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| タイトル： | 特許公報(B2)_破骨細胞由来酸性ホスファターゼの測定方法 |
| 出願番号： | 1997149615 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12Q1/42,G01N33/573 |
特許情報キャッシュ
中西 守 内田 景博 三浦 俊英 片山 勝博 JP 3713901 特許公報(B2) 20050902 1997149615 19970606 破骨細胞由来酸性ホスファターゼの測定方法 日東紡績株式会社 000003975 浅村 皓 100066692 浅村 肇 100072040 長沼 暉夫 100088926 小堀 貞文 100090701 中西 守 内田 景博 三浦 俊英 片山 勝博 20051109 7 C12Q1/42 G01N33/573 JP C12Q1/42 G01N33/573 7 C12Q 1/00-70 G01N 21/00ー33/98 C12N 1/00-13/00 PubMed、MEDLINE(STN) BIOSIS/WPI(DIALOG) 特開平０５−０１５３９２（ＪＰ，Ａ） 日大医誌，１９９０年，Vol.49，p.904-911 臨床検査，１９９３年，Vol.37，p.373-377 7 1998337198 19981222 12 20020227 斎藤 真由美 【０００１】【発明が属する技術分野】本発明は、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定方法およびそれに使用するキットに関する。本発明によれば簡便で特異的に破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定が可能であり、臨床検査測定用の方法として医学的治療や臨床検査の分野において極めて有効である。【０００２】【従来の技術】酸性ホスファターゼは、至適ｐＨが酸性で有機モノリン酸エステルを加水分解する酵素であり、前立腺由来酸性ホスファターゼ、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼおよび血小板由来酸性ホスファターゼなどの種々の由来のものがある。酒石酸の添加によってもその酵素活性が阻害されない血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼは、その大部分が破骨細胞由来酸性ホスファターゼとされ、その測定は、破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカーとして興味が持たれている（骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビュー社，１９９５）。【０００３】一般的に酵素活性測定法による検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの測定は、酒石酸の存在下で合成基質としてリン酸エステルを用いて酵素反応により生ずる反応生成物（アルコールやフェノール類）を比色定量することにより酵素活性を求めている。その際、酒石酸は検体中に主として共存する前立腺由来酸性ホスファターゼの酵素活性を阻害し、従って残存した酸性ホスファターゼ活性を基質を用いて測定することにより、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の指標として酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を求めている。さらに、より特異的な破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定法の改善法としては、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートする前処理をした後、残りの酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を、酒石酸存在下、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用いて測定する方法が知られている（日大医誌，４９巻，９０４−９１１頁（１９９０）；クリニカル・ケミストリー，３３巻，４５８−４６２頁（１９８７））。一方、免疫学的測定法による酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの測定方法として、モノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）による測定方法が知られている（臨床検査，３７巻，３７３−３７７頁（１９９３））。【０００４】【発明が解決しようとする課題】破骨細胞由来酸性ホスファターゼの指標として酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を求める従来の活性測定法は、特異性、感度、測定の煩雑さ及び測定時間の点で問題を有している。検体中には、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼとして、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ以外に赤血球由来酸性ホスファターゼや血小板由来酸性ホスファターゼが存在する。