生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_血漿または血清試料の調製方法 |
| 出願番号： | 1996005601 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,G01N33/48,G01N1/10,G01N1/28 |
特許情報キャッシュ
北島 昌夫 矢沢 建一郎 JP 3664278 特許公報(B2) 20050408 1996005601 19960117 血漿または血清試料の調製方法 富士写真フイルム株式会社 000005201 田中 政浩 100085109 北島 昌夫 矢沢 建一郎 20050622 7 G01N33/48 G01N1/10 G01N1/28 JP G01N33/48 H G01N1/10 H G01N1/28 J 7 G01N 33/48 G01N 1/10 G01N 1/28 2 1997196910 19970731 8 20020910 竹中 靖典 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は全血から血漿または血清試料を調製する方法に関し、特にヘマトクリット値の高い全血から血球を破壊させることなく血漿や血清試料を高い分離率で取得しうる方法に関するものである。【０００２】【従来の技術】 血液中の構成成分例えば代謝産物、蛋白質、脂質、電解質、酵素、抗原、抗体などの種類や濃度の測定は通常全血を遠心分離して得られる血漿または血清を検体として行われている。【０００３】遠心分離は既に確立された技術ではあるが、検体が微量のときには回収量が少なく、特に小児や小動物を被検者とする場合には必要量の検体を確保することが難しいという問題がある。また、検体のＨｃｔが高い時にも分離が困難であった。【０００４】【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、全血から血漿を分離する際の大きな障害となる高ヘマトクリット検体、具体的には新生児や、脱水状態にある患者からの全血で記録されることのある、ヘマトクリット値が６０〜７０％の範囲の全血でも、確実に血漿分離ができる手段を提供することにある。【０００５】【課題を解決するための手段】全血からの血漿分離技術の開発における問題点は、以下の３点に要約される。（１） 血漿分離の過程で赤血球の破壊（溶血）を起こさせないこと。赤血球の破壊により、血球内成分、特にＨｂ、ＧＯＴ、ＬＤＨ、Ｋなど血漿中よりも血球内の存在量が血漿中よりも著しく多い成分の血漿中への放出が起こって誤差の原因となり、また、Ｈｂの血漿中への放出により光学的に測光の妨害となる。（２） ヘマトクリット値が高く（５０％以上）、赤血球の分離が難しく、且つ、より溶血を起こし易い検体についても確実に血漿分離ができること。ヘマトクリットが高くなると「血液の粘性が」急激に増加する結果分離が著しく難しくなる。（３） 血漿分離の過程で組成の変化が起こらないこと。【０００６】本発明者は、上記課題を解決して、高ヘマトクリット値の全血検体であっても溶血を起こさせることなく高い分離率で血漿を分離取得しうる手段を開発するべく鋭意検討の結果、全血検体にヘマトクリット値を低下させることのできる薬剤を特定濃度範囲内になるように添加してから血漿を分離することによりこの目的を達成することができた。【０００７】 すなわち、本発明は、全血に、無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の水溶液であって浸透圧が血漿より大きい水溶液を、全血の体積の２０％以下、かつ、該無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の濃度が全血１ｍｌあたり１０〜２００μｍｏｌの濃度となるように混合し、次いで血球成分を遠心分離して回収することを特徴とする、全血から血漿または血清試料の調製方法に関するものである。【０００８】【発明の実施の形態】本発明の方法が適用される全血検体は、ヘパリン、ＮａＦ、ＥＤＴＡ、モノヨード酢酸などの抗凝固剤や解糖阻止剤などの有無を問わない。本発明の方法が威力を発揮するのは高ヘマトクリット血液であり、ヘマトクリット値が５０〜７０％特に、５５〜７０％のものである。【０００９】無機塩やアミノ酸やその塩は全血における血球と血漿の分離を促進してヘマトクリットを低下させる作用を有するもの（以下、「ＨＬ剤」と称することがある。）である。