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| タイトル： | 特許公報(B2)_株化血管平滑筋細胞 |
| 出願番号： | 1993293684 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C12N5/10,A61K35/12,C12N15/09,A61K35/34 |
特許情報キャッシュ
長谷川 一英 小田 祥二 松田 譲 荒川 絵美 帯刀 益夫 矢内 信昭 JP 3564156 特許公報(B2) 20040611 1993293684 19931124 株化血管平滑筋細胞 株式会社ファクト 503359544 平木 祐輔 100091096 石井 貞次 100096183 藤田 節 100118773 島村 直己 100101904 長谷川 一英 小田 祥二 松田 譲 荒川 絵美 帯刀 益夫 矢内 信昭 JP 1992320507 19921130 20040908 7 C12N5/10 A61K35/12 C12N15/09 A61K35/34 C12N5/10 C12R1:91 JP C12N5/00 B A61K35/12 C12N15/00 A A61K35/34 C12N5/00 B C12R1:91 7 C12N 5/00 C12N 15/00 BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed JSTPlus(JOIS) J.Biol.Chem., Vol.262, No.15, pp.7282-7288 (1987) J.Biol.Chem., Vol.261, No.31, pp.14740-14745 (1986) J.Cellular Physiology, Vol.142, No.2, pp.342-351 (1990) 6 FERM BP-4082 FERM BP-4473 1994209768 19940802 8 20000107 特許法第３０条第１項適用申請有り 平成４年１０月９日 社団法人日本生化学会発行の「生化学第６４巻第８号第７５３頁」に発表 田村 明照 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は細胞工学技術に関する。更に詳しくは、平滑筋型ミオシン重鎖を発現する能力を有する株化血管平滑筋細胞で、平滑筋細胞の形質を合成型から収縮型へ回帰させる、あるいは合成型や悪性型の平滑筋細胞のみを排除する薬物を探索するのに利用可能な細胞株に関する。【０００２】【従来の技術】血管平滑筋細胞の増殖は、動脈硬化性病変（アテローム性動脈硬化や高血圧など）を引き起こす重要な原因の一つである。今まで知られている抗動脈硬化薬は、平滑筋細胞の増殖に関する危険因子である脂質を主な標的としている。例えば、コレステロール合成の律速酵素であるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の阻害剤、トリグリセリド低下効果を示すクロフィブレート系薬剤、又は胆汁排泄促進効果を示す陰イオン交換樹脂など、脂質代謝改善を目的とした開発が中心に進められている。これらの薬剤による硬化病巣の退縮効果の有無についても検討されているが、その効果は一様ではなく、病巣に蓄積した脂質を排除することによる２次的効果に留まっている。現段階では、動脈硬化巣の平滑筋細胞に積極的かつ選択的に作用して、その増殖を抑制したり、病巣の退縮を促す薬剤は存在せず、動脈硬化巣の直接的治療は、病巣を押し広げたり、切り取ったりして内腔を広げる経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）に頼らざるを得ないのが実情である。ところが、これらの治療方法においては、術後に再度平滑筋細胞が増殖して血管が再狭窄するという現象が高頻度におき、新たな問題となっている。このように、平滑筋細胞の異常増殖が動脈硬化性病変や術後再狭窄における重要な原因であるにもかかわらず、平滑筋細胞に選択的かつ直接に作用してその増殖を制御する薬剤の開発が遅れているのは、試験管内で動脈硬化巣と同様の現象を再現することができず、従って効果的、効率的な薬剤探索法を構築できなかったためである。【０００３】血管平滑筋細胞の増殖を制御しようとする際には、平滑筋細胞の形質変換を考慮することが重要である。血管平滑筋細胞は、正常時中膜で収縮型を呈するが、動脈硬化症においては、合成型に形質を変えて内膜に遊走し、そこで増殖や細胞外マトリックスの合成・分泌、脂質の取り込みなどを行い、内膜を肥厚させる。内膜に移行した平滑筋細胞は、一部はその形質が収縮型へ戻るものの、残りは合成型、更には悪性型として増殖・分泌などを続け、病巣を拡大させる。従って、このような形質変換を制御できる薬剤があれば、動脈硬化の進展を抑制したり、病巣の退縮を促進したりする効果が期待できる。【０００４】平滑筋細胞のこれら３つの形質、収縮型、合成型及び悪性型の指標としては、細胞内微小構造の違いや増殖能、蛋白質合成能などの違いに加え、細胞骨格系蛋白質のアイソフォームが異なることも最近明らかにされている。例えば、収縮型平滑筋細胞ではα−アクチン、平滑筋型ミオシン重鎖（ＳＭ１、ＳＭ２）、メタビンキュリン、１５０ｋＤａ−カルデスモン、カルポニンを多く発現している。一方、合成型平滑筋細胞ではβ−アクチン、非筋型ミオシン重鎖、１３０ｋＤａ−ビンキュリン、７０ｋＤａ−カルデスモンが多く発現している（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， ｐ．１３０４２−１３０４６， １９９０）。更に悪性型は、合成型平滑筋細胞の特徴に加え、Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ＡｄｈｅｓｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＩＣＡＭ−１） やサイトケラチン８、ＩＩ型主要組織適合性抗原などを発現するようになる（Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １４０， ｐ．８８９−８９６， １９９２； Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ４０， ｐ．５５−６２， １９８９； Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｕｐｐｌ．， ２６１， ｐ．７２−７７， １９９１）。従って、これらの蛋白質のアイソフォームを指標とすることにより平滑筋細胞の形質を見分けることが可能である。