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| タイトル： | 特許公報(B2)_化学発光分析試薬の安定化 |
| 出願番号： | 1995178122 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,G01N21/78,G01N33/532,G01N33/535,G01N33/543 |
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渡辺 誠 柴田 典緒 JP 3593384 特許公報(B2) 20040903 1995178122 19950621 化学発光分析試薬の安定化 栄研化学株式会社 000120456 渡辺 誠 柴田 典緒 20041124 7 G01N21/78 G01N33/532 G01N33/535 G01N33/543 JP G01N21/78 C G01N33/532 B G01N33/535 G01N33/543 545K 7 G01N 21/75-21/83 特開平０６−０３４６３０（ＪＰ，Ａ） 米国特許第０４５９８０４４（ＵＳ，Ａ） 3 1997005241 19970110 7 20020523 加々美 一恵 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、化学発光分析試薬の安定化試薬および方法に関るものである。更に詳しくは安定化した２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬および２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬の安定化技術に関るものである。【０００２】【従来の技術】近年、化学発光を測定系とする全自動分析装置ならびに分析用試薬が、いくつか開発され、臨床検査室で容易に化学発光測定を利用する環境が整いつつある。これらの測定系に用いられる代表的な化学発光物質は、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン（ルミノール）、６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン（イソルミノール）等の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物、ジオキセタンおよびアクリジニウムエステル等が知られている。ルミノール、イソルミノールは、主としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識とした競合法またはサンドウィッチ法のＥＩＡで用いられる。ジオキセタンは、アルカリフォスファターゼを標識としたＥＩＡで、アクリジニウム化合物は、それ自体を標識とした化学発光法で用いられている。【０００３】ルミノールおよびイソルミノールは、容易かつ比較的安価に入手可能な原料であり、フェノール化合物等の増感物質によって十分な発光強度が得られる。一般的な測定は、抗体または抗原を結合した固相と検体およびＰＯＤ標識抗体または抗原とを反応させ、サンドウィッチ型の結合物を形成させる。続いて過剰のＰＯＤ標識抗体または抗原を洗浄により除いた後、過酸化水素水および増感物質を含むルミノールまたはイソルミノール溶液を加えて、放出される光の量を測定することからなる。【発明が解決しようとする問題点】【０００４】２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物は溶解直後の非特異発光が高いため、化学発光分析には、１週間程度エイジングした溶解試薬を使用しなければならない。ところが長期保存した溶液を用いると、保存状態が低温（４℃）であっても、発光強度が次第に低下してしまう欠点があった。発光強度の低下はＳ／Ｎ比の低下につながる。【問題点を解決するための手段】【０００５】本発明の課題は、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物による発光試薬を溶液状態で安定化する技術を提供する事にある。そしてその課題は、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物含有発光試薬に無機アジドを０．０１〜０．１％の範囲で添加することによって解決される。この濃度範囲以上の無機アジドの添加は、反応中にＰＯＤ活性を阻害して発光強度の低下をもたらすおそれが生じる。一方、この濃度範囲以下の無機アジド添加は、測定中の発光強度を安定化する作用が期待できるものの（特開平６−３４６３０）、長期保存した２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物溶液の安定化には寄与しない場合がある。【０００６】無機アジドとしては、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム等のアルカリ金属アジドおよびアジ化バリウム等のアルカリ土類金属アジドが使用されるが、特に好ましいのは、アジ化ナトリウムである。