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| タイトル： | 特許公報(B2)_アミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法 |
| 出願番号： | 1996194941 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,G01N21/75,G01N21/31,G01N21/33,G01N31/00 |
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朴 準 遠 文 仲 浩 JP 3706687 特許公報(B2) 20050805 1996194941 19960724 アミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法 浦項工科大學校 596108483 八田 幹雄 100072349 野上 敦 100102912 朴 準 遠 文 仲 浩 KR 96P9763 19960401 20051012 7 G01N21/75 G01N21/31 G01N21/33 G01N31/00 JP G01N21/75 Z G01N21/31 G01N21/33 G01N31/00 V 7 G01N 21/75 G01N 21/31 G01N 21/33 G01N 31/00 特開平 ２−１９４３５７（ＪＰ，Ａ） 特開昭５０−１２９２８８（ＪＰ，Ａ） 7 1997281046 19971031 9 20030603 宮澤 浩 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明はアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法に係り、さらに詳細には紫外線／可視光線（ＵＶ／ＶｉＳ）の分光法を用いて基質の表面に形成されたアミノシラン分子層の反応性アミノ基を定量する方法に関する。【０００２】【従来の技術】ヒドロキシル基を含有している基質の表面のシラン化、特にアミノシラン化は酵素、抗体のような生体分子の固定化、無機触媒の固定化、電極の改質化、クロマトグラフィー及びイオン性高分子、非線型光学的発色団、フレーレン（Fullerenes) 、ポルフィリン、遷移金属錯体及び無機コロイダル粒子を有する多様な形態の分子の自己組立用のビルディングファウンデーション形成などの諸分野に用いられている。【０００３】一般に、シラン化合物は多種の基質表面と良く反応して安定した分子層を形成する。このように形成されたシラン分子層は、用いられたシラン化合物の特性によってそれぞれ異なる応用性を有する。特に、アミノ基やチオール基などのような作用基を含んだシラン化合物は酵素や抗体、無機触媒などの固定、逆相クロマトグラフィーなどのための機能性薄膜の製造に広く用いられる。ところで、このような機能性薄膜の製造の際に、基質の表面に露出した反応性一次アミノ基又はチオール基のみが実際に用いられる。【０００４】図１は、通常的な方法により基質の表面にアミノシラン分子層を形成し、これを用いて生体分子の酵素を固定する過程を順に示したものである。【０００５】ヒドロキシル基を含んだ基質１とアミノシラン化合物のうち一つである３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane; 以下、ＡＰＲＴＥＳと称する）２とを反応させ、アミノシラン化された基質３を得る。【０００６】次いで、基質の表面に生体分子の酵素を固定するにはシランの反応性作用基であるアミノ基と酵素の自由アミノ基をカップリングし得る活性化剤４を必要とするが、このような化合物としてはグルタルアルデヒド（Glutaraldehyde: 以下、ＧＡと称する）、テレフタルジカルボキシアルデヒド（Terephthaldicarboxyaldehyde ：以下ＴＤＡと称する）Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（Ｎ−（γ−maleimidobutyryloxy)succinimide:以下ＧＭＢＳと称する）を用い得る。【０００７】アミノシラン化された基質３と活性化剤のＴＤＡ４とを反応させて基質の表面を作用化させる。