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| タイトル： | 特許公報(B2)_血漿蛋白の分画方法 |
| 出願番号： | 1993343231 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C07K1/36,C07K14/75,C07K14/765 |
特許情報キャッシュ
井上 昌弘 伊藤 浩和 藤井 平 祇園 吉彦 冨岡 新二 木村 清 高橋 剛 西槇 秀雄 武智 和男 JP 3560066 特許公報(B2) 20040604 1993343231 19931217 血漿蛋白の分画方法 三菱ウェルファーマ株式会社 000006725 萩野 平 100073874 佐々木 清隆 100081075 深沢 敏男 100066429 添田 全一 100093573 井上 昌弘 伊藤 浩和 藤井 平 祇園 吉彦 冨岡 新二 木村 清 高橋 剛 西槇 秀雄 武智 和男 20040902 7 C07K1/36 C07K14/75 C07K14/765 JP C07K1/36 C07K14/75 C07K14/765 7 C07K 1/00 - 1/36 C07K 14/745-14/77 BIOSIS(DIALOG) JICSTファイル(JOIS) BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed Vox Sang，１９６２年，Vol.7，p.414-424 Vox Sang，１９７６年，Vol.31，p.289-295 ZETA PLUS LOW ALUMINUM CA & SA & LA Series Filter Media，米国，CUNO Inc.，１９９０年 9 1995173190 19950711 9 20001208 上條 肇 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は血漿蛋白含有物、特に血漿から血漿蛋白を効率よく各種血漿蛋白成分に分画する方法に関する。【０００２】【従来の技術】血漿蛋白は血漿に含まれる蛋白の総称であり、１００種類以上の蛋白成分からなる。血漿蛋白の主な成分はアルブミン、グロブリン、各種血液凝固因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、プロトロンビン等である。血漿からこれらの血漿蛋白成分に分画する方法としては、コーンの低温エタノール分画法、硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法等が知られている。【０００３】ところで、低温エタノール分画法において、生成された上清画分および沈殿画分を分離する方法としては遠心分離法、濾過分離法等が知られている。このような低温エタノール分画法としては、例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７，２０（１９７２）、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，３１，２８９−２９５（１９７６）等に記載がある。【０００４】遠心分離法は遠心機１台当たりの処理能力に限界がある点や、高速回転に伴う発熱および騒音、あるいは高速回転体による危険性といった問題点のあることが指摘されている。そこで、このような問題点を回避することを目的として、濾過処理法による実用化が展開されつつある。【０００５】【発明が解決しようとする課題】本発明は従来の遠心分離法に比較して、血漿蛋白含有物、特に血漿から血漿蛋白を安全かつ効率よく分画することができる方法を提供することを目的とするものである。【０００６】【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の事情を考慮して各種検討を行った結果、低温エタノール分画処理により調製された上清画分および沈殿画分を、特定の条件下において濾過処理することにより効率よく分離回収することに成功し、本発明を完成した。本発明は、以下の血漿蛋白の分画方法であり、これらにより上記目的を達成できる。１） 血漿蛋白含有物をエタノール濃度５〜１０％、ｐＨ６．８〜７．４の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第Ｉ沈殿画分および第Ｉ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。２） 第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、ｐＨ４．５〜８の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿画分および第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。３） 第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ５〜７の条件下での低温分画処理後に孔径０．４〜２μｍ、濾過面積１０〜２０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）添加の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＶ沈殿画分および第ＩＶ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。４） 第ＩＶ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ４〜５．５の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下に濾過処理を行うことにより第Ｖ沈殿画分および第Ｖ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。５） 孔径０．６〜２μｍの条件下に濾過処理を行う上記１）記載の血漿蛋白の分画方法。６） 孔径０．６〜２μｍの条件下に濾過処理を行う上記２）記載の血漿蛋白の分画方法。７） 孔径０．