すなわち、検体の採取により溶血が生じたとき、赤血球由来酸性ホスファターゼは検体中に含まれてくるし、検体として血清を用いる場合、血清製造の際の血液凝固の過程で血小板が破壊されて血小板由来酸性ホスファターゼが検体中に含まれてくる。そのため、従来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性測定法は、特異的に破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定しているとは言えない。【０００５】さらに、前記した日大医誌，４９巻，９０４−９１１頁（１９９０）記載の改善法でも、血小板由来酸性ホスファターゼによる影響を除くことはできない。また、この改善法では、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用いているが、その反応生成物であるｐ−ニトロフェノールは、酸性ホスファターゼの反応の至適ｐＨである酸性域では発色しないため、アルカリを加え反応を停止し発色させる必要がある。そのため、この改善法では、レートアッセイが不可能なため、現代の臨床検査の主流である自動分析装置での測定に適応できない。また、この改善法では、感度が十分でないため、酵素反応の反応時間も３０分と長時間必要である。一方、免疫学的測定法による酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの測定法は、モノクローナル抗体を使用するためさらに特異性には優れている。しかしながら、操作が煩雑であり、抗原抗体反応は酵素反応に比べさらに長時間を必要とするため、測定に時間を必要とする。測定するための試薬も高価でありコスト面でも問題を有する。本発明は、かかる問題に鑑み、簡便で特異的な破骨細胞由来酸性ホスファターゼの測定方法及びそれに使用するキットを提供することを目的とする。【０００６】【課題を解決するための手段】本発明は、ｉ）検体中の酸性ホスファターゼに、酒石酸の存在下で酸性ホスファターゼ用基質を作用させて酸性ホスファターゼ活性を測定し（以下、測定１と記載することもある）、それとは別にii）検体中の酸性ホスファターゼに、赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤と酒石酸との存在下で酸性ホスファターゼ用基質を作用させて酸性ホスファターゼ活性を測定し（以下、測定２と記載することもある）、次いで、iii)上記ｉ）の活性から上記ii）の活性を差し引くことにより測定することを特徴とする破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定方法である。更に本発明は、ｉ）酒石酸を含む試薬、ii）赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤と酒石酸とを含む試薬、及びiii)酸性ホスファターゼ用基質を含む試薬を必須構成試薬とする破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定用キットである。【０００７】【発明の実施の形態】本発明で対象とする検体は、ヒトの血液、血清、血漿などが代表的なものである。本発明の測定方法における測定１の酒石酸存在下では、検体中の前立腺由来酸性ホスファターゼ活性は阻害されるが、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼおよび血小板由来酸性ホスファターゼは阻害されず、従ってその阻害されない３種類の酸性ホスファターゼ活性の和が主な測定１での測定値となると考えられる。測定２では、酒石酸に加え、赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤も存在するので、前立腺由来酸性ホスファターゼに加え、破骨細胞由来酸性ホスファターゼも阻害されるが、赤血球由来酸性ホスファターゼおよび血小板由来酸性ホスファターゼは阻害されず、従ってその阻害されない２種類の酸性ホスファターゼ活性の和が主な測定２での測定値となると考えられる。したがって、測定１での測定値から測定２での測定値を差し引くことにより、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を正確に求めることができると考えられる。【０００８】本発明で用いられる赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤（以下、単に阻害剤と記載することもある）としては、赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害せずかつ破骨細胞由来酸性ホスファターゼを阻害するものであれば特に限定されない。そのような阻害剤として、例えばフッ化ナトリウム、フッ化カリウム等のフッ化塩を例示できる。本発明では、酸性ホスファターゼに合成基質を作用させるとき、その阻害剤の濃度は、好ましくは５〜５００ｍＭ、さらに好ましくは２０から２００ｍＭである。本発明で用いられる酒石酸としては、Ｌ（＋）−酒石酸、またはそのナトリウム塩またはカリウム塩等の塩が好ましい。