生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_アンモニアの測定方法 |
| 出願番号： | 1999109122 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12Q1/32,G01N33/50 |
特許情報キャッシュ
佐藤 善郎 小島 良 加来 俊高 JP 3674388 特許公報(B2) 20050513 1999109122 19990416 アンモニアの測定方法 日東紡績株式会社 000003975 浅村 皓 100066692 浅村 肇 100072040 長沼 暉夫 100088926 池田 幸弘 100102897 佐藤 善郎 小島 良 加来 俊高 20050720 7 C12Q1/32 G01N33/50 JP C12Q1/32 G01N33/50 B 7 C12Q 1/00-70 G01N 21/00ー33/98 C12N1/00-9/99 PubMed、MEDLINE(STN) BIOSIS/WPI(DIALOG) 特開平０２−１１３８９８（ＪＰ，Ａ） Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，１９９０年，Vol.9, no.3，p.151-162 5 2000300292 20001031 10 20020522 斎藤 真由美 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、アンモニアの測定方法およびアンモニア測定用キットに関する。更に詳細には、全血検体を、先ず除タンパク試液で処理して除タンパク検体を得、次いで除タンパク検体中のアンモニアに、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素を作用させて酵素反応させＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費量を測定してアンモニアを測定する、全血検体中のアンモニアの測定方法および該測定方法に用いるキットに関する。【０００２】【従来の技術】血中のアンモニアは、主として体内の蛋白代謝過程でアミノ酸から脱アミノ化されて生成され、生成されたアンモニアは肝臓内で尿素に合成されて腎臓から排泄される。従って、高度の肝臓障害では血中のアンモニアが増加するため、血中アンモニアの測定は、肝性昏睡、肝性脳症、劇症肝炎、先天性尿素サイクル酵素欠損症等の診断、治療において重要視されている。【０００３】血液中のアンモニアの測定法には、主として酵素法とインドフェノール法がある。酵素法の代表的なものとしては、血漿検体を用いる酵素法が知られている（特開昭５０−２３６９９号公報）。この方法は、先ず全血検体を血漿（プラズマ）にし、その血漿中のアンモニアに、グルタミン酸脱水素酵素、ＮＡＤＰＨ及びα−ケトグルタレートを反応させて、ＮＡＤＰＨの減少に由来する吸光度の変化量を測定することにより、アンモニアを測定するものである。この酵素法は、アンモニアに対する特異性が高く、検体中のアンモニアを正確に測定でき、かつ、簡便に短時間でアンモニアを測定できるため、自動分析装置に適用できる長所を有する。そのため、酵素法は、病院等で一般的に用いられている。しかし、この方法では、検体として血漿を使用するため、長期間、検体を保存すると、継時的に、アンモニア測定値の上昇がおこる。その結果、血漿を作成した病院から遠く離れた臨床検査センター等でこの方法を適用すると、検体が届くまで時間がかかるため、アンモニア測定値が、不正確となりやすい。これを改良するため、測定試料として除タンパク検体を用いても、検体中のアンモニア濃度が本来低いため、また、ＮＡＤＰＨを測定するための波長（通常、３４０ｎｍ付近）では、除タンパクによるわずかな濁りも測定値に影響するため、正確にアンモニアを測定することができない。 その結果、臨床検査センターでは、この酵素法は、用いることができないのが実状である。【０００４】インドフェノール法は、全血検体を除タンパクし、除タンパク検体中のアンモニアと、フェノール等とを化学反応させることによりインドフェノールを生成させ、それに由来する吸光度を測定することにより、アンモニアを測定する方法である。この方法は、全血検体を直接、除タンパクするため、検体を長期に保存しても、正確にアンモニアを測定できる長所がある。そのため、この方法は、臨床検査センターで広く使用されている。しかし、この方法は、化学反応に用いるための試薬の種類が多く、また、化学反応の時間が長いため、汎用の自動分析装置に適用できない。そのため、検体に試薬を入れる際、ピペット操作を手で行うため、多数の検体中のアンモニアを短時間で測定できないという問題がある。【０００５】【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、長期間、検体を保存しても、多数の検体中のアンモニア濃度を短時間で正確に測定することができるアンモニアの測定方法およびアンモニア測定用キットを提供することである。