４〜１μｍの条件下に濾過処理を行う上記３）記載の血漿蛋白の分画方法。８） 孔径０．６〜２μｍの条件下に濾過処理を行う上記４）記載の血漿蛋白の分画方法。９） 血漿蛋白含有物をエタノール濃度５〜１０％、ｐＨ６．８〜７．４の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第Ｉ沈殿画分および第Ｉ上清画分を分離回収し、第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、ｐＨ４．５〜８の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿画分および第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分を分離回収し、第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ５〜７の条件下での低温分画処理後に孔径０．４〜２μｍ、濾過面積１０〜２０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）添加の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＶ沈殿画分および第ＩＶ上清画分を分離回収し、第ＩＶ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ４〜５．５の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下に濾過処理を行うことにより第Ｖ沈殿画分および第Ｖ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。【０００７】本発明は、血漿蛋白含有物もしくはその画分を低温エタノール分画処理し、次いで特定の条件下において濾過処理することにより効率よく低温エタノール分画処理により生成した上清画分と沈殿画分をそれぞれ分離回収するものであり、本発明の特徴は該濾過処理の最適条件を見出したことにある。本発明における濾過処理条件は、前記した通りである。そして、本発明は該条件を満足するように従来公知の濾過手段（濾過材、および濾過装置）を適宜選択し得る。【０００８】濾過処理条件における孔径とは、濾過材の平均孔径を意味し、濾過面積とは濾過すべき液１０００〜５０００Ｌ（リットル）を柱体形状で保持している濾過材表面の面積（即ち、柱体の横断面積または底面）を指す。また、必要により濾過助剤を適宜使用することができる。この場合、濾過助剤は主として沈殿物を多孔質化し、濾過抵抗を著しく減少させる作用を有するものであり、濾過材の濾過機能を促進する機能を有する。濾過助剤は低温エタノール分画処理した液に濾過前もしくは濾過と同時に添加される。そして、本発明では、該濾過すべき液を圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下で濾過する。【０００９】〔１〕出発原料本発明の出発原料として使用される血漿蛋白含有物は、血漿蛋白を含有するものであれば、特に限定されないが、通常、例えば、血液、血漿、血清、これらに由来する画分等が挙げられる。具体的には血漿からクリオプレシピテートを除去したもの、血漿からプロトロンビン複合体を除去したもの等が例示される。【００１０】本発明１）においては、濾過処理により第Ｉ沈殿画分と第Ｉ上清画分が得られる。これは従来法によるコーンの第Ｉ沈殿画分およびその上清画分に相当することが、後述の実験例からも明らかであるが、従来の画分成分と厳密に一致しなければならないものではない。従って、本発明２）に使用される第Ｉ上清画分は、本発明１）からのものに限定されずこれと実質的に変わらない従来法によるコーンの第Ｉ上清画分であってもかまわない。【００１１】同様に、本発明３）に使用される第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分、または本発明４）で使用される第ＩＶ上清画分も従来法のコーンの各画分に相当するので、本発明２）の第Ｉ上清画分と同様な取扱いができる。〔２〕本発明の濾過処理（フィルタープレス使用）（１）第Ｉ沈殿画分と同上清画分の分離出発原料をエタノール濃度５〜１０％、好ましくは７〜９％で処理して上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿画分よりフィブリノゲン等を回収することができる。【００１２】１．エタノール処理条件ｐＨ６．８〜７．４、温度５〜−３℃（特に−２〜−３℃）、３０分間〜１５時間特に１〜５時間）程度が例示される。なお、エタノール処理条件は公知のコーンの低温エタノール分画法に準じている。以下、（２）〜（４）も同様である。【００１３】２．濾過処理条件ａ．孔径０．６〜４μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うことが例示される。このうち、最も好ましいのは０．６〜２μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）であるが、０．９〜４μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス１０ＬＡ）も同程度に好ましい。好ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2である。なお、濾過時間は濾過面積、濾過液量に応じて適宜変更することができる。また、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）程度添加することが好ましい。濾過助剤としてはケイソウ土等が例示される。【００１４】ｂ．フィルタープレスフィルタープレスは濾過装置および濾過材から構成される。濾過装置は加圧濾過式、圧搾式、ガスブロー式、電気浸透式、それらの組合せ等が知られている。また、濾過装置は、市販品を使用できる。具体的には加圧濾過とガスブローを組合わた濾過装置（ＳＥＩＴＺ社製、商品名ＯＲＩＯＮ Ｃ４０）等が例示される。【００１５】濾過材（濾布を含む概念である）は繊維（例、セルロース等）、樹脂、無機濾過助剤（ケイソウ土、パーライト等）等が知られている。