その後、基質５のカルボニル基と酵素６の自由アミノ基との縮合反応によりその表面に酵素の固定された基質７が得られる。【０００８】基質の表面に形成されたアミノシラン分子層の化学的及び物理的な性質は非常に重要である。これは固定化されたり自己組立される分子の形態及び表面密度に影響を与え、最終的に形成される機能性薄膜の構造及び性質を決定する因子だからである。従って、基質表面に形成されたアミノシラン分子層の性質の分析方法に関する研究が続けられてきた。【０００９】すなわち、アミノシラン化された薄膜におけるアミン作用基の反応性に関する研究は、反射−吸収紫外線分光学（reflection-absorption infrared spectroscopy:ＲＡＩＲ）、光学楕円偏光測定法及び接触角の測定などを用いて行われており、基質表面のシラン化反応に関連した重さの変化は石英−結晶微量天秤（quartz-crystal microbalance:以下ＱＣＭと称する）を用いて測定する。【００１０】このような研究の一つとして前記光学楕円偏光測定法を用いてアミノシラン分子層の厚さを測定し、ＱＣＭを用いて分子層の重さを測定してアミノ基の密度を計算した研究結果が報告されている（Langmuir、vol.9 、2965-2973(1993) & Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 、31、336-338(1992))。【００１１】かかる文献によれば、基質表面にＡＰＲＴＥＳを蒸気状で吸収させる場合には７オングストロームの厚さと５．３シラン／nm2 の密度を有するアミノシランの単分子層が形成されている。しかし、ＡＰＲＴＥＳを液状で吸収させた場合には、１１オングストロームの厚さと６．４シラン／nm2 の密度を有するアミノシランの多分子層が形成された。【００１２】この他、アミノシラン分子層の性質を分析する他の方法として、Ｘ線光電子分光法及び13Ｃ ＣＰ／ＭＡＳ ＮＭＲ分光法なども知られている。【００１３】しかしながら、前記分析方法は基質表面に形成されたアミノシラン分子層の構造及び性質に関する情報を提供するが、次のような問題点がある。【００１４】第一に、基質表面に形成されたアミノシラン分子層の重量変化からアミノ基の密度を測定するＱＣＭ方法では、続く機能性薄膜の製造時に直接適用できる反応性アミノ基のみの密度を選択的に測定することはできない。【００１５】第二に、アミン作用基の密度を測定した後、該作用基を元の目的に合うように変形させ続けられない。すなわち、アミン作用基を一度測定に用いたら廃棄すべきである。【００１６】第三に、分析時に高価な分析装置を必要とする上に、得られた分析資料の解析時に専門的な高度の技術を必要とする。【００１７】そこで、本発明者らは前記の問題点を解決し、基質表面に形成したアミノシラン分子層の反応性アミン作用基の密度のみを選択的に定量するとともに、非破壊的な特性により定量方法に用いられたアミノ基の作用基を元の目的なる機能性薄膜の製造に再び用いることができる分析方法に関する研究を重ねて本発明を完成するに至った。【００１８】【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アミノシラン化した基質表面に形成された反応性アミノ基を定量する方法を提供することにある。【００１９】【課題を解決するための手段】本発明によれば、基質の表面に形成されたアミノシラン分子層のアミノ基をイミン基に変化させる段階と、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いて前記結果物の吸光度を測定して反応性アミノ基の密度を計算する段階とを含み、前記アミノシラン化された基質が破壊されることなく反応性アミノ基のみを選択的に測定し得ることを特徴とするアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法を提供できる。【００２０】前記アミノシラン分子層のアミノ基をイミン基に変化させる段階は、アミノシラン化された基質と芳香族アルデヒド化合物との反応により行うことが好ましい。この際、好ましい芳香族アルデヒド化合物としては４−ニトロベンズアルデヒドが用いられる。【００２１】好ましくは、前記アミノシラン分子層のイミン基をアミノ基に再生する段階をさらに含む。このような再生は、イミン基の加水分解により行われる。【００２２】【発明の実施の形態】以下、添付した図面に基づき本発明を詳細に説明する。