生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_エリスロポエチン依存性ヒト細胞株 |
| 出願番号： | 1994298813 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12N5/06,A61K38/00,A61P7/00,A61P7/06,G01N33/53 |
特許情報キャッシュ
朝長 万左男 栗山 一孝 宮崎 泰司 樋口 正人 JP 3696274 特許公報(B2) 20050708 1994298813 19941108 エリスロポエチン依存性ヒト細胞株 中外製薬株式会社 000003311 社本 一夫 100089705 今井 庄亮 100071124 増井 忠弐 100076691 栗田 忠彦 100075236 小林 泰 100075270 江尻 ひろ子 100091638 朝長 万左男 栗山 一孝 宮崎 泰司 樋口 正人 JP 1994272823 19941012 20050914 7 C12N5/06 A61K38/00 A61P7/00 A61P7/06 G01N33/53 C12N5/06 C12R1:91 JP C12N5/00 E A61P7/00 A61P7/06 G01N33/53 K G01N33/53 V A61K37/02 C12N5/00 E C12R1:91 7 C12N 5/00 BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed JSTPlus(JOIS) J.Biol.Chem., Vol.266, No.4, pp.2009-2012 (1991) 3 FERM BP-4819 1996163982 19960625 10 20010522 田村 明照 【０００１】【産業上の利用分野】本発明はエリスロポエチン依存性ヒト細胞株に関し、さらに詳しくはエリスロポエチンに特異的に依存して増殖するヒト細胞株、および該細胞株を用いるエリスロポエチン活性のスクリーニング法に関する。【０００２】【従来の技術】エリスロポエチン（以下、Ｅｐｏと略記することもある）は高等動物における赤血球の細胞増殖分化を制御する糖タンパク質である（例えば、Carnot et al., Compt. Rend. 143:384, 1986参照）。赤血球は骨髄中で赤芽球の成熟および分化により生産されるが、エリスロポエチンは未分化の前駆細胞に作用してその赤血球への分化を誘導するサイトカインである。そのような作用から、エリスロポエチンは貧血、特に腎性貧血の臨床治療薬として近年大いに使用されている。【０００３】現在臨床分野で使用されているエリスロポエチンのほとんどは遺伝子組換え技術によって得られる各種組換え体である。また、最近ではこのような組換えタンパク質そのものではなく、もっと低分子でエリスロポエチン活性をもつ化合物で置き換えることが試みられている（Lutz B. Giebel, Orally Active Cytokines: Designing a Small Molecule Mimetic of Erythropoietin, IBC Conference: New Advances in Peptidemimetics & Small Molecule Design, March 23-25, 1994）。このような場合、可能性のある組換え体または低分子化合物を臨床分野での応用に供するためには、これらのエリスロポエチン活性を簡単かつ確実にスクリーニングすることが必要である。エリスロポエチンに特異的に依存して増殖する細胞であれば、このような目的に使用することができる。【０００４】エリスロポエチンに依存して増殖するヒト細胞株の樹立が報告されている（Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 140:323, 1989）。しかしながら、このＴＦ−１と命名された細胞株はエリスロポエチンのみに特異的に依存するのではなく、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）やＩＬ−３（インターロイキン−３）にも依存性である。【０００５】また、エリスロポエチンの存在下に維持しうるヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ−７（Komatsu et al., Cancer Res. 51:341, 1991）もＴＦ−１細胞と同様にＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−３にも依存性である。一方、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３依存性を消失したＵＴ−７／Ｅｐｏ細胞の樹立が報告されている（Komatsu et al., Blood 82:456, 1993）。