本発明では、酒石酸の存在下で酸性ホスファターゼに基質を作用させるとき、その酒石酸の濃度は、好ましくは５〜５００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜２００ｍＭである。【０００９】本発明に用いられる酸性ホスファターゼ用基質は、酸性ホスファターゼ、特に、破骨細胞由来酸性ホスファターゼと反応し、酸性ホスファターゼ活性を測定できるものであればいずれでもかまわないが、レートアッセイ可能な基質が好ましい。レートアッセイ可能な基質として、α−ナフチルリン酸およびその塩、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸およびその塩、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸およびその塩、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸およびその塩を例示できる。そのなかでも、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸およびその塩が、感度が高く測定波長３４０ｎｍで測定できる点から好ましい。反応時の基質濃度は、各基質の酸性ホスファターゼに対する親和性により異なるが、酸性ホスファターゼに対するＫｍの５〜１０倍が好ましい。本発明において、検体中の酸性ホスファターゼに基質を作用させて酸性ホスファターゼ活性を測定するときは、生成するアルコールやフェノールの生成量を分光光度計や自動分析装置を用い、適当な波長の吸光度変化を測定することにより目的の活性を測定できる。この場合、レートアッセイで酸性ホスファターゼ活性を測定するときは、以下の式を利用して求めることができる。【００１０】【式１】活性＝［（酵素反応中の単位時間当たりの吸光度変化量−ブランクのときの吸光度変化量）×酵素反応時の液量］÷［検体量×生成物の吸光分子係数×セル光路長］（ただし、「ブランクのときの吸光度変化量」とは、検体の代わりに生理食塩水または精製水を用いて「酵素反応中の単位時間当たりの吸光度変化量」と同様な操作をして求めた値を示す）【００１１】自動分析装置を用いたレートアッセイでは、約１０分間で測定が終了可能である。本発明では、酵素反応時の反応液量は、用いた検体量の５倍以上が好ましく、８〜１００倍がさらに好ましく、１０〜５０倍が特に好ましい。酵素反応時の反応液量が検体量の５倍を越えないと、検体中の妨害物質の影響のため破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を正確に測定できにくく、その反応液量が多すぎると測定感度が低くなるため破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定できない場合がある。また、酵素反応の際には、必要に応じて、トリトンＸ−１００等の界面活性剤、アルコール類、塩化ナトリウムなどの塩類、アルブミン等の蛋白質を含んでも構わない。また、酵素反応の際には、ｐＨ４〜７の酸性域が好ましく、ｐＨ５．４〜６．８がさらに好ましい。そのための緩衝物質として、クエン酸及びその塩、酢酸及びその塩、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓなどを用いてもよい。【００１２】本発明の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定方法では、例えば、ｉ）酒石酸を含む試薬（酒石酸試薬）、ii) 赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤と酒石酸とを含む試薬（阻害剤・酒石酸試薬）、及びiii)酸性ホスファターゼ用基質を含む試薬（基質試薬）を必須構成試薬とする破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定用キットを用いることができる。このキットは２試薬系の自動分析装置に適用できる。これらの試薬には、必要に応じて、トリトンＸ−１００等の界面活性剤、アルコール類、塩化ナトリウムなどの塩類、アルブミン等の蛋白質を含んでいても構わない。また、緩衝物質としてクエン酸及びその塩、酢酸及びその塩、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓなどを含んでいてもよい。【００１３】このキットでは、まず、検体と酒石酸試薬とを混合することにより前立腺由来酸性ホスファターゼを阻害し、次いで、その混合液に基質試薬を添加して残存の酸性ホスファターゼ活性を測定する（測定１）。それとは別に、検体と阻害剤・酒石酸試薬とを混合することにより、前立腺由来酸性ホスファターゼと破骨細胞由来酸性ホスファターゼとを阻害し、次いで、その混合液に基質試薬を添加して残存の酸性ホスファターゼ活性を測定する（測定２）。得られた測定１での測定値から測定２で測定値を差し引くことにより、検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定することができる。測定２で用いる阻害剤・酒石酸試薬の液量は、測定１に用いる酒石酸試薬と同量用いることが、計算上、好ましい。また、測定の際に用いる酒石酸試薬と基質試薬との和は、それらの試薬と検体と併せた時、検体量の好ましくは５倍以上、さらに好ましくは８〜１００倍、特に好ましくは１０〜５０倍である。