【００２３】本発明によれば、基質の表面に形成されたアミノシラン分子層のアミノ基をＵＶ／ＶｉＳ領域で活性を示す発色団イミン基に変化させた後、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法によりアミノシラン分子層の反応性アミノ基のみの密度を簡便に測定できる。さらに、分析に用いたイミン基は加水分解で元のアミノ基に再生され、所望の機能性薄膜の製造に用いることができる。【００２４】ＵＶ／Ｖｉｓ分光法は、偏在化されないπ電子を有する発色体のようにＵＶ／Ｖｉｓ領域（１９０〜８００ｎｍ）の光を吸収する化合物に好適な分析方法である。特定領域における吸収波長を観察すれば基質に前記発色体が結合したか否かがわかり、この際、得られた吸光係数を用いて基質表面に結合した発色体の密度を容易に計算できる。【００２５】図２は、本発明により基質の表面に形成されたアミノシラン分子層におけるイミン形成反応過程を概略的に示す図面である。【００２６】図２を参照して、基質表面のアミノ基と芳香族アルデヒド（ＲＰｈＣＨＯ）化合物（ここで、Ｒはニトロ基（−ＮＯ2 ）、水素（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）及びアルコキシ基（−ＯＲ′）よりなる群から選択される。）とをカップリングさせると、ＵＶ／Ｖｉｓ領域の光を吸収する炭素−窒素の二重結合を有するイミン化合物がほぼ定量収率で得られる。【００２７】この様にして得られたイミン化合物は加水分解してアミン化合物に容易に再生でき、該アミン作用基は使用目的に応じ、続けて変形できる。この際、加水分解反応は通常的な条件、即ち酢酸のような酸を含んだ水溶液状態で行う。【００２８】本発明の芳香族アルデヒド化合物としては、約２４０ｎｍの長波長の光を吸収する上に少ない立体障害を有する化合物が好適である。特に、４−ニトロベンズアルデヒドが最も好ましい。【００２９】本発明に用いられるアミノシラン化合物の代表的な例としてはアミノアルコキシシランが挙げられるが、該化合物は酸性の副生物を生成することなく比較的高い作用基の密度を有するアミノシラン分子層を形成することが知られている。ここで、アミノアルコキシシラン化合物は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−aminopropyltriethoxysilane: ＡＰＲＴＥＳ）、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン(3-aminopropyldiethoxymethylsilane: ＡＰＲＤＥＳ）、３−アミノプロピルエトキシジメチルシラン(3-aminopropylethoxydimethylsilane: ＡＰＲＭＥＳ）などを含む。【００３０】ところで、このような化合物は極めて高い電子遷移（σ−σ* ) のエネルギを有するアルカン化合物なので、このままではＵＶ／Ｖｉｓ分光法で分析できない。すなわち、ＵＶ／Ｖｉｓ領域の光を吸収しないので、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いてアミノシラン分子層のアミノ基の密度が測定できない。これに対し、本発明によれば、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いてアミノ作用基の密度が測定できる。【００３１】本発明の基質はＵＶ／Ｖｉｓ領域の光を吸収しない物質から形成されるべきであり、その例として溶融シリカが挙げられる。【００３２】以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明がこれに限定されるのではない。【００３３】【実施例】（１）アミノシラン化反応綺麗に洗浄した３個の溶融シリカ基質を約２０ｍｔｏｒｒの真空下で乾燥した。窒素雰囲気下で、三つの球状フラスコにＡＰＲＴＥＳ、ＡＰＲＤＥＳ、ＡＰＲＭＥＳのトルエン溶液（それぞれ１０-3Ｍ溶液）をそれぞれ入れた後、前記乾燥基質を一つずつ浸漬させて常温で１０分〜２４時間反応させた。【００３４】前記シラン化反応が終わると、基質をトルエンで洗浄し、約１２０℃のオーブンで３０分間乾燥した。基質を常温に冷却した後、トルエン、トルエン／メタノール（Ｖ／Ｖ＝１：１）及びメタノールに順次に浸してそれぞれ３分ずつ超音波洗浄した。