【０００６】【課題を解決するための手段】本発明は、全血検体中のアンモニアの測定方法であって、a)アンモニアを含む全血検体を、タングステン酸塩とそのタングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍の無機酸とを含む除タンパク試液で処理し、b)得られる処理液を遠心分離し、次いでc)得られる上清の除タンパク検体中のアンモニアに、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素を作用させて酵素反応させＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費量を測定してアンモニアを測定する、ことを特徴とする全血検体中のアンモニアの測定方法である。更に本発明は、全血検体中のアンモニア測定用キットであって、ｉ）タングステン酸塩と、タングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍の無機酸とを含む除タンパク試液、及びｉｉ）α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素とを含む酵素試液とを必須構成成分とするアンモニア測定用キットである。【０００７】【発明の実施の形態】本発明で対象とする全血検体とは、血漿成分と血球成分とを分離していない血液検体を指し、除タンパクされていない血液検体であればよく、特に限定されない。通常、全血、すなわち、注射器で生体から取り出したばかりの血液であってかつ何も添加しない血液が用いられるが、全血に生理食塩水またはアンモニアを含む液を添加した検体でも構わない。また、全血検体として、全血にヘパリンまたはＥＤＴＡ等の抗凝固剤を添加させた検体でも構わない。【０００８】本発明で用いる除タンパク試液は、タングステン酸塩と、そのタングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍の無機酸とを含む液である。無機酸の量は、タングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍であることが必要であり、さらに、１．００〜１．３０倍が好ましい。無機酸の量がタングステン酸塩に対し当量比で０．９５倍未満であると、除タンパクを効果的にできにくく、また、遠心分離操作をしても、除タンパク検体を透明にしにくいため、正確にアンモニアを測定できない。一方、無機酸の量がタングステン酸塩に対し当量比で１．３５倍を越えると、遠心分離操作をしても、除タンパク液を透明にしにくいか、除タンパク液を透明にできても、酵素反応以外の非特異的な反応が起こるため、正確にアンモニアを測定できない。【０００９】除タンパク試液に用いるタングステン酸塩の濃度は、全血検体を除タンパク試液で処理させた処理液中でタングステン酸濃度が６０〜１１５ｍＭになるようにタングステン酸塩の濃度を調整させておくことが好ましい。 ６０ｍＭを越えないと除タンパクしづらく、１１５ｍＭを越えると、アンモニア測定の酵素反応の際、初期吸光度が高くなりやすくアンモニアを正確に測定できにくい。除タンパク試液に用いられるタングステン酸塩としては、水溶性のタングステン酸塩であれば限定されないが、通常、タングステン酸ナトリウム（Ｎａ2ＷＯ4）、タングステン酸カリウム（Ｋ2ＷＯ4）等が用いられる。 除タンパク試液に用いる無機酸としては、通常除タンパクする際に無機酸として用いられるものであれば特に限定されないが、通常、硫酸単独、硫酸とリン酸との混合物等が用いられる。 調製した除タンパク試液を安定にするため、無機酸中にリン酸を１〜１０当量％含むことが好ましく、１〜１０当量％のリン酸を含む硫酸水溶液を用いることが特に好ましい。【００１０】本発明では、アンモニアを含む全血検体を除タンパク試液で処理する。この際の除タンパク試液の使用量が、全血検体に対して体積比で１−３倍量であることが好ましく、１．５−２．６倍量であることが更に好ましい。用いる除タンパク試液の量が、全血検体の量を越えないと、除タンパクのため遠心分離操作をしても濁りやすく、除タンパク検体を調製しにくい。また、除タンパク試液の量が全血検体の３倍を越えると、もともと全血中のアンモニア濃度が薄いのに加えて稀釈率が大きくなるため、測定試料中のアンモニア濃度が低くなり、アンモニア濃度を正確に測定できにくい。本発明では、処理液を得るには、通常の除タンパクの操作が用いられるが、例えば、除タンパク試液に全血検体を振りまぜながら加えて行うことができる。得られる処理液を遠心分離する際は、通常、１０００〜５０００ｒ．ｐ．ｍ、好ましくは２０００〜４０００ｒ．ｐ．ｍで３〜１０分間、遠心分離することができる。【００１１】本発明では、処理液を遠心分離して得られる上清を除タンパク検体とし、それを測定試料として酵素反応させて、検体中のアンモニアを測定する。この測定では、血漿の代わりに除タンパク検体を測定試料として用いた以外は、通常のアンモニア測定のための酵素法と同様に操作してアンモニアを求めることができる。すなわち、除タンパク検体中のアンモニアに、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素を作用させて酵素反応させＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ消費に由来する酵素反応前後での反応液の吸光度変化を測定して検体中のアンモニアを測定することができる。吸光度は、通常、波長３２０〜３６０ｎｍ、好ましくは３３０〜３５０ｎｍの吸光度を用いる。