しかしながら、ＵＴ−７／Ｅｐｏ細胞のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３依存性の消失が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３共通のシグナル伝達タンパク質である受容体β鎖の量的減少に起因しているものである以上（Komatsu et al., 前出）、親株であるＵＴ−７細胞のＳＣＦ依存性（Auffray et al., Exp. Hematol. 22:417, 1994）を有している可能性は否定できない。【０００６】また、近年、エリスロポエチン特異的なシグナル伝達機構の解明が精力的に行われ、それにかかわる多くの物質が同定されている。しかし、これらの研究は前述したＴＦ−１細胞（Hanazono et al., Int. J. Hematol. 59:80, 1994）や、Ｂ細胞系であるＢａ／Ｆ３細胞にエリスロポエチン受容体を人為的に発現させた細胞（例えば、Showers et al., Blood 80:3070, 1992）を用いて行われており、これらの細胞はエリスロポエチンのみならず、ＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−３にも依存性を示す。このような様々なサイトカインに反応する細胞を用いた場合には、エリスロポエチンで刺激した場合であっても他のサイトカインのシグナル伝達経路を流用している可能性が否定できない。【０００７】したがって、エリスロポエチン存在下に樹立され、継代を重ねてもエリスロポエチンのみに依存して増殖し、かつエリスロポエチンに特異的なシグナル伝達タンパク質／遺伝子の発見にも使用できるような細胞株は得られていなかった。【０００８】【発明が解決すべき課題】このような状況の中で、生理的なエリスロポエチン標的細胞である赤芽球の性質を残し、かつエリスロポエチンのみに特異的に依存して増殖し、エリスロポエチン活性のスクリーニングに用いることができ、またエリスロポエチンに特異的なシグナル伝達タンパク質／遺伝子の発見にも使用できる細胞株の樹立が求められている。【０００９】本発明の目的はエリスロポエチン活性のスクリーニングに使用できるエリスロポエチン依存性細胞株を提供することにある。【００１０】本発明はさらに、該細胞株を用いてエリスロポエチン活性を測定するインビトロスクリーニング法を提供することも目的とする。【００１１】【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、エリスロポエチンの生理的標的細胞である赤芽球が白血病化した細胞の中から、かかる細胞株を樹立することに成功し、本発明を完成した。【００１２】すなわち、本発明はエリスロポエチンに特異的に依存して増殖するヒト細胞株を提供する。【００１３】さらに、本発明はエリスロポエチン活性を有すると推察される化合物を上記細胞株に添加して細胞増殖または分化誘導を試験することからなるエリスロポエチン活性のインビトロスクリーニング法を提供する。【００１４】 本発明の細胞株は、例えば初期赤芽球白血病（ｅａｒｌｙ ｅｒｈｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者の骨髄などから採取さた細胞を用いて樹立することができる。本発明では特に、骨髄に芽球が７６．２％認められた患者の骨髄芽球を採取した。この細胞はＥｐｏ添加でコロニーを形成した。さらにこの芽球をＦＣＳ（ウシ胎児血清）およびＥｐｏ添加したＩＭＤＭ（イスコーブ改変ダルベッコ培地）にて培養したところ継代可能となり、安定した細胞株を樹立することができた。このようにして樹立された細胞株はＡＳ−Ｅ２と命名され、生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ：ＢＰ−４８１９で寄託されている（１９９４年１０月５日寄託）。【００１５】ＡＳ−Ｅ２はパーオキシダーゼ反応（ＰＯ）が陰性であり、巨赤芽球様変化を認めた（過ヨウ素酸シッフ試薬：ＰＡＳ陽性）。【００１６】また、細胞株ＡＳ−Ｅ２の表面抗原を検討したところ、ＣＤ７１、ＣＤ３６、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＣＤ３８、ＣＤ１９などを発現していた。【００１７】ＡＳ−Ｅ２の各種サイトカインに対する反応性を試験したところ、Ｅｐｏとともにインキュベートしたときのみ顕著に刺激され、ＡＳ−Ｅ２がＥｐｏに特異的に反応して増殖することを示した。さらに、ＡＳ−Ｅ２に対するＥｐｏの反応性および抗Ｅｐｏ抗体による増殖阻害を試験するために顕微鏡下で細胞数を数え、またトリパンブルーで生細胞数をカウントしたところ、Ｅｐｏ添加条件にのみ顕著な細胞増殖が認められ、また抗Ｅｐｏ抗体の添加によってこのような増殖効果は抑制されることが明らかとなった。