上記のキットを用いると、本発明の方法を、自動分析装置にも適用でき、簡便に短時間で数多くの検体の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定できる。【００１４】上記のキットの他にも、例えば、ｉ）酒石酸と酸性ホスファターゼ用基質とを含む試薬、及びii) 赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤と酒石酸と酸性ホスファターゼ用基質とを含む試薬を必須構成試薬とする破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定用キットを用いても本発明の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定方法を実施できる。検体と上記試薬ｉ）とを混合して、測定１の方法で、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼおよび血小板由来酸性ホスファターゼからなる総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を求めることができる。また、検体と上記試薬ii）とを混合して測定２の方法で赤血球由来酸性ホスファターゼおよび血小板由来酸性ホスファターゼからなる酸性ホスファターゼ活性を求めることができる。得られた測定１のデータから測定２のデータを差し引くことにより、検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定することができる。【００１５】【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の要旨を越えない限り、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。実施例１破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定法１）試薬組成（１）総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ測定用緩衝液（酒石酸試薬）１５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ６．２（２５℃）６０ｍＭ Ｌ（＋）−酒石酸ナトリウム０．５％ 牛アルブミン０．１％ トリトン Ｘ−１００（２）酒石酸抵抗性フッ化ナトリウム抵抗性酸性ホスファターゼ測定用緩衝液（阻害剤・酒石酸試薬）１５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ６．２（２５℃）６０ｍＭ Ｌ（＋）−酒石酸ナトリウム５０ｍＭ フッ化ナトリウム０．５％ 牛アルブミン０．１％ トリトン Ｘ−１００（３）基質液（基質試薬）４５ｍＭ ＤＣＡＰ−Ｐ（２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸）５０ｍＭ トリス【００１６】（４）試料の調整ａ．牛骨粗精製液（破骨細胞由来酸性ホスファターゼ含有液）牛脛骨頭部を約２ｃｍ角に砕き、液体窒素存在下ブレンダーにて粗い粉末とする。これに１．５倍量の蛋白分解酵素阻害剤を含む３Ｍ ＫＣｌ、１％トリトンＸ−１００溶液を混和し、ポリトロンホモジナイザーにて懸濁液とし、２０００ｒｐｍ、２０分遠心し、上清を採取し、フレオン処理により脂肪分を除き、０．４５μｍのフィルターを通し、主として破骨細胞由来酸性ホスファターゼを含む、牛骨粗精製液として使用した。ｂ．赤血球溶液（赤血球由来酸性ホスファターゼ溶液）ヘパリン血を１０００ｒｐｍ、１０分遠心後の沈殿赤血球を生理食塩水にて洗浄後 ０．１％トリトンＸ−１００を含む生理食塩水にて溶解したものを、主として赤血球由来酸性ホスファターゼを含む赤血球溶液として使用した。ｃ．血小板溶液（血小板由来酸性ホスファターゼ溶液）ヘパリン血を１０００ｒｐｍ、１０分遠心後の上清をさらに３０００ｒｐｍ、１０分遠心し、沈殿物を生理食塩水にて洗浄後、０．１％トリトンＸ−１００を含む生理食塩水にて溶解したものを、主として血小板由来酸性ホスファターゼを含む血小板溶液として使用した。【００１７】２）操作方法（汎用の自動分析装置、コバスTMファラ（バクスター社）での例）（１）または（２）の緩衝液１５０μｌをキュベットに添加し、２０秒後に（４）の試薬を１５０μｌ加える。６０秒間３７℃でインキュベーション後、（３）基質液を６０μｌ加えて反応液量が試料の１５倍量（＝（１５０μｌ＋１５μｌ＋６０μｌ）／１５μｌ）で酵素反応を開始させ、その６０秒後から１８０秒間、３４０ｎｍでの吸光度変化を測定する。そしてその吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度変化量（酵素反応中の単位時間当たりの吸光度変化量）を求める。ブランクの時の吸光度変化は検体の代わりに生理食塩水または精製水を加え、上記と同様の操作を行って１分間あたりの吸光度変化量を求める。３）計算式上記操作によって得られた吸光度変化量を下記式に代入することによって酸性ホスファターゼ活性（Ｕ／ｌ）を求めることができる。【００１８】【式２】活性（Ｕ／ｌ）＝〔（酵素反応中の単位時間当たりの吸光度変化量−ブランクの時の吸光度変化量）×酵素反応時の液量×１０6 〕÷〔検体量×反応生成物の分子吸光係数×セル光路長〕△E/min sample：酵素反応中の１分間当たりの吸光度変化量△E/min blank ：ブランクの時の１分間当たりの吸光度変化量０．