アジ化ナトリウムは広く一般に防腐剤として用いられているが、本発明の安定化効果は、雑菌汚染を防止することによって達せられたものではない。【０００７】溶液組成物の安定化技術として、しばしば特定の緩衝液およびｐＨの効果が取り上げられているが、本発明の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物溶液の安定化技術においては、緩衝液の種類は特に問わない。りん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、くえん酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常用いられる緩衝液から１種またはこれらの２種を組合わせたものから適宜選べばよい。緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲内に調整されていれば、安定化効果は変わらない。ｐＨ３以下の酸性条件ではアジ化ナトリウムが分解されるので、安定化効果は得られない。【０００８】２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物発光試薬中の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物濃度は特に限定されるものではなく、試薬構成の量的比に合わせて任意に選べばよい。全自動化学発光分析機ＡＬ−１０００（栄研化学販売）用試薬では、洗浄した固相ビーズにＰＯＤ基質である過酸化水素水とルミノール発光試薬をそれぞれ１００μｌ分注するシステムであり、このシステムに適合する発光試薬の適当なルミノール濃度は０．００１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．０１〜１ｍＭである。化学発光エンハンサ−は、試薬構成上ならびに測定操作の簡便化のため、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物発光試薬に共存させる方が望ましい。フェノール系エンハンサーとしては、４−ヨードフェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノールが特に有効とされるが（特公平３−５５３９）、これらのエンハンサーはいずれも、０．０１〜１０ｍＭの濃度範囲で２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物と同一溶液中に共存させることができる。【０００９】以下に実施例を述べる。【実施例１】ＣＥＡ測定による無機アジド含有ルミノ−ル試薬の安定化効果無機アジド無添加ルミノ−ル試薬と無機アジド添加ルミノ−ル試薬をそれぞれ４℃、３７℃に２週間および１カ月間保存し、ルミスポットＣＥＡ（栄研化学製・登録商標）の指示書に記載されたプロトコ−ルにしたがって、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００により免疫反応を実施した。ＣＥＡの酵素免疫反応後のペルオキシダ−ゼ活性を各種ルミノ−ル試薬により測定し、発光強度を比較した。【００１０】１−（ａ）固相化抗体市販の抗ＣＥＡウサギポリクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ製）をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍｌとした抗体溶液中にポリスチレンビ−ズ（直径１／４インチ，積水化学工業製）を浸漬し４℃で一晩放置した。放置後生理食塩水で洗浄し、０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳに室温３時間浸漬して固相化抗体を得た。【００１１】１−（ｂ）ＰＯＤ標識抗体市販の抗ＣＥＡモノクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ製）を石川らの方法（特願昭５７−３３６６２等）によりＰＯＤ（東洋紡績社製，西洋ワサビ由来）と結合させ、ＰＯＤ標識抗体を作製した。これをセファデックスＧ−２００を用いて分画精製し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで２５０倍に希釈して使用した。【００１２】１−（ｃ）発光試薬１、２３０％過酸化水素水（和光純薬工業製）０．３ｍｌを０．１Ｍ、ｐＨ８．０のりん酸緩衝液１０００ｍｌに溶解し、過酸化水素試薬とした。ルミノール（東京化成製）２２５ｍｇおよびｐ−ヨードフェノール（和光純薬工業製）１１ｍｇを０．１Ｍ、ｐＨ８．０のりん酸緩衝液１０００ｍｌに溶解し、一部はそのままルミノール試薬Ａとし、一部はさらにアジ化ナトリウム（和光純薬工業製）を０．０２５％となるように加えルミノール試薬Ｂとした。