【００１０】無機塩、アミノ酸およびその塩であるＨＬ剤はいずれも水溶性であって溶解度が２０℃で１００ｍＭ以上、好ましくは１Ｍ以上、さらに好ましくは３Ｍ以上のものが適当である。無機塩の例としては１価または２価のアルカリ金属またはアルカリ土類金属とハロゲン元素、ＮＯ3、ＳＯ4またはＣＯ3との組合せからなるものを挙げることができる。代表例には、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ2、Ｌｉ2ＳＯ4、ＣａＣｌ2、Ｒｂ2ＳＯ4、Ｃｓ2ＳＯ4などがある。アミノ酸の例としては天然アミノ酸を挙げることができる。代表例にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、グリシンアミドアスパラギンなどがある。無機塩やアミノ酸は水溶液のｐＨが５〜８、好ましくは６〜７．５になるようにし、そのため、無機塩やアミノ酸塩はＮａＨＣＯ3のように水素塩であってもよい。また、アミノ酸もＡｓｐやＧｌｕのような酸性アミノ酸はアルカリ金属やアルカリ土類金属等の塩とし、ＬｙｓやＡｒｇのような塩基性アミノ酸の場合にはハロゲン元素、ＮＯ3、ＳＯ4、ＣＯ3等の塩とすることができる。【００１１】ＨＬ剤の選択に当たっては、測定目的に対する適合性、すなわち血漿中のどのような成分を測定するかにより、化合物を検討する必要がある。例えば、血中のナトリウムやクロルを測定するしようとする場合にＮａＣｌを使用すれば、測定値は大幅にずれてしまうし、無機燐を測定しようとする場合に燐酸塩は使えない。また、測定に使用する試薬の反応性に影響を与える化合物は使えない。例えば、カルシウムの測定の干渉物質となるマグネシウムや鉄、銅、バリウム、亜鉛を含む化合物は、カルシウムを測定しようとする場合には使えない。【００１２】上記のＨＬ剤は水溶液として使用される。ＨＬ剤の濃度は０．１〜５Ｍ程度、好ましくは０.５〜３Ｍ程度、さらに好ましくは１〜２.５Ｍ程度が適当である。【００１３】ＨＬ剤水溶液にはＨＬ剤以外の成分も加えておくことができる。例えば、ＨＬ剤の乾燥防止を目的としてグリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を加えても良い。また、ｐＨを調節する目的で緩衝剤を加えても良い。さらに、分析の目的に応じ、濾過血漿中での被検物質の分離を容易にするために各種の化合物を加えることができる。ＨＤＬコレステロール測定の分画試薬であるデキストランやリンタングステン酸等、ＬＤＬコレステロールとの選択的な結合試薬がその例である。このような成分の他の例として、各種抗原や抗体（修飾を加えたものを含む）など血漿中の特定成分と反応性を有する化合物がある。【００１４】ＨＬ剤を全血に加えると赤血球膜の柔軟性が失われて変形しにくくなる。通常、全血を濾過しようとすると赤血球の見かけの大きさより十分に小さな空隙、例えば直径１〜２μｍのキャピラリーであっても通り抜けてしまうことが知られているが、ＨＬ剤を添加することにより赤血球の強度の変形はなくなるので、濾過が非常にし易くなる。【００１５】ＨＬ剤によるヘマトクリット低下効果は、ＨＬ剤を添加する全血中の血漿体積に対するＨＬ剤のモル濃度に比例する。一方、ＨＬ剤の濃度が２００ｍｍｏｌ／ｌ以上になると血球の破壊（溶血）が起こり易くなり赤血球の主成分であるヘモグロビンが血漿中に溶出してくる。そこで、ＨＬ剤の全血への添加量はＨＬ剤の濃度が全血１ｍｌあたり１０〜２００μｍｏｌ程度、好ましくは１０〜１００μｍｏｌ程度、更に好ましくは２０〜６０μｍｏｌ程度となるようにする。ＨＬ剤水溶液の添加量としては厳密な制限はないが、ＨＬ剤の添加量をあまり大きくすると全血の希釈率が大きくなりずきて、秤量誤差を大きくするので好ましくない。また、希釈倍率が高くなると測定感度との関係で、測定時の精度や正確度が問題となる。そこで、ＨＬ剤水溶液の添加量は容積比で全血の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とする。添加量の下限はＨＬ剤水溶液におけるＨＬ剤の溶解度等に応じて決まり、通常１％以上である。このように、ＨＬ剤を少量添加するだけで濾過がしやすくなるので、測定法の感度や正確度への影響が少ない。そこで、ＨＬ剤水溶液の添加量は容積比で全血の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とする。添加量の下限はＨＬ剤水溶液におけるＨＬ剤の溶解度等に応じて定まり、通常１％以上である。