【００３５】アミノシラン化合物としてＡＰＲＴＥＳ、ＡＰＲＤＥＳ又はＡＰＲＭＥＳを用いてアミノシラン化した各基質の状態、すなわち反応時間によるアミノシラン分子層の厚さ（黒丸）を楕円偏光測定法で測定し、図３Ａないし図３Ｃに示した。図３Ａを参照すれば、アミノシラン化合物としてＡＰＲＴＥＳを用いた場合には、反応時間の経過につれて厚く且つ不揃いなアミノシラン分子層が形成された。約１０分間の反応で約６オングストロームの厚さの単分子層が形成されることがわかる。【００３６】図３Ｂを参照すれば、アミノシラン化合物としてＡＰＲＤＥＳを用いた場合には反応時間に係わらずほぼ単分子層であって約９オングストローム厚さの均一な分子層が形成され、さらに図３Ｃからアミノシラン化合物としてＡＰＲＭＥＳを用いた場合は反応時間に係わらず約７オングストロームの厚さの単分子層が形成されることがわかる。【００３７】（２）イミン形成反応三つの球状フラスコに約１ｇの分子篩と６ｍｇの４−ニトロベンズアルデヒドをそれぞれ入れた後、これを窒素雰囲気に転換させた。ここに２５mlの無水メタノールと０．０２mlの酢酸を順に入れた後、前記（１）で製造したアミノシラン化した基質を一つずつ入れ、約５０℃の温度で約３時間反応させた。【００３８】前記基質を常温に冷却した後、それぞれの基質をメタノールで洗浄してから約３分間超音波洗浄した。【００３９】（３）ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いた反応性アミノ基の密度測定前記（２）で得られた分子層の吸光度（○）を測定して図３Ａないし図３Ｃに示し、４−ニトロベンジリデンｔ−ブチルアミンの吸光係数を用いてアミノシラン分子層のアミノ基の密度を計算した。【００４０】４−ニトロベンジリデンｔ−ブチルアミンの吸光係数は４種類の溶媒、即ちメチレンクロリド、クロロホルム、アセトニトリル及びメタノールから求めた平均値を取ったが、これは次の通りであった。【００４１】−メチレンクロリド１．５６×１０7 cm2 ／ｍｏｌ−クロロホルム１．５１×１０7 cm2 ／ｍｏｌ−アセトニトリル１．５５×１０7 cm2 ／ｍｏｌ−メタノール１．５８×１０7 cm2 ／ｍｏｌ∴平均吸光係数１．５５×１０7 cm2 ／ｍｏｌ図３Ａを参照すれば、アミノシラン化合物としてＡＰＲＴＥＳを用いた場合、反応初期には比較的低い吸光度（０．００７８）を示した。そして、２時間経つまで吸光度の増加量は僅かであったが、１２時間経過後は吸光度が急激に高まり、２４時間経過後は吸光度が約０．０２５であった。【００４２】前記データと４−ニトロベンジリデンｔ−ブチルアミンの平均吸光係数を用いてアミノシラン分子層のアミノ基の密度を計算した結果、次の通りとなった。【００４３】初期１０分経過時は１．５アミン／nm2 の極めて低い密度を有する分子層が得られ、１２時間が経過するまでは大きな変化なしに相変わらず低アミノ基密度を有する約５０オングストロームの厚さの多層膜が形成された。２４時間経過後は比較的高いアミノ基の密度を有する約１００オングストロームの厚さの多層膜が形成された。【００４４】図３Ｂを参照すれば、アミノシラン化合物としてＡＰＲＤＥＳを用いた場合には反応時間に係わらずに高い吸光度価を有する約９±１オングストロームの厚さの均一なる薄膜が形成された。反応時間３〜２４時間の吸光度の平均値で計算したアミノ基の密度は３．７〜４．２アミン／nm2 であった。【００４５】図３Ｃを参照すれば、アミノシラン化合物としてＡＰＲＭＥＳを用いた場合は反応時間に係わらずに厚さが約７オングストロームで比較的に低い吸光度を有するアミノシラン分子層が形成された。この際、基質表面のアミノ基の密度は２．１アミン／nm2 であった。【００４６】前記の結果からアミノシラン化合物としてＡＰＲＤＥＳを用いる場合、基質の表面に均一な単分子状の高アミン作用基密度を有するアミノシラン分子層を形成できることがわかる。【００４７】（４）加水分解０．０２mlの酢酸と１５mlの蒸留水とを含んだ三つのフラスコに前記（３）の基質を浸して約３０℃で１時間反応させた。【００４８】反応終了後脱イオン水で洗浄し、約２分間超音波洗浄した後、得られた結果物を真空下で再び乾燥した。【００４９】前記（２）、（３）及び（４）の段階を数回繰り返してイミン形成反応及び加水分解を施し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いてＵＶ吸光特性を分析した。