生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_シアロムチンの分泌促進剤 |
| 出願番号： | 2000018127 |
| 年次： | 2011 |
| IPC分類： | A61K 31/702,A61P 31/00,A61P 43/00,C07H 3/06 |
特許情報キャッシュ
松原 範宜 酒井 史彦 柳平 修一 池内 義弘 JP 4717175 特許公報(B2) 20110408 2000018127 20000127 シアロムチンの分泌促進剤 雪印乳業株式会社 000006699 長谷部 善太郎 100122954 児玉 喜博 100105061 松原 範宜 酒井 史彦 柳平 修一 池内 義弘 20110706 A61K 31/702 20060101AFI20110616BHJP A61P 31/00 20060101ALI20110616BHJP A61P 43/00 20060101ALI20110616BHJP C07H 3/06 20060101ALN20110616BHJP JPA61K31/702A61P31/00A61P43/00 111C07H3/06 C07H 3/06 CA/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN) 特開平０２−２０７０８９（ＪＰ，Ａ） 特開平１０−０２９９４５（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−２８３１６２（ＪＰ，Ａ） 特開平０９−１７３０６５（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−２５６７８８（ＪＰ，Ａ） 特開平０７−２５５４７２（ＪＰ，Ａ） Biosci. Biotech. Bioochem.，１９９５年，Vol.59(3)，p.417-419 1 2001206848 20010731 7 20070122 三木 寛 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、シアリルラクトース又はその塩類を有効成分とする唾液中へのシアロムチンの分泌促進剤に関する。本発明におけるシアロムチンの分泌促進剤は、唾液粘液の機能を強化する添加剤として幅広い用途を有する。【０００２】【従来の技術】ムチンは、粘膜上皮細胞によって産生及び分泌される粘液の主成分であり、高分子量(200kDa 以上) でかつ高糖含有 (分子量の 50-90％) の糖蛋白質である。また、ムチンは、糖鎖の還元末端に存在するN-アセチルガラクトサミンのO-グリコシドを介して、ポリペプチド中のセリンあるいはスレオニンの水酸基に結合している。糖鎖には、N-アセチルガラクトサミンの外に、ガラクトースやフコース、及びシアル酸 (N-アセチルノイラミン酸) が含まれている。これらの糖鎖のうち、シアル酸は、糖鎖構造の非還元末端側に結合し、ムチンの物性や生理機能の発現において重要であると考えられている。シアル酸は、通常の糖とは異なり分子内にカルボキシル基を有していることから、負に電荷し、分子内で相互に電気的な反発が起こり、その結果としてムチン分子の広がりをもたらしている。ムチンの働きとして粘膜上皮の保護や潤滑作用があり、口腔、食道、胃及び小腸を始めとする各消化器官で粘膜バリアーとして機能している。一方、粘膜バリアーとは、消化管を直接的な刺激から保護する作用であり、例えば消化管内での多量の食物や微生物由来の抗原、消化酵素、酸及びアルカリなどの過酷な環境から保護する作用であって、特に口腔は食物や微生物由来の抗原が最初に接触する消化器官であるので、口腔内での唾液 (口腔内粘液) から分泌されるムチンの粘膜バリアーとしての機能強化が重要となる。【０００３】口腔内のムチンは、顎下腺、耳下腺及び舌下腺などの唾液腺から分泌され、特にシアル酸の多いことからシアロムチンといわれている。シアロムチンは、唾液の主要成分であり、口腔内の乾燥防止や食物の嚥下を容易にする働きの外に、きわめて重要な働きとして感染防御作用がある。この感染防御作用は、ムチンを構成する糖鎖にウイルスや病原菌及び悪性微生物が結合するのを阻止する作用によるものである。特に高齢者では唾液の分泌量が著しく減少するため、口腔内が乾燥したり嚥下咀嚼が困難となり、これに関連して口腔内疾患も増加することが知られているこのように唾液の分泌量を増加させたり、あるいは唾液粘液の機能を強化する薬剤や唾液代替物の開発が強く望まれている。【０００４】従来、唾液の分泌量を増加させる化合物として、酸味や苦味を呈するものが知られているが、これらの物質は味覚に影響を与えるので、実用的ではない。