【００１６】ＨＬ剤を加えると、ＨＬ剤は血漿に溶解して血漿の浸透圧を高める。ＨＬ剤の添加により血球内と血漿中での浸透圧の間にギャップが生ずる。この血球内外の浸透圧差を緩和させるような力が働く。すなわち、血球内の水を血漿中に排出し、血球内の浸透圧（すなわち溶質濃度）を高くし、血漿の浸透圧を下げて血球内外の圧力差をなくすような力が働く。その結果、血球の体積は減少し、血漿の体積が増加する。その結果として、ヘマトクリットが低下する。【００１７】ＨＬ剤の添加により赤血球の体積が減少し、またフリーの血漿量が増えるので、血漿の回収率が向上する。【００１８】ＨＬ剤によるヘマトクリットの低下は、ＨＬ剤の濃度と共に上昇するが、血球膜は強度が弱いので、ある程度以上濃くなると血球は破壊、溶血してしまう。ＨＬ剤の作用は主としてその浸透圧に由来するので、全血中（正確には血漿中）の溶質分子数に比例する。ＨＬ剤の添加量が多すぎると血球内外の浸透圧差が大きくなりすぎて、血球が破裂したり、血球膜の一部に穴があいて、血球内成分が血漿中に漏出する。【００１９】一般に血液検査は血漿中の成分濃度の測定を基本としている。赤血球が破壊したり血球膜の一部に穴があくと、赤血球内成分が血漿中に漏出してしまう。赤血球内には高濃度のＨｂ（ヘモグロビン）が詰まっているので、このような漏出が起こると血漿が赤くなる（溶血という）。赤血球の破壊は僅かであってもＨｂの漏出による血漿の着色は無視できず、項目によって測定値に強く影響する。例えば、健常者の血液検査において、全血球の０．１％が破壊したとすると、ＣＰＫ、ＡＬＰなど多くの酵素の測定値は正しく測れない。赤血球内には血漿中よりも濃度の高い成分（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋ）があるのでこれらの項目の測定についても溶血の影響を直接受ける。そこで、血漿の分離、回収に当たっては、溶血ができるだけ少ない条件で実施する必要がある。【００２０】健常者の全血中にはおよそ１５ｇ／ｄｌのヘモグロビン（Ｈｂ）が含まれている。Ｈｂが血漿（血清）中に漏洩（溶血）すると測定値に影響を与える。その程度は測定法、測定項目によって異なる。【００２１】例えば、血糖やコレステロールの測定については溶血の影響を受けにくく、１５０ｍｇ／ｄｌ程度のＨｂが血漿中に含まれていても（全体の１％が溶血したことに相当）正しく測定される。【００２２】一方、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋ等は溶血の影響を受け易く、特にＬＤＨやＫではＨｂが１５ｍｇ／ｄｌ（全体の０．１％の溶血に相当）であっても、測定値は臨床診断上有意な影響を受ける。【００２３】従って、血糖やコレステロールの測定のみを目的とする場合は、血漿分離法として不十分であっても良いが、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋ等を含めて正しく測ることを目的とする場合には、０．１％以上の溶血があってはならない。【００２４】健常者のＨｃｔは４０〜４５％であるが、日常の臨床検査では数％の頻度でＨｃｔが５５〜６０％を示す検体も扱う必要がある。この場合Ｈｂは２０〜２５ｇ／ｄｌとなるので、測定法のＨｂに対する許容範囲を１５ｍｇ／ｄｌとすると、これらの高Ｈｃｔ検体では０．０７％以下の溶血に抑える必要がある。【００２５】従来公知の無機塩やアミノ酸およびその塩またはレンチンなどの血球凝集素を乾燥状態で直接血液に溶解させたり、濾紙や多孔質材料に含浸、乾燥させておく方法においては、血液と乾燥固体が接触し、乾燥固体が血漿に溶解する初期の過程で局所的、一時的に溶血を起こし易い。従って、これらの方法で得た血漿は僅かながらＨｂの混入を伴っていることが多く、血糖やコレステロールの測定には問題がなくても、上記のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋなどの測定には耐えないものであった。この傾向はＨｃｔの高い検体ではさらに顕著であった。【００２６】これに対して、上記化合物を適当な濃度の水溶液にしてから血液と接触させると局所的な濃度の上昇の程度も少なく、また血漿中の拡散も速やかに進行することから溶血は非常に起こりにくくなる。【００２７】全血の使用量は０．３〜３ｍｌ程度、通常０．５〜１．５ｍｌ程度でよい。全血とＨＬ剤水溶液の混合は単に数回振盪するだけでよい。ＨＬ剤の作用は殆ど瞬間的であって数秒のうちに平衡に達すると推定される。