【００１８】また、放射標識Ｅｐｏの結合実験よりＡＳ−Ｅ２におけるＥｐｏ受容体の発現が確認された。さらに得られたデータからＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いてＥｐｏ受容体の性質を解析した結果、ＡＳ−Ｅ２が発現するＥｐｏ受容体は低親和性型のみであった。【００１９】最近、ＥｐｏはＥｐｏ受容体と結合し、これによってＪａｋファミリーチロシンキナーゼの１種であるＪａｋ２がリン酸化され、さらにこのリン酸化によってＪａｋ２自身がキナーゼ活性をもって次の分子をリン酸化するという増殖シグナルの伝達経路が提唱されている（Ihle et al., TIBS 19:222, 1994）。この仮説の正当性を検討するために、ＡＳ−Ｅ２をＥｐｏ非存在下で２４時間培養し、次いでＥｐｏを添加した後、細胞を可溶化し、抗Ｊａｋ２抗体または抗Ｅｐｏ受容体抗体で免疫沈降を行った。沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化チロシン抗体でチロシンリン酸化タンパク質を検出した結果、ＡＳ−Ｅ２はＥｐｏに反応し、かつＥｐｏシグナル伝達系であるＥｐｏ受容体およびＪａｋ２のチロシンリン酸化が認められた。これは、上記の増殖シグナル伝達経路が正しいことを示唆する結果といえる。【００２０】増殖シグナルとは別に、同じ受容体から発信される赤血球特異的な細胞分化のシグナルの存在が示唆されているが、これについては現在ほとんど解明されていない。ただ、Ｅｐｏ受容体から赤血球特異的な一連の転写因子群を活性化するシグナルが伝達され、これら転写因子によって制御されている下流の赤血球特異的な遺伝子群（ヘム合成酵素遺伝子やグロビン遺伝子）の転写が活性化され、最終的にヘモグロビン産生細胞に分化すると考えられている（Yamamoto M. 実験医学 11:1026, 1993）。この特異的な転写因子であるＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２のｍＲＮＡの発現をノーザンブロットにより試験したところ、ＡＳ−Ｅ２ではＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２のいずれもが発現していることが確認された。【００２１】このようなＡＳ−Ｅ２の各種特徴から、ＡＳ−Ｅ２がＥｐｏのみに特異的に依存して増殖する細胞株であることが示された。【００２２】したがって、本発明の細胞株は各種組換え体ＥｐｏまたはＥｐｏ活性を有すると推察される低分子化合物などのＥｐｏ活性を簡単かつ確実にインビトロでスクリーニングするのに有用である。このようなスクリーニングは細胞増殖または分化誘導を試験することによって実施できる。例えば、Ｅｐｏ活性を有すると推察される化合物と本発明の細胞株とを混合してインキュベーションし、一定時間後の細胞増殖を3Ｔ−チミジンの取り込み試験、またはＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）アッセイ法（J. Immun. Methods 65:55, 1983参照）で測定するか、あるいは生細胞数を測定することなどによって実施することができる。また、この試験法によってＥｐｏ濃度を測定することも可能である。さらに、本発明の細胞株を、初期赤芽球白血病の病態解析や治療モデルとして使用することができる。さらには、上述したように、本発明の細胞株を、エリスロポエチンに特異的なシグナル伝達タンパク質／遺伝子を解明するための実験にも使用することができる。【００２３】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。【００２４】【実施例】実施例１：ＡＳ−Ｅ２の樹立および維持初期赤芽球白血病患者から骨髄液を採取した。この患者は初診時骨髄に芽球［光顕ＰＯ（−）、ＰＡＳ（−）、ＣＤ１１ｂ（−）、ＣＤ１３（＋）、ＣＤ３３（＋）、ＣＤ１０（−）、ＣＤ１９（−）、グリコホリンＡ（＋）、染色体：４６、ＸＹ］が７６．２％認められた。この患者の骨髄芽球はＥｐｏ添加でコロニーを形成した。次いでこの芽球を、Ｅｐｏ（２ｕ／ｍｌ）および２０％ ＦＣＳ添加ＩＭＤＭ中で培養したところ安定して継代可能となり、細胞株として樹立された。この細胞株をＡＳ−Ｅ２と命名した。【００２５】ＡＳ−Ｅ２の形態および表面抗原は以下の通りである。ＡＳ−Ｅ２の形態ＡＳ−Ｅ２は顕微鏡で観察したところ、径約３０μ程度であり、空胞を有している。ＰＯは陰性であり、ＰＡＳは陽性であった。