その外に交感神経系又はペプチドホルモンである Substance Pやエンケファリンなどの副交感神経系に作用する神経伝達物質が知られているが、服用により興奮や鬱といった精神面での副作用が問題となっている。さらに、唾液代替物として一般的に水に粘性を付加する物質が用いられており、例えばカルボキシメチルセルロースや高分子量のポリエチレンオキサイドなどが知られている。しかし、これらの物質は化学合成品であるため、食品に幅広く利用することはできない。このような背景から、唾液中のムチンの含量を増加させる、安全に食品に利用できる物質の開発が強く望まれていた。【０００５】一方、シアリルラクトースは、ヒトやウシなどの乳に含まれるシアル酸結合オリゴ糖で、乳糖のガラクトース残基にシアル酸がα2 →3 、あるいはα2 →6 結合した酸性オリゴ糖である。シアリルラクトースの生理作用として、感染防御作用が報告されている。例えば胃炎の原因菌である Helicobacter pylori (Infect.Immun.,vol.56, pp.2896-2906,1988)や新生児の脳膜炎の原因菌であるS-型大腸菌(Acta Paediatr,vol.82,pp.6-11,1993) 及びインフルエンザウイルスＡ型などの付着を阻止することが知られている。さらに、シアリルラクトースによるコレラトキシンの阻止作用に関する報告 (Biosci. Biotech. Biochem., vol.59, pp.417-419,1995) もある。しかし、これらの報告はin vitroの実験結果であり、シアリルラクトースを抗原に添加してその結合状態を観察するといったものである。上述のようにシアリルラクトースは生体に対して有益な物質であると考えられているが、経口摂取した際の生体成分に及ぼす影響についてはほとんど検討されていなかった。【０００６】【発明が解決しようとする課題】上述するように唾液の分泌量を増加させる化合物として公知の、酸味や苦味を呈する物質は味の面で実用的ではなく、副交感神経系に作用する神経伝達物質は、副作用に問題があり、さらに、水に粘性を付加するＣＭＣなどは食品に利用できないので、唾液中のムチンの含量を増加させる、安全に食品に利用できる物質の開発が強く望まれていた。そこで本発明では、唾液粘液の機能を強化する薬剤の提供を課題とする。すなわち、本発明者らは、唾液成分に着目し、唾液中のシアロムチン含量を増加させる、あるいは機能を強化する物質について鋭意研究を進めたところ、乳に含まれるシアリルラクトースを経口摂取することにより、唾液中のシアロムチン含量を増加させることを見出し本発明を完成するに至った。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明に用いるシアリルラクトースは、例えば特開平8-252403号公報 (シアリルラクトースの分離方法) に記載の方法により調製すればよい。この方法では、シアリルラクトースは、チーズを製造する際に排出されるチーズホエーから調製される。チーズホエーを限外濾過膜を装着した装置で濾過し、チーズホエーから蛋白質を除去する。次に、濾液に含まれるシアリルラクトースを、疑似移動床式クロマト分離装置により分画した後、ロータリーエバポレーターで濃縮する。得られた濃縮液をアニオン交換樹脂カラムに通液してシアリルラクトースを吸着させ、十分量の脱イオン水で中性糖を溶出した後、酢酸ナトリウムの濃度勾配法により吸着したシアリルラクトースを溶出する。得られた溶出液を電気透析装置により脱塩し、減圧下で濃縮後、凍結乾燥する。このようにして純度95％のシアリルラクトースの粉末を得ることができる。【０００８】本発明は、正常ラットを用いた実験で明らかにされた結果に基づくものである。すなわち、SD系雄ラットを用い、AIN-93G の標準食にシアリルラクトースを 1重量％配合し、１週間自由摂取させた。1 週間後、唾液を採取し、シアロムチン含量を測定した結果、シアリルラクトース投与群の唾液中のシアロムチン含量は、対照群と比較して有意に増加していた。このことから、唾液中のシアロムチン含量を増加させるためにはシアリルラクトースの投与が有効であることが明らかとなった。【０００９】次に、これらの実験群において、唾液中のシアロムチン含量と感染防御作用との関係を調べた。上述の実験で採取した唾液を用いて、コレラトキシンの結合阻止活性を測定した結果、シアリルラクト−ス投与群のコレラトキシンの結合阻止活性は、対照群と比較して有意に高かった。