従って、混合に際しては温度や時間を特に調節する必要はない。【００２８】ＨＬ剤を添加後は血液を秤置しあるいは遠心分離して血球成分を分離する。この遠心分離は常法に従って行なうことができる。【００２９】遠心分離して得た血漿や血清は常法に従って分析が行なわれるが、本発明の方法は乾式分析素子を用いて複数項目を分析する場合に有効である。【００３０】【実施例】実施例１ヘパリン添加全血２ｍｌを１ｍｌづつテストチューブ（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２）に分取した。【００３１】別に硫酸リチウム(Ｌｉ2ＳＯ4・Ｈ2Ｏ）（和光純薬製）２．５６ｇを１０ｍｌの蒸留水に溶かし、２Ｍの水溶液を調製した。【００３２】Ｎｏ.２のテストチューブに上記２ＭのＬｉ2ＳＯ4・Ｈ2Ｏ２５μｌを添加し、軽く転倒混和した。５分間放置後、テストチューブＮｏ.１およびＮｏ.２の全血をヘマトクリット管に採って、遠心分離し、ヘマトクリットを測定した所Ｎｏ．１：４４％、Ｎｏ．２：３４％であった。またＮｏ．１、Ｎｏ．２のテストチューブ中全血の全量を３０００Ｇで１０分間遠心分離し、血漿を分離回収した。日立臨床検査自動分析機（７１５０）を用いてＮｏ．１、Ｎｏ．２の検体を測定した。その結果は、表１の通りであった。無添加血漿（コントロール）での測定値を１００％とした時のＬｉ2ＳＯ4添加血漿の測定値の比率を計算し、表１にまとめた。表１に見られるように全項目について９０％〜１１０％の範囲に入っていた。【００３３】【表１】【００３４】比較例１実施例１の２ＭＬｉ2ＳＯ4水溶液に代えて生理食塩水を全血に加えて、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）の低下効果を調べた。ヘパリン添加全血１．５ｍｌに生理的食塩水を加えて混和後ヘマトクリットを測定した。健常者の全血(Ｈｃｔ４４％)と高ヘマトクリット全血（５４％）の２レベルについて調べた。結果は表２の通りであった。生理食塩水を用いた場合は赤血球の収縮などの作用は起こらないので、Ｈｃｔの低下の程度は単純希釈を想定して算出した値とほぼ一致した。これらの濃度ではＨｃｔの低下効果は見られないことが確かめられた。【００３５】【表２】【００３６】実施例２実施例１と同様の実験において、ヘマトクリット低下剤としてＲｂ2ＳＯ4を用いて実験した。健常者のヘパリン添加全血（Ｈｃｔ ４４％）１.５ｍｌ＝１ＭのＲｂ2ＳＯ4水溶液６０μｌを添加した。Ｒｂ2ＳＯ4の添加後の濃度は全血１ｍｌ当たり３８ｍｍｏｌであった。混和後Ｈｃｔを測定したところ３６％に低下していた。Ｒｂ2ＳＯ4添加前後の全血を遠心分離し、血漿を回収して日立７１５０自動分析機にて測定した。【００３７】ヘマトクリットの低下率（１４％）に合わせて補正係数を設定して計算をし直した。赤血球膜を自由に通過できる低分子化合物であるＧＬＵおよびＢＵＮについての補正係数はヘマトクリット剤の添加に基づく希釈分のみの補正(０．９５)とし、その他の項目は０．８５として計算した。結果は、表３の通りであった。測定した１９項目の内測定値が僅かの差（０．０４）でも誤差率が高く算出されるＴＢｉｌ（９２％）を除く１８項目について、コントロール（無添加）とヘマトクリット添加サンプルの補正後の差は、±５％以内であり実用上問題のない範囲にあることが確かめられた。【００３８】【表３】【００３９】【発明の効果】本発明により全血からの血漿分離の効率を上げ回収血漿量を増やすことができる。また、ヘマトクリットが低下し、血漿の量が増加する結果、遠心による血漿の分離が容易になる。添加する試薬を適切に選択することにより、分離回収した血漿を検体として全ての血漿成分の定量的な測定が可能である。 全血に、無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の水溶液であって浸透圧が血漿より大きい水溶液を、全血の体積の２０％以下、かつ、該無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の濃度が全血１ｍｌあたり１０〜２００μｍｏｌの濃度となるように混合し、次いで血球成分を遠心分離して回収することを特徴とする、全血から血漿または血清試料を調製する方法。 請求項１において、該無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の水溶液の濃度が０．１〜５Ｍであることを特徴とする、全血から血漿または血清試料を調製する方法。