【００１２】以上の説明から明らかな通り、本発明の全血検体中のアンモニア測定用キットは、ｉ）タングステン酸塩と、タングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍の無機酸とを含む除タンパク試液、及びｉｉ）α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素とを含む酵素試液とを必須構成成分とする。構成成分の一つである除タンパク試液は前記した通りであり、特に無機酸中にリン酸を１〜１０当量％含むものが好ましい。他の構成成分の一つである酵素試液は、通常の方法で調製されたものを用いることができ、例えば、α−ケトグルタル酸と、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとを適当な緩衝液中に含む第一試薬、並びにグルタミン酸脱水素酵素を適当な緩衝液中に含む第二試薬とからなる酵素試液が挙げられる。【００１３】【発明の効果】本発明によれば、検体を長期間保存しても、検体中のアンモニア濃度を短時間で正確に測定することができる。また、臨床検査センターにおいても、自動分析装置を適用して検体中のアンモニア濃度を正確に測定できる。従って、臨床検査分野に寄与すること大である。【００１４】【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。【００１５】一般的操作法１：除タンパク試液の調製０．３０モル／リットル（０．６０当量／リットル）のタングステン酸（ＩＶ）ナトリウム水溶液と、０．３３モル／リットル（０．６６当量／リットル）の硫酸水溶液（ただし、その水溶液中に０．０６当量／リットルリン酸を含む）とを、体積量で同量づつ加えて除タンパク試液を調製した。なお、当量の計算は、タングステン酸ナトリウム・２水和物（分子量３２９．８６）では１当量を１６４．９ｇ、硫酸（分子量９８．０８）では１当量を４９．０ｇ、リン酸（分子量９８．００）では１当量を３２．７ｇとして計算した。【００１６】一般的操作法２：遠心分離による測定試料の作成除タンパク試液に全血検体を振りまぜながら加え、得られる処理液を３０００ｒ．ｐ．ｍで５分間、遠心分離した。上清を除タンパク検体とし、それを測定試料とした。なお、用いた除タンパク試液の量は、全血検体の２倍（体積比）とした。【００１７】一般的操作法３：酵素法によるアンモニアの一般的測定法第一試薬として、トリス（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、α−ケトグルタル酸（１０ｍＭ）、アジ化ナトリウム（０．１％）及びＮＡＤＰＨ（０．１２５ｍＭ）を含むｐＨ９．０の溶液を用いた。第二試薬として、トリス（１００ｍＭ）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（２００ｍＭ）、アジ化ナトリウム（０．１％）及びグルタミン酸脱水素酵素（１５０ＫＵ／ｌ）を含むｐＨ８．５の溶液を用いた。自動分析装置として日立７１７０型自動分析装置を用い、主なパラメーターを以下の通りに設定した。【００１８】この方法では、以下のように測定された。３０μｌの測定試料と１５０μｌの第一試薬とを混合して３７℃で５分間インキュベーション後、この溶液の３４０ｎｍでの吸光度を測定した（吸光度１）。次いで、その溶液に、３０μｌの第二試薬を加え３７℃で５分間、酵素反応を行ったのち、再度、溶液の３４０ｎｍでの吸光度を測定した（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２の値に液量補正等をして、酵素反応前後での吸光度変化量を求めた。一方、あらかじめアンモニア濃度既知の標準液を同様に操作することにより検量線を求めておき、それとの比較から測定試料中のアンモニア濃度を求めた。【００１９】実施例１本発明法と従来法とによるアンモニア測定の比較５０個の全血を、一般的操作法１により調製した除タンパク試液を用いて除タンパクし、さらに、一般的操作法２により遠心分離することにより除タンパク検体を作成し、それを測定試料とした。その測定試料を一般的操作法３の測定法で操作することにより、全血検体中のアンモニア濃度を測定した（本発明の方法）。また、同一の５０個の全血にＥＤＴＡ・２Ｎａを添加して血漿を調製し、それを測定試料として用い直ちに一般的操作法３の方法で血漿中のアンモニア濃度を測定した（従来の酵素法）。本発明の方法と従来の酵素法との相関性の結果を図１に示す。従来の酵素法の測定値をＸとし、本発明の方法の測定値をＹとすると、Ｙ＝０．９５５Ｘ＋２．２７（相関係数０．９４）で表された。このことより、本発明では、測定試料として除タンパク検体を用いたにもかかわらず、除タンパクしない血漿検体を用いて直ちに測定したものと同程度に正確に全血検体中のアンモニア濃度を測定できることがわかった。【００２０】実施例２本発明で長期に保存した除タンパク検体を用いてアンモニアを測定した例全血を、一般的操作法１および一般的操作法２により除タンパク・遠心分離することにより除タンパク検体を作成した。その除タンパク検体を０〜４日間、４℃で保存した後、一般的操作法３に従い検体中のアンモニア濃度（単位μｇ／ｄｌ）を測定した。また、比較として、同一全血から得たＥＤＴＡ・２Ｎａ添加血漿を、同様に保存してそのアンモニア濃度を測定した。