２２５：酵素反応時の液量（ｍｌ）０．０１５：検体量（ｍｌ）２１，５００：反応生成物の分子吸光係数（１／ｍｏｌ・ｃｍ）０．９：光路長（ｃｍ）【００１９】破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性は、（１）の総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ測定用緩衝液を用いて測定した総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性（破骨細胞、赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼ活性）から（２）の酒石酸抵抗性フッ化ナトリウム抵抗性酸性ホスファターゼ測定用緩衝液を用いて求めた残存活性（赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼ活性）を差し引いて求める。なお、１検体の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定に要する時間は約１０分である。また、上記試薬の濃度、組成、液量等は使用する自動分析装置の機種、適用する測定法により適宜調節である。４）予備測定（フッ化ナトリウム（ＮａＦ）濃度の検討）試薬（１）の緩衝液にフッ化ナトリウムを加え、その濃度０、１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００ｍＭに調整した液を用い、試料ａ．牛骨粗精製液、ｂ．赤血球溶液（ヘモグロビン濃度０．８ｇ／ｄｌ）ｃ．血小板溶液（血小板数６０００／μｌ）について前記の（２）操作法に従って各試料の酸性ホスファターゼ活性を測定した。その結果を表１に示した。【００２０】【表１】【００２１】表１の結果から明らかなごとく、赤血球、血小板溶液はフッ化ナトリウムを加えても得られる活性測定値に変化はなかった。しかし、牛骨粗精製液ではフッ化ナトリウム添加により得られる活性測定値が低下し、５０ｍＭでほぼプラトーとなった。この結果より前記した試薬（２）のフッ化ナトリウム濃度は５０ｍＭとした。また表１の結果は、酒石酸とフッ化ナトリウムとが存在すると赤血球及び血小板由来酸性ホスファターゼは阻害されないが、破骨細胞由来酸性ホスファターゼは阻害されたことを示している。なお、フッ化ナトリウムの代わりに、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤として知られている、モリブデン酸塩を用いると、赤血球及び血小板由来酸性ホスファターゼも阻害された。【００２２】５）破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定血清検体について、前記（１）の緩衝液を用いて２）の操作に従って総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を測定したところ３８．９Ｕ／ｌの測定値が得られた。一方、前記（２）の緩衝液を用いて２）の操作に従い赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼ活性を測定したところ１６．４Ｕ／ｌの測定値が得られた。これらの測定値から、血清検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性は２２．５Ｕ／ｌ（＝３８．９Ｕ／ｌ−１６．４Ｕ／ｌ）であることが判った。【００２３】実施例２添加回収試験破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性が既知の血清９容に、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性が既知の牛骨粗精製液１容添加したものを検体とし、実施例１の操作方法に従い検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定し添加回収試験を行った。その結果を表２に示した。【００２４】【表２】【００２５】表２に示すごとく、検討した５種の血清で測定値は平均で１０４．２％の回収率を示し、ほぼ理論値に近い値であった。この結果、本発明の方法では正確に破骨細胞由来酸性ホスファターゼを測定していることが判明した。【００２６】実施例３血清の希釈試験血清を生理食塩水で５段階希釈した検体を実施例１の操作方法に従い破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定した。結果を図１に示した。図１から明らかなように、２種の血清でどちらもほぼ原点を通る直線が得られた。そのため、本発明の測定法では透析や希釈などの操作をしないにもかかわらず、血清中の妨害物質の影響を受けていない事が判明した。【００２７】実施例４溶血検体の影響ヘパリン血漿を溶血前検体として、同一ヘパリン血を攪拌後２２Ｇの注射針を通して溶血させ、遠心して得た血漿を溶血後検体として実施例１の操作法に従い、両者の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性と溶血後のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度を測定した。