するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６１）由来のエキソポリガラクツロナーゼ。（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）及びペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、モノガラクツロン酸を生成する。（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ７（ＭＯＰＳ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液）（３）最適反応温度：約６０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）（４）ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１２（４０℃、６０分間処理）（５）耐熱性：約５５℃まで安定（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０、１５分間処理）（６）分子量：約４５０００（ＳＤＳ電気泳動法）（７）等電点：ｐＨ５．８付近（等電点電気泳動法）（８）キレート剤：ＥＤＴＡ（１０mM）により阻害されない。（９）界面活性剤耐性：界面活性剤（０．１％）に対し安定である。 請求項１記載のエキソポリガラクツロナーゼを生産するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ４４３（ＦＥＲＭ Ｐ−１７５６１）。 請求項２記載の微生物を培養し、培養物から請求項１記載の酵素を採取するエキソポリガラクツロナーゼの製造法。