したがって、シアリルラクトースを投与することにより、唾液中のシアロムチン含量が増加し、その結果、コレラトキシンの結合阻止活性も増強されることが明らかとなった。さらに、実験終了後、シアロムチンを分泌する組織の一つである舌下腺を摘出し、腺組織中のシアロムチン含量を測定した。その結果、シアリルラクト−ス投与群の腺組織中のシアロムチン含量は、対照群と比較して有意に増加していることが明らかとなった。【００１０】本発明の唾液中へのシアロムチンの分泌促進剤の有効成分であるシアリルラクトースは、白色の粉末又は固形状物であり、そのまま製剤化したものでもよいが、糖衣錠やタブレットなどの錠剤、顆粒剤、液剤又はカプセルとしたものでもよい。また、シアリルラクトースを配合して唾液中へのシアロムチンの分泌促進作用を賦与した乳児用調製粉乳や高齢者用機能性食品、及び発酵乳などの栄養組成物や飲食品としてもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の唾液中へのシアロムチンの分泌促進剤の摂取量については、特に制限はないが、成人の場合、2mg/kg体重／日以上、望ましくは 5〜100mg/kg体重／日が適当である。【００１１】以下に本発明の詳細を実施例及び試験例で説明する。【実施例１】チーズを製造する際に排出されるチーズホエー 1,500L を限外濾過膜を装着した装置(Cefilt 10kDa ＮＧフィルテック社製 1.4m×2)で処理して蛋白質を除去した。得られた濾過液中に含まれる乳糖を結晶化法により除去した後、その母液を固形濃度が30％になるまでエバポレーターで濃縮し、疑似移動床式クロマト分離装置で処理した。疑似移動床式クロマト分離装置に用いた充填剤は三菱化学社製のカチオン交換樹脂(UBK510L) をNa型とし、ステンレス製カラム (直径25mm×長さ 460mm× 8本) に充填した。シアリルラクトースの分離は、濃縮液供給量3.4ml/min 、溶離液 (水) 供給量5.8ml/min 、ラフィネート抜き出し量4.2 ml/min、エキストラクト抜き出し量5.0 ml/min、カラム温度10℃にて行った。【００１２】上述の操作条件にてシアリルラクトースを分離した結果、シアリルラクトースはラフィネート側に濃縮された。ラフィネート液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、アニオン交換樹脂 (直径40cm×長さ70cm、Dowex1，酢酸型) に通液してシアリルラクトースを吸着させた。十分量の脱イオン水で中性糖を溶出した後、吸着したシアリルラクトースを 0〜0.06M の酢酸ナトリウムを用いた濃度勾配法により溶出した。得られた溶出画分を電気透析装置 (トクヤマ社製、モデルTS-24 型、膜面積: カチオン膜、アニオン膜ともに960dm2) より脱塩した後、減圧下で濃縮した。濃縮液を凍結乾燥することにより白色粉末のシアリルラクトース480gを得た。このようにして調製したシアリルラクトースは、高速液体クロマトグラフィーによる測定で純度97％以上であることが確認され、このシアリルラクトースをシアロムチンの分泌促進剤として以下の試験に使用した。【００１３】【試験例１】対照群(Control) にはAIN-93G の標準食を、また、シアリルラクトース投与群(SL)には、標準食のショ糖の一部をシアリルラクトースで１％置換した飼料をそれぞれ投与した。７週齢のSD系雄ラット (日本チャールズリバー社製) は、湿度60％、室温24℃、light-darkコントロール12時間の条件下で飼育した。全てのラットは標準食で１週間予備飼育した後、１群12匹からなる２群に分け、それぞれの実験食を自由に摂取させて、１週間飼育した。ラットの唾液は、実験食投与後７日目に採取し、唾液中のシアロムチン含量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。各実験群の唾液中のシアロムチン含量の測定結果を図１に示す。シアリルラクトース投与群の唾液中のシアロムチン含量は、対照群と比較して有意に増加していることが認められた。また、実験終了後、舌下腺を摘出し、舌下腺中のシアロムチン含量を測定した。その結果を図２に示す。シアリルラクトース投与群の舌下腺中のシアロムチン含量は、対照群と比較して有意に増加していた。【００１４】【試験例２】各実験群の唾液を用いて、コレラトキシンの結合阻止活性を調べた。0.1 ％ガングリオシドGM1 含有エタノール溶液(W/V) 200 μl を96穴ELISA 試験用プレートに添加した後、風乾してガングリオシド GM1を吸着させた。唾液は、１％牛血清アルブミン(BSA) 含有PBS で10倍に希釈した後、ビオチン結合コレラトキシンを添加して１時間反応させた。