ＡＳ−Ｅ２の表面抗原の解析本実施例で樹立した細胞株ＡＳ−Ｅ２の表面抗原の発現を、各種ヒト抗原に対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、フローサイトメーターによる蛍光抗体法（Fried et al., Flow Cytometry, Boca Raton, CRC Press:59-78, 1989）により検討した。【００２６】得られた結果を以下の表１に示す。【００２７】表から明らかなように、ＡＳ−Ｅ２はＣＤ７１、ＣＤ３６、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ＣＤ３８、ＣＤ１９などを発現していた。【００２８】実施例２：各種サイトカインに対する反応性実施例１で樹立した細胞株ＡＳ−Ｅ２の各種サイトカインへの反応性を試験した。【００２９】ＡＳ−Ｅ２ ５，０００細胞／ウエルに各種サイトカインを添加し、５％ ＣＯ2、９５％ 空気（湿度１００％）、３７℃で３日間培養した。使用したサイトカインの種類および濃度は以下の通りである：ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）：１０ｕ／ｍｌヒトインターロイキン−１α（ｈＩＬ−１α）：１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン−１β（ｈＩＬ−１β）：１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）：１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン３（ｈＩＬ−３）：１００ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）：１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン６（ｈＩＬ−６）：１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン７（ｈＩＬ−７）：１０ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン８（ｈＩＬ−８）：１０００ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン１１（ｈＩＬ−１１）：１０ｎｇ／ｍｌヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）：１００ｕ／ｍｌヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）：１０ｎｇ／ｍｌ ヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ）：１０ｎｇ／ｍｌヒト赤血球分化因子（ｈＥＤＦ）：１０ｎｇ／ｍｌヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）：１０ｎｇ／ｍｌヒトトランスフォーミング増殖因子−β（ｈＴＧＦ−β）：１００ｎｇ／ｍｌヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）：１０ｎｇ／ｍｌヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）：５００ｎｇ／ｍｌヒトオンコスタチンＭ：１００ｎｇ／ｍｌヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）：１０００ｎｇ／ｍｌ培養後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６TM ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｒｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより細胞数を測定した。細胞を含まないブランク、およびサイトカインを含まない対照を同時に試験した。得られた結果を図１に示す。図から明らかなように、ＡＳ−Ｅ２はＥｐｏとともにインキュベートしたときのみ顕著に増殖が刺激され、その他のサイトカインによっては刺激されなかった。実施例３：Ｅｐｏ反応性および抗Ｅｐｏ抗体による増殖阻害実施例１で樹立した細胞株ＡＳ−Ｅ２のＥｐｏ反応性（増殖活性）および抗Ｅｐｏ抗体による増殖活性を試験した。【００３０】ＡＳ−Ｅ２細胞１×１０5細胞／ｍｌを用いて、（１）Ｅｐｏを添加しないで培養、（２）Ｅｐｏ ２ｕ／ｍｌを添加して培養、および（３）Ｅｐｏ ２ｕ／ｍｌと抗Ｅｐｏ抗体（αＥｐｏ：１／１００に希釈して使用）を添加して培養し、経時的（２、４、６、８日）に細胞数を顕微鏡下でカウントした。得られた結果を図２に示す。図から明らかなように、Ｅｐｏ添加した細胞はＥｐｏ添加しない細胞と比較して細胞数の顕著な増加が観察された。