それらの測定結果を表１に示す。【００２１】【表１】【００２２】表１の結果から明らかな通り、本発明の方法では、除タンパク検体を数日、保存しておいても、ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加血漿検体と異なり、正確にアンモニア濃度を測定することができた。【００２３】実施例３〜１１アンモニア添加回収試験１）除タンパク試液の調製所定濃度のタングステン酸（ＩＶ）ナトリウム水溶液と、所定濃度の硫酸水溶液（実施例１２に使用したもの以外はすべて０．０６当量／リットルのリン酸を含む）とを、同量づつ加えて除タンパク試液を調製した。タングステン酸（ＩＶ）ナトリウムの濃度は、除タンパク試液を検体に処理させた処理液中でのタングステン酸濃度が、表２に記載した濃度になるよう調製した。硫酸の濃度は、タングステン酸ナトリウムを中和するための計算当量に対して実際に用いた当量の比［（酸使用当量）／（酸計算当量）］が表２に記載した比になるように調製した。なお、当量の計算は、一般的操作法１に記載したものと同様にした。【００２４】２）除タンパク試液の安定性リン酸を含まない除タンパク試液（実施例１２に使用した除タンパク試液）は、１日、室温に放置すると沈殿が発生し使用できなくなったので、すぐに調製したものを用いた。なお、本実施例で用いた他の除タンパク試液（リン酸を含む）は、１日、室温に放置しても沈殿が発生しなかった。【００２５】３）添加回収試験のための測定試料の作成全血９に対し、１０００μｇ／ｄｌ塩化アンモニウム水溶液１の割合で添加し、全血検体とした。また、塩化アンモニウム水溶液の代わりに、生理食塩水を用いてブランク検体を調製した。除タンパク試液に、全血検体またはブランク検体を振りまぜながら加え、その混合物を３０００ｒ．ｐ．ｍで５分間、遠心分離した。得られる上清すなわち除タンパク検体を、測定試料とした。なお、用いた除タンパク試液と全血検体との比は、表２に示した通りである。【００２６】４）添加回収試験添加回収試験は常法（例えば、「臨床検査教育双書１２頁，１９９１年，近代出版」に記載されている）に従い行った。すなわち、得られた測定試料を一般的操作法３に記載したアンモニアの測定法により、全血検体とブランク検体とのアンモニア濃度を測定し、（これら２つの測定値差×１００）／（添加濃度からの計算値）をアンモニア回収率として求めた。また、３４０ｎｍでの吸光度の時間変化（１〜３４ポイントのタイムコース）をアンモニア測定値の妥当性判断基準の一つとして調べた。結果を表２に示す。なお、タイムコースが不安定なものは、１〜１６ポイントで吸光度が上昇したり減少したりして一定でないので、アンモニアを正確に測定できにくいことを示している。使用する酸の当量が大きすぎると除タンパクはできにくく、タイムコースが極めて不安定でアンモニアを正確に測定できにくいことが判明した。【００２７】【表２】【表３】注）*藤井ら，最新医学，１９６６年，６２２〜６２７頁に記載の組成を参考にして除タンパク試液を調製した。**比較例１、比較例２および比較例４では、除タンパクのため遠心分離してもにごったままであり適当な測定試料をつくれなかった。***除タンパク試液として和光純薬（株）製のアンモニア測定用キット中にある除タンパク試液を用いた。【００２８】表２に示された結果から明らかなように、使用する酸の当量が大きすぎると除タンパクはできにくく、タイムコースが極めて不安定でアンモニアを正確に測定できにくいことが判明した。本発明の方法では、添加したアンモニアの濃度を正確に測定できるので、全血検体中のアンモニア濃度を正確に測定できることが判明した。【図面の簡単な説明】【図１】図１は、本発明の方法と従来の酵素法との相関性の結果を示す。 全血検体中のアンモニアの測定方法であって、a)アンモニアを含む全血検体を、タングステン酸塩とそのタングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍の無機酸とを含む除タンパク試液で処理し、b)得られる処理液を遠心分離し、次いでc)得られる上清の除タンパク検体中のアンモニアに、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素を作用させて酵素反応させＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの消費量を測定してアンモニアを測定する、ことを特徴とする全血検体中のアンモニアの測定方法。 全血検体を除タンパク試液で処理した処理液中でのタングステン酸濃度が６０〜１１５ｍＭになるように、タングステン酸塩の濃度を調整しておく、請求項１のアンモニアの測定方法。 アンモニアを含む全血検体を除タンパク試液で処理する際の除タンパク試液の使用量が、全血検体に対して体積比で１−３倍量である、請求項１または２のアンモニアの測定方法。 全血検体中のアンモニア測定用キットであって、ｉ）タングステン酸塩と、タングステン酸塩に対し当量比で０．９５〜１．３５倍の無機酸とを含む除タンパク試液、及びｉｉ）α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、およびグルタミン酸脱水素酵素とを含む酵素試液とを必須構成成分とするアンモニア測定用キット。 無機酸中にリン酸を１〜１０当量％含む請求項４のアンモニア測定用キット。