反応液100 μl を上述のELISA 試験用プレートに添加して30分間放置後、上清を除去した。ELISA 試験用プレートを0.05％Tween20 を含むPBS で数回洗浄し、ビオチン結合性のβガラクトシダーゼを添加して一定時間放置後、上清を除去した。また、ELISA 試験用プレートを0.05％Tween 20を含むPBS で数回洗浄し、4-メチルウンベリフェリルガラクトースを添加して30分間反応させた後、生成した4-メチルウンベリフェリロンを蛍光光度計 (励起波長 360nm、測定波長 460nm) で測定した。そして、次式より阻止率を算出した。阻止率（％）＝｛１−（A/B)｝×100Ａ：シアリルラクトース投与群の蛍光強度Ｂ：対照群の蛍光強度その結果を図３に示す。シアリルラクトース投与群の唾液によるコレラトキシンの結合阻止活性は、対照群と比較して有意に高いことが認められた。したがって、シアリルラクトースを経口摂取することにより唾液中のシアロムチン含量が増加し、その結果として毒素中和能も増強されることがわかった。【００１５】なお、唾液中のシアロムチン含量の測定法は次の通りである。(1) 唾液の採取２時間以上絶食させたラットに0.2 mlのネンブタール液を筋肉注射し、麻酔後、唾液分泌促進剤である塩酸ピロカルビン溶液を筋肉注射した。３分後からラット舌下に分泌された唾液をオートピペットによりマイクロチューブに採取し、この操作を正確に９分間行った。唾液採取終了後、唾液分泌抑制剤である 0.1％硫酸アトロピンを 0.1ml注射し唾液採取を終了させた。(2) シアロムチン画分の回収採取した唾液を速やかに０℃以下に冷蔵した後、４℃に冷却した遠心分離機で処理(11,000rpm、60分間) して上清を得た。上清を分子量分画100,000 のマイクロ透析チューブにより生理的食塩水で３日間透析し、内容液を唾液中のシアロムチン画分として回収した。３シアロムチン含量の定量シアロムチン画分に含まれるシアロムチン含量は、シアル酸蛍光標識キット(Takara 社製) で定量した。シアロムチン画分の一定量を試験管に採取し、ロータリーエバポレーターで減圧乾固した後、2N- 酢酸を加えて、80℃、３時間加水分解した。遊離したN-アセチルシアル酸やO-アセチル化シアル酸については、蛍光ラベル化剤である DMB試薬を加え、55℃で 2.5時間反応させた後、高速液体クロマトグラフィーで定量した。【００１６】【実施例２】実施例１に記載した方法により調製したシアリルラクトース 0.6g を日本薬局方の内服用ゼラチンカプセル００号に充填し、唾液中へのシアロムチンの分泌促進作用を賦与したカプセルを製造した。【００１７】【実施例３】脱脂粉乳 3kgに温水20kgを加えて撹拌し、 120℃で５秒間加熱殺菌した後、42℃まで冷却した。この還元脱脂乳にラクトバチルス・ブルガリクス ( Lactbacillus bulgaricus ) とストレプトコッカス・サーモフィルス ( Streptcoccusthrermophilus ) の混合乳酸菌スターターを接種し、42℃で３時間発酵させて培養物を得た。一方、水７kgに異性化糖４kg、ペクチン125 ｇ及び実施例１に記載した方法により調製したシアリルラクトースをナトリウム塩としたシアリルラクトースナトリウム214 g を加えて撹拌溶解し、90℃で10分間加熱殺菌した後、10℃まで冷却して糖質溶液を調製した。そして、撹拌しながらこの糖質溶液に培養物を加えて均一に混合し、ホモゲナイザーで均質化処理した後、紙容器に充填して、唾液中へのシアロムチンの分泌促進作用を賦与したドリンクヨーグルトを製造した。【００１８】【発明の効果】上述するように本発明のシアリルラクトース又はその塩類を有効成分とする唾液中へのシアロムチンの分泌促進剤は、従来の唾液の分泌量を増加させる物質として知られる酸や苦味を呈する物質、あるいは交感神経系又はペプチドホルモンである Substance Pやエンケファリンなどの副交感神経系に作用する神経伝達物質、さらには唾液代替物として用いるＣＭＣや高分子量ポリエチレンオキサイドに比して安全で、実用性が高く、食品等に幅広く使用が可能であり、口腔内でシアロムチンの分泌を促進させて、色々の疾患を防止することができるという顕著な効果を奏する。【図面の簡単な説明】【図１】 ラット（実験食投与後７日目）の唾液中のシアロムチン含量【図２】 ラットの舌下腺中のシアロムチン含量【図３】 コレラトキシンの結合阻止活性 シアリルラクトース又はその塩類を有効成分とすることを特徴とする唾液中へのシアロムチンの分泌促進剤（ただし飲食品形態を除く）。