また、抗Ｅｐｏ抗体を同時に添加した場合には、この増殖活性が阻害された。【００３１】次いで、上記３群の細胞をトリパンブルーで染色して生細胞数をカウントした結果を図３に示す。図から明らかなように、Ｅｐｏ添加しない細胞、およびＥｐｏと抗Ｅｐｏ抗体を添加した細胞では生細胞数が経時的に減少していたが、Ｅｐｏ添加した細胞では細胞数としてカウントされたほとんどが生細胞数としてもカウントされた。実施例４：Ｅｐｏ受容体の発現の確認ＡＳ−Ｅ２細胞上でＥｐｏ受容体が発現していることを以下の方法で確認した。【００３２】ＡＳ−Ｅ２細胞を２４時間Ｅｐｏ非存在下で培養し、１×１０6個の細胞に対して125Ｉ−Ｅｐｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を０．０６〜３ｎＭ添加して１５℃、３時間の条件で結合アッセイを行った。非特異的結合は、125Ｉ−Ｅｐｏの４００倍量の非標識Ｅｐｏ存在下で測定した。なお、結合アッセイ培地の組成は、２％ ＢＳＡ、０．２％ ＮａＮ3を含むＩＭＤＭ培地である。得られた結合を図４に示す。これより、ＡＳ−Ｅ２細胞上にＥｐｏ受容体が発現していることが確認された。【００３３】次いで結合アッセイから得られたデータからＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を行ってＥｐｏ受容体の解離定数（Ｋｄ値）と受容体数とを求めたところ、ＡＳ−Ｅ２細胞が発現しているＥｐｏ受容体が低親和性型１種類のみであることが示された。実施例５：Ｊａｋ２、Ｅｐｏ受容体のリン酸化ＡＳ−Ｅ２におけるＪａｋ２およびＥｐｏ受容体のリン酸化を以下の方法で試験してＥｐｏのシグナル伝達経路を検討した。【００３４】ＡＳ−Ｅ２をＥｐｏ非存在下で２４時間培養し、次いでＥｐｏ（０または１０ｕ／ｍｌ）を添加して５分間反応させた後、１％ ＮＰ−４０（ナカライテスク株式会社製）、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ（和光純薬工業株式会社製）、０．１ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン（和光純薬工業株式会社製）、５μＭペプスタチンＡ（和光純薬工業株式会社製）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製）を含むトリス緩衝塩溶液で細胞を可溶化した。これを用いて抗Ｊａｋ２抗体または抗Ｅｐｏ受容体抗体（いずれもＵＰＳＴＡＴＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．（ＵＳＡ）社製）で免疫沈降を行った。沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化チロシン抗体（和光純薬株式会社製）でチロシンリン酸化タンパク質を検出した。得られた結果を図５（Ａ：抗Ｊａｋ２抗体、Ｂ：抗Ｅｐｏ受容体抗体、また、Ａ、Ｂいずれにおいても、レーン１はＥｐｏ非添加の場合を、レーン２はＥｐｏ添加した場合を表す）に示す。図から明らかなように、ＡＳ−Ｅ２はＥｐｏに反応し、かつＥｐｏシグナル伝達系であるＪａｋ２およびＥｐｏ受容体のチロシンリン酸化が認められた。実施例６：ＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２のｍＲＮＡの発現ＡＳ−Ｅ２におけるＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２のｍＲＮＡの発現を以下のノーザンブロット分析により検討した。【００３５】本発明の細胞株ＡＳ−Ｅ２、ならびに対照としてＫ５６２細胞株（慢性骨髄性白血病急性転化細胞株）およびＨＬ−６０細胞株（急性白血病細胞株）から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、全ＲＮＡをキット添付の処方に従って調製した。次いで、ノーザンブロット分析（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）を行った。プローブの標識はＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＬａｂｅｌｌｉｎｇＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて行った。すなわち、ＰＶＣベクターのＥｃｏ ＲＩ部位に挿入されたＧＡＴＡ−１（Zon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10638-10641, 1991）とＧＡＴＡ−２（Nagai et al., Blood 84:1074-1084, 1994）をコーディングするインサートを切り出し、キット添付の処方に従って標識プローブを作製した。