【００１３】１−（Ｃ）免疫学的測定法試料として市販精製ＣＥＡ（ＳＣＲＩＰＰＳ社）を用いこれを０．２％ＢＳＡ加ＰＢＳで使用濃度に希釈して免疫反応に供した。測定は全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００にて行った。プロトコ−ルは次の通りである。各免疫反応用チュ−ブにあらかじめ抗体不溶化固相を１コづつ入れておき、その中に被検試料６０μｌと希釈液２００μｌを添加し、３７℃約７分反応させた。反応後溶液を吸引除去して、ビ−ズをＰＢＳで洗浄し、ＰＯＤ標識抗体４０μｌおよび希釈液１７０μｌを加え３７℃，約７分反応させた。反応後溶液を除去し、ビ−ズを洗浄した後、前記の過酸化水素試薬、１００μｌおよびルミノール試薬Ａ、１００μｌまたはルミノール試薬Ｂ、１００μｌを加え、発光強度（３秒間の積算値）を測定した。【００１４】結果を表１に示す。表中の数値は、検体が精製ＣＥＡの場合は発光の計測値を、また検体が血清の場合はＣＥＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。測定値の右に示される％値は、調製時の試薬による測定値に対する比率である。低濃度の精製ＣＥＡにおいて、アジ化ナトリウムの顕著な効果が認められた。血清測定値はそれぞれの試薬でキャリブレーションを行った後の測定のため、アジ化ナトリウム添加効果は小さくなるが、測定値の正確性は明らかに無添加試薬より良好との結果が得られた。【００１５】【表１】【００１６】【実施例２】ＡＦＰ測定による無機アジド含有ルミノ−ル試薬の安定化効果前記発光試薬２−Ａと発光試薬２−Ｂをそれぞれ４℃、３７℃に２週間および１カ月間保存し、ルミスポットＡＦＰ（栄研化学製・登録商標）の指示書に記載されたプロトコ−ルにしたがって、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００により免疫反応を実施した。ＡＦＰの酵素免疫反応後のペルオキシダ−ゼ活性を各種ルミノ−ル試薬により測定し、残存発光強度を比較した。【００１７】２−（ａ）固相化抗体市販の抗ＡＦＰウサギポリクロ−ナル抗体（ＵＣＢ社製）をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍｌとした抗体溶液中にポリスチレンビ−ズ（直径１／４インチ，積水化学工業製）を浸漬し４℃で一晩放置した。放置後、生理食塩水で洗浄し０．３％ＢＳＡ含有ＰＢＳに室温３時間浸漬して固相化抗体を得た。【００１８】２−（ｂ）ＰＯＤ標識抗体市販の抗ＡＦＰモノクロ−ナル抗体（ザイメット社製）を石川らの方法（特願昭５７−３３６６２等）によりＰＯＤ（東洋紡績社製，西洋ワサビ由来）と結合させ、ＰＯＤ標識抗体を作製した。これをセファデックスＧ−２００を用いて分画精製し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈して使用した。【００１９】２−（ｃ）免疫学的測定法試料として市販ＡＦＰ標準（日本バイオテスト研究所製）を用いこれを０．２％ＢＳＡ加ＰＢＳで使用濃度に希釈して免疫反応に供した。測定は全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＬ−１０００（栄研化学）にて行った。プロトコ−ルは次の通りである。各免疫反応用チュ−ブにあらかじめ抗体不溶化固相を１コづつ入れておき、その中に被検試料２０μｌと希釈液２５０μｌを添加し、３７℃約７分反応させた反応後溶液を吸引除去して、ビ−ズをＰＢＳで洗浄し、ＰＯＤ標識抗体４０μｌおよび希釈液１７０μｌを加え３７℃、約７分反応させた。反応後溶液を除去し、ビ−ズを洗浄した後下記の各化学発光試薬を２００μｌ加え、発光強度（３秒間の積算値）を測定した。【００２０】結果を表２に示す。表中の数値は、検体がＡＦＰ標準品の場合は発光の計測値を、また検体が血清の場合はＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。測定値の右に示される％値は、調製時の試薬による測定値に対する比率である。ＡＦＰにおいてもＣＥＡと同様に、アジ化ナトリウムを添加したルミノール試薬の安定性は顕著に向上している。【００２１】【表２】【発明の効果】本発明により、２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬の保存安定性が向上し、全自動化学発光酵素免疫測定装置への適用が容易となる。 化学発光をシグナルとする化学発光分析用の試薬組成物において、無機アジドを０．０１〜０．１％含有させる２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬組成物の安定化方法。 無機アジドがアジ化ナトリウムである請求項１に記載の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬組成物の安定化法。 発光増強剤を含む請求項１に記載の２，３−ジヒドロ−１，４フタラジオン化合物試薬組成物の安定化法。