その結果を表３に示した。【００２８】【表３】【００２９】表３から明らかなごとく、溶血前後で破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の差はほとんどなく、本発明の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定法は溶血の影響を受けないことが判明した。【００３０】実施例５破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の加齢変化集団検診で肝機能と腎機能が正常範囲の女性の血清検体を操作方法に従い破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定し年齢との関係を検討した。その結果を表４に示した。【００３１】【表４】【００３２】表４の結果から明らかなごとく、得られた破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性値の平均値は統計的に有意に４０才代より上昇傾向を示し、閉経による骨吸収の変化を反映していることを示唆する結果であった。実施例６干渉物質の影響実施例１に記載した方法で約２０Ｕ／１の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を有する血清検体に干渉物質を添加して活性を測定し、干渉物質の影響を検討した。その結果、ヘモグロビンでは０．４ｇ／ｄｌ、乳ビでは３８００ホルマジン濁度、遊離及び抱合ビリルビンではそれぞれ１５ｍｇ／ｄｌまで影響は認められなかった。【００３３】【発明の効果】本発明の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定法は、以下のような効果を有する。１）長時間加熱等の検体の前処理をしなくても正確に破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定できる。２）検体に、試薬を添加するだけで、短時間に簡単に破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定できる。３）検体をあらかじめ希釈することなく、正確に検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定できる。４）検体として血清を用いても、破骨細胞由来酸性ホスファターゼを正確に測定することができる。５）汎用型の自動分析装置に適用できるので、多数の検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼを短時間で簡単に測定できる。６）検体中のビリルビン等の干渉物質の影響を受けることなく、検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を測定できる。７）簡便で正確に測定可能な骨吸収変化の指標として有用であると示される。８）検体中の赤血球由来酸性ホスファターゼ及び血小板由来酸性ホスファターゼの影響なく、検体中の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性を正確に測定できる。【図面の簡単な説明】【図１】本発明の破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定法による血清検体の希釈直線性を示すグラフである。 i) 検体中の酸性ホスファターゼに、酒石酸の存在下で酸性ホスファターゼ用基質を作用させて酸性ホスファターゼ活性を測定し、 それとは別に、ii) 検体中の酸性ホスファターゼに、赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤であるフッ化塩と酒石酸との存在下で酸性ホスファターゼ用基質を作用させて酸性ホスファターゼ活性を測定し、次いで、 iii) 上記i) の活性から上記ii) の活性を差し引くことにより測定することを特徴とする破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性の測定方法。 酸性ホスファターゼ用基質がレートアッセイ可能な基質であり、かつ、酸性ホスファターゼ活性の測定をレートアッセイにより実施する請求項１の測定方法。 酸性ホスファターゼ用基質が２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸またはその塩である請求項１または２の測定方法。 検体中の酸性ホスファターゼに、酸性ホスファターゼ用基質を作用させる際、反応液量が用いた検体の５倍以上である請求項１から３のいずれかの測定方法。 i) 酒石酸を含む試薬、 ii）赤血球および血小板由来酸性ホスファターゼを阻害しない破骨細胞由来酸性ホスファターゼ阻害剤であるフッ化塩と酒石酸とを含む試薬、 及び iii) 酸性ホスファターゼ用基質を含む試薬を必須構成試薬とする破骨細胞由来酸性ホスファターゼ活性測定用キット。 酸性ホスファターゼ用基質がレートアッセイ可能な基質である請求項５のキット。 酸性ホスファターゼ用基質が２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸またはその塩である請求項５または６のキット。