【００３６】前述の各細胞からの全ＲＮＡを１レーン当たり３０μｇ使用し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ハイブリダイゼーション・トランスファー・メンブレンとしてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用し、キャピラリー法によりブロッティングした。ハイブリダイゼーションは５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１％ ＳＤＳの組成よりなる溶液を用いて４２℃で一晩実施した。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで室温にて４回洗浄し、さらにＢＡＳ（Ｆｕｊｉ社製）にてオートラジオグラフィーを行い、画像解析をした。その結果を図６（Ａ：ＧＡＴＡ−１、Ｂ：ＧＡＴＡ−２、また、Ａ、Ｂいずれもにレーン１はＡＳ−Ｅ２、レーン２はＫ５６２、レーン３はＨＬ−６０を表す）に示す。図から明らかなように、ＧＡＴＡ−１はＡＳ−Ｅ２とＫ５６２に明瞭なバンドとして検出され、またＧＡＴＡ−２はＡＳ−Ｅ２、Ｋ５６２、ＨＬ−６０のいずれの細胞株でも認められた。【００３７】【発明の効果】本発明によってエリスロポエチンのみに特異的に依存して増殖し、エリスロポエチン活性のスクリーニングに用い得る細胞株の樹立が達成された。本発明の細胞株を用いてエリスロポエチン活性を有すると推定される化合物のエリスロポエチン活性を測定するインビトロスクリーニング法が可能となった。このインビトロスクリーニングは本発明の細胞株の細胞増殖または分化誘導を試験することにより実施できる。また、この試験法によってＥｐｏ濃度を測定することも可能である。さらに、本発明の細胞株を、初期赤芽球白血病の病態解析や治療モデルとして使用することができる。さらには、本発明の細胞株を用いて、エリスロポエチンに特異的なシグナル伝達タンパク質／遺伝子を解明するための実験を行うことができる。【００３８】これらの点から本発明のエリスロポエチン依存性ヒト細胞株の利用価値は極めて大きい。【図面の簡単な説明】【図１】ＡＳ−Ｅ２細胞に対する各種サイトカインの反応性を示す図である。【図２】ＡＳ−Ｅ２のＥｐｏ反応性および抗Ｅｐｏ抗体による増殖活性を示すための、顕微鏡で観察した経時的な細胞数を示す図である。（●）はＥｐｏ ２ｕ／ｍｌを添加した細胞、（△）はＥｐｏを添加しない細胞、（□）はＥｐｏ ２ｕ／ｍｌと抗Ｅｐｏ抗体（αＥｐｏ：１／１００希釈）を添加した細胞を表す。【図３】ＡＳ−Ｅ２のＥｐｏ反応性および抗Ｅｐｏ抗体による増殖活性を示すための、トリパンブルー染色した経時的な生細胞数を示す図である。（●）はＥｐｏ ２ｕ／ｍｌを添加した細胞、（△）はＥｐｏを添加しない細胞、（□）はＥｐｏ ２ｕ／ｍｌと抗Ｅｐｏ抗体（αＥｐｏ：１／１００希釈）を添加した細胞を表す。【図４】125Ｉ−Ｅｐｏを用いるＡＳ−Ｅ２の結合アッセイを示す図である。（○）は全結合活性、（□）は非特異的結合活性、（●）は特異的結合活性を表す。【図５】ＡＳ−Ｅ２におけるＪａｋ２およびＥｐｏ受容体のリン酸化を示す図（電気泳動の写真）である。図中、Ａは抗Ｊａｋ２抗体（レーン１はＥｐｏ非添加；レーン２はＥｐｏ添加）、Ｂは抗Ｅｐｏ受容体抗体（レーン１はＥｐｏ非添加；レーン２はＥｐｏ添加）との免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動に付し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化チロシン抗体でチロシンリン酸化タンパク質を検出した図を表す。【図６】ＡＳ−Ｅ２、Ｋ５６２、ＨＬ−６０細胞株におけるＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２のｍＲＮＡの発現を示す図（電気泳動の写真）である。図中、ＡはＧＡＴＡ−１（レーン１はＡＳ−Ｅ２；レーン２はＫ５６２；レーン３はＨＬ−６０）、ＢはＧＡＴＡ−２（レーン１はＡＳ−Ｅ２；レーン２はＫ５６２；レーン３はＨＬ−６０）をプローブとして用いたノーザンブロットの結果を表す。 エリスロポエチンに特異的に依存して増殖し、その他のサイトカインに対して反応しないヒト細胞株であって、ＡＳ−Ｅ２（生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ：ＢＰ−４８１９）である前記細胞株。 初期赤芽球白血病患者の骨髄細胞由来である請求項１に記載の細胞株。 エリスロポエチン活性を有すると推察される化合物を請求項１に記載の細胞株に添加して細胞増殖または分化誘導を試験することからなるエリスロポエチン活性のインビトロスクリーニング法。