【００５０】図４は、ＡＰＲＤＥＳによるアミノシラン分子層のＵＶ／Ｖｉｓスペクトル （破線）と、該表面のアミノ基をイミン基に変化させた分子層のスペクトル（実線）を示す図面である。【００５１】イミン形成反応と加水分解反応が数回繰り返された後にも図４のように吸収帯がほぼ完璧に再現されることがわかる。即ち、反復的なイミン形成反応と加水分解の後にも元の吸収スペクトルの特性は変わらないことがわかる。【００５２】グルコースオキシダーゼ（glucose oxidase: ＧＯＤ）を基質の表面に固定する場合、基質として前記アミノシラン化した溶融シリカ基質を用いることによって基質の表面に対するＧＯＤの固定化効率を上げられる。ここで、ＧＯＤはβ−Ｄ−グルコースと酸素との反応によるグルコン酸(gluconic acid) と過酸化水素との生成反応を促進する。【００５３】【発明の効果】本発明によれば、基質の表面に形成されたアミノシラン分子層をＵＶ／Ｖｉｓ領域で活性を示す発色団に変化させた後、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法により反応性アミノ基のみの密度を選択的に、また別途に高価の分析装備なしにも簡便に測定できる。この際、分析に用いたイミン作用基はアミノ基に再生され、使用目的に応じて用いられる。【図面の簡単な説明】【図１】通常的な方法により基質の表面に酵素を固定する過程を示す図である。【図２】本発明により基質の表面に形成されたアミノシラン分子層におけるイミン形成反応過程を概略的に示した図である。【図３】（Ａ）ないし（Ｃ）は、反応時間によるそれぞれ３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン及び３−アミノプロピルエトキシジメチルシラン分子層の厚さ及び吸光度の変化を示す図である。【図４】３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン分子層と、該表面のアミノ基をイミン基に変換させた分子層のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す図である。【符号の説明】１…基質２…ＡＰＲＴＥＳ３…アミノシラン化された基質４…活性化剤６…酵素 基質の表面に形成されたアミノシラン分子層のアミノ基をイミン基に変化させる段階と、紫外線／可視光線の分光法を用いて前記結果物の吸光度を測定して反応性アミノ基の密度を計算する段階とを含み、前記アミノシラン化された基質が破壊されることなく反応性アミノ基のみを選択的に測定し得ることを特徴とするアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。 前記アミノシラン分子層のアミノ基をイミン基に変化させる段階はアミノシラン化された基質と芳香族アルデヒド化合物（ＲＰｈＣＨＯ） （ここで、Ｒはニトロ基（−ＮＯ2 ）、水素（−Ｈ）、ヒドロキシル基 （−ＯＨ）及びアルコキシ基（−ＯＲ′）よりなる群から選択される。）との反応によってなることを特徴とする請求項１に記載のアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。 前記芳香族アルデヒド化合物が４−ニトロベンズアルデヒドであることを特徴とする請求項２に記載のアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。 前記基質が溶融シリカであることを特徴とする請求項１に記載のアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。 前記アミノシラン分子層を形成するアミノシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン及び３−アミノプロピルエトキシジメチルシランよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。 前記アミノシラン分子層のイミン基をアミノ基に再生する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。 前記再生段階はイミン基を加水分解することによって行うことを特徴とする請求項６に記載のアミノシラン分子層の反応性アミノ基の定量方法。