この濾過材は市販品を使用できる。具体的には高度精製セルロース繊維と酸処理ケイソウ土を組合せた濾過材（キュノ社製ゼータプラスＬＡシリーズ）等が例示される。尚、以下の（２）〜（４）においても上記と同様のフィルタープレスを使用することができる。【００１６】（２）第ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿画分と同上清画分の分離第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、好ましくは２０〜２５％で処理して上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿画分より免疫グロブリン等を回収することができる。１．エタノール処理条件ｐＨ４．５〜８（特にｐＨ５．２〜７）、温度０〜−７℃（特に−５〜−６℃）、３０分間〜１５時間（特に１〜５時間）程度が例示される。【００１７】２．濾過処理条件孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うことが例示される。このうち、最も好ましいのは０．６〜２μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）であるが、０．９〜４μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス１０ＬＡ）も同程度に好ましい。好ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2である。また、濾過助剤を使用することもできる。【００１８】（３）第ＩＶ沈殿画分と同上清画分の分離第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％で処理して上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿画分よりアンチトロンビン−ＩＩＩ、ハプトグロビン等を回収することができる。１．エタノール処理条件ｐＨ５〜７（特にｐＨ５．８〜６．３）、温度０〜−７℃（特に−５〜−６℃）、３０分間〜１５時間（特に１〜５時間）程度が例示される。【００１９】２．濾過処理条件孔径０．４〜２μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うことが例示される。このうち、最も好ましいのは０．４〜１μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス５０ＬＡ）であり、次いで好ましいのは０．６〜２μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）である。好ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2である。また、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）添加する。濾過助剤としてはケイソウ土等が例示される。【００２０】（４）第Ｖ沈殿画分と同上清画分の分離第ＩＶ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％で処理して上清画分と沈殿画分とに分離する。沈殿画分よりアルブミン等を回収することができる。１．エタノール処理条件ｐＨ４〜５．５（特にｐＨ４．８〜５．２）、温度０〜−７℃（特に−５〜−６℃）、３０分間〜１５時間（特に１〜５時間）程度が例示される。【００２１】２．濾過処理条件孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過時間１０時間以内の条件下に濾過処理を行うことが例示される。このうち、最も好ましいのは０．６〜２μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス３０ＬＡ）であるが、０．９〜４μｍの孔径幅を有する濾過材（例、ゼータプラス１０ＬＡ）も同程度に好ましい。好ましい圧力は１ｋｇ／ｃｍ2である。また、濾過助剤を使用することもできる。このようにして分画された血漿蛋白は公知の手法により単離、精製することができる（特開平３−１２８３９８を参照のこと）。【００２２】【発明の効果】本発明の方法によれば、血漿蛋白含有物、特に血漿から血漿蛋白を効率よく分画することができる。また、従来の遠心分離法に比較して、作業環境の改善（危険性、騒音等）、血漿分画能力の増強、勤務体制の改善（手間、勤務時間面）を図ることができる。【００２３】【実施例】本発明をさらに詳細に説明するために実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。実施例１血漿２０００Ｌからクリオペイスト、プロトロンビンおよび血液凝固第ＩＸ因子を分離した後の上清画分２０００Ｌに予め−２０℃に冷却されたエタノールを添加し、終濃度８％とした。ｐＨ７．２、温度−２℃で２時間静置して沈殿（第Ｉ画分）を生成した。ゼータプラス３０ＬＡ（孔径０．６〜２μｍ、キュノ社製）を用いて、濾過面積１２ｍ2、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下で濾過処理を行った。濾過助剤としてマンビル社製酸処理セライト５３５を１０ｇ（液量１Ｌ当たり）使用した。濾過装置は、ＳＥＩＺＴ社製、商品名ＯＲＩＯＮ Ｃ４０（全長２９２０ｍｍ×幅７２０ｍｍ×高さ９８０ｍｍ）を用いた。濾過処理は３時間で終了した。沈殿画分は、フィブリノゲン製剤の原料となる。上清画分は次の実施例に用いた。【００２４】実施例２第Ｉ上清画分２３００Ｌに予め−２０℃に冷却されたエタノールを添加し、終濃度２１％ととした。ｐＨ６．８、温度−５℃で２時間静置して沈殿（第ＩＩ＋ＩＩＩ画分）を生成した。ゼータプラス３０ＬＡを用いて、濾過面積２４ｍ2、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下で濾過処理を行った。濾過処理は９時間で終了した。沈殿画分は、グロブリン製剤の原料となる。上清画分は次の実施例に用いた。【００２５】実施例３第ＩＩ＋ＩＩＩ画分２７００Ｌに予め−３０℃に冷却されたエタノールを添加し、終濃度４０％とした。ｐＨ６．０、温度−５℃で２時間静置して沈殿（第ＩＶ画分）を生成した。ゼータプラス５０ＬＡ（孔径０．４〜１μｍ、キュノ社製）を用いて、濾過面積１６ｍ2、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下で濾過処理を行った。濾過助剤としてマンビル社製酸処理セライト５３５を２０ｇ（液量１Ｌ当たり）使用した。濾過処理は８時間で終了した。沈殿画分は、アンチトロンビン−ＩＩＩ製剤およびハプトグロビン製剤の原料となる。第ＩＶ上清画分は次の実施例に用いた。【００２６】実施例４第ＩＶ上清画分４０００Ｌ（エタノール終濃度４０％）をｐＨ４．８に調整し、温度−５℃で２時間静置して沈殿（第Ｖ画分）を生成した。ゼータプラス３０ＬＡを用いて、濾過面積２４ｍ2、濾過圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下で濾過処理を行った。濾過処理は９時間で終了した。沈殿画分は、アルブミン製剤の原料となる。【００２７】実施例５実施例３の第ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿画分からアンチトロンビン−ＩＩＩを分離した後の画分を用いて、実施例３に準じて濾過処理を行った。調製された沈殿画分はハプトグロビン製剤の原料となる。実験例１（処理時間）実施例１の本発明法（濾過処理法）と同じ出発原料を同量使用して、実施例１〜４に対応した各画分を夫々、従来法（シャープレス型遠心分離装置（例、商品名シャープレスＮｏ６Ａ）を用いた遠心分離法）で上清画分と沈殿画分とを分離回収するのに必要な時間を比較検討した。尚、従来法のエタノール処理条件は、実施例と同様に行った。【００２８】結果を表１に示す。【００２９】【表１】【００３０】実験例２（収量の比較）実験例１と同様に本発明法（濾過処理法）と従来法（遠心分離法）で各々調製された沈殿画分（ペイスト）から常法により回収できる血漿蛋白の量を比較検討してみた。量は血漿１０００Ｌ当たりの換算値で表示した。結果を表２に示す。尚、表２中、第ＩＶ画分のアンチトロンビン−ＩＩＩの「１倍」は正常人血漿１ｍｌに含まれるアンチトロンビン−ＩＩＩ量に相当する。【００３１】【表２】 血漿蛋白含有物をエタノール濃度５〜１０％、ｐＨ６．８〜７．４の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第Ｉ沈殿画分および第Ｉ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。 第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、ｐＨ４．５〜８の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2 （液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿画分および第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。 第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ５〜７の条件下での低温分画処理後に孔径０．４〜２μｍ、濾過面積１０〜２０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）添加の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＶ沈殿画分および第ＩＶ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。 第ＩＶ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ４〜５．５の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下に濾過処理を行うことにより第Ｖ沈殿画分および第Ｖ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。 孔径０．６〜２μｍの条件下に濾過処理を行う請求項１記載の血漿蛋白の分画方法。 孔径０．６〜２μｍの条件下に濾過処理を行う請求項２記載の血漿蛋白の分画方法。 孔径０．４〜１μｍの条件下に濾過処理を行う請求項３記載の血漿蛋白の分画方法。 孔径０．６〜２μｍの条件下に濾過処理を行う請求項４記載の血漿蛋白の分画方法。 血漿蛋白含有物をエタノール濃度５〜１０％、ｐＨ６．８〜７．４の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積５〜１５ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第Ｉ沈殿画分および第Ｉ上清画分を分離回収し、第Ｉ上清画分をエタノール濃度１８〜３０％、ｐＨ４．５〜８の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿画分および第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分を分離回収し、第ＩＩ＋ＩＩＩ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ５〜７の条件下での低温分画処理後に孔径０．４〜２μｍ、濾過面積１０〜２０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下、濾過助剤を１〜１００ｇ（液量１Ｌ当たり）添加の条件下に濾過処理を行うことにより第ＩＶ沈殿画分および第ＩＶ上清画分を分離回収し、第ＩＶ上清画分をエタノール濃度３５〜４５％、ｐＨ４〜５．５の条件下での低温分画処理後に孔径０．６〜４μｍ、濾過面積２０〜３０ｍ2（液量１０００〜５０００Ｌ当たり）、圧力１Ｋｇ／ｃｍ2以下に濾過処理を行うことにより第Ｖ沈殿画分および第Ｖ上清画分を分離回収することを特徴とする血漿蛋白の分画方法。