中でもミオシン重鎖アイソフォームが平滑筋細胞の形質を規定するマーカーとして、また動脈硬化発症に伴う平滑筋細胞の形質変換を判定するマーカーとして優れていることが知られている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， ｐ．１８２７２−１８２７５， １９８９； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６， ｐ．３７６８−３７７３， １９９１）。即ち、ＳＭ１の発現が平滑筋細胞に分化したことを示し、ＳＭ２ の発現はその平滑筋細胞が収縮型の形質を獲得した正常成体型であることを示す。そして動脈硬化になると、平滑筋型ミオシン重鎖の発現が減少し、代わりに非筋型ミオシン重鎖が発現するようになる。またカルポニンの発現も ＳＭ２ の発現と同じく収縮型の形質の指標であることが明らかにされている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｂｉｏｌ．， １５３， ｐ．１８５−１９３， １９９２）。しかしながら、これらの形質を培養平滑筋細胞で再現しようとして動物より正常血管を摘出し、その平滑筋細胞を分離して培養系に移すと、形質は合成型の形質へと容易かつ不可逆的に変化してしまうという問題を生じる。【０００５】なお、本発明者らは、平滑筋型ミオシン重鎖を発現する能力を有する株化血管平滑筋細胞 ＳＶＳ３０−２−６ について第６５回日本生化学会大会で平成４年１０月９日に既に発表している。また、ラット肺動脈細胞から自発的に不死化した平滑筋型ミオシン重鎖を発現できる血管平滑筋細胞株（ＰＡＣ−１株）の樹立が報告されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ８６， ｐ．１９７７， １９９２） 。更に、該細胞がカルポニンを発現していることも日本循環器学会学術集会第５７回（１９９３年３月）及び第６６回日本生化学会大会（１９９３年１０月）において発表されている。【０００６】【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗動脈硬化薬の探索を目的とした平滑筋形質変換の試験管内での再現に必要な株化血管平滑筋細胞を樹立することにある。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を包含する。（１）平滑筋型ミオシン重鎖を発現する能力を有する株化血管平滑筋細胞。（２）細胞が温度感受性変異株 ＳＶ４０ｔｓＡ５８ のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス由来である上記（１）に記載の株化血管平滑筋細胞。（３）細胞が ＳＶＳ３０−２−６ 又は ＳＶＳ２４−１−１ である上記（１）に記載の株化血管平滑筋細胞。（４）細胞がカルポニンを発現する能力を有するものである上記（１）に記載の株化血管平滑筋細胞。（５）細胞が ＳＶＳ２４−１−１ である上記（４）に記載の株化血管平滑筋細胞。（６）温度感受性変異株 ＳＶ４０ｔｓＡ５８ のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス由来で、かつ平滑筋型ミオシン重鎖及びカルポニンを発現する能力を有する株化血管平滑筋細胞。【０００８】従来の株化細胞樹立法には、１）初代培養細胞を長期培養し続け無限増殖能を獲得した細胞を得る方法と、２）ＳＶ４０などの癌遺伝子を初代培養細胞に導入して不死化させるという方法がとられている。１）の方法は時間がかかるにもかかわらず目的とする細胞が必ず得られるとは限らない。２）の方法では導入した癌遺伝子が発現し機能するまでに細胞が死んでしまったり、形質が変化してしまったりする。血管平滑筋細胞についてもＳＶ４０の遺伝子を導入して不死化させた例がいくつかあるが、それらは形質がかなり変化してしまっている（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １４２， ｐ．３４２−３５１， １９９０； Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １３６， ｐ．２９７−３０６， １９９０； Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １３９， ｐ．６２９−６４０， １９９１ ）。【０００９】このような従来の株化細胞樹立法の欠点を克服する方法として、ＳＶ４０などの癌遺伝子を導入したトランスジェニックマウスから目的の組織の細胞を単離し株化細胞を得るという方法が開発された（Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， １９７， ｐ．５０−５６， １９９１； Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ８２， ｐ．１３４４−１３４８， １９９１）。この方法では最初から不死化に必要な癌遺伝子が細胞に組み込まれているので、分化形質を保持したままの株化細胞がかなり高頻度で樹立できる。本発明者は、この技術を用いて、温度感受性変異株 ＳＶ４０ｔｓＡ５８ のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスから株化血管平滑筋細胞を樹立した。これらの細胞は、平滑筋型ミオシン重鎖を発現する能力を有していた。更に、そのうち一部の細胞はカルポニンを発現する能力をも有していた。【００１０】従って、これらの細胞を用いて抗動脈硬化薬の探索が可能になった。即ち、平滑筋型ミオシン重鎖の発現が低く、逆に非筋型ミオシン重鎖を発現している状態の細胞を悪性型のモデルとし、平滑筋型ミオシン重鎖を多量に発現し非筋型ミオシン重鎖の発現が低下している状態の細胞を合成型又は収縮型のモデルとすることができる。あるいはまた平滑筋型ミオシン重鎖を発現しているが、カルポニンを発現していない状態の細胞を合成型のモデル、平滑筋型ミオシン重鎖とカルポニンをともに発現している状態の細胞を収縮型のモデルとすることができる。このような種々の状態の細胞を用いれば、形質を収縮型へ回帰させることができる薬物や、悪性型や合成型の平滑筋細胞のみを排除する薬物を選択することができる。【００１１】薬物探索の手順として、例えば上記のような悪性型や合成型のモデル細胞を無蛍光グラスの上に培養して、種々の薬物を添加する。そして平滑筋型ミオシン重鎖特異認識抗体及び非筋型ミオシン重鎖特異認識抗体で蛍光抗体染色を行い、平滑筋型ミオシン重鎖特異認識抗体で染まり、非筋型ミオシン重鎖特異認識抗体で染まらなくなる薬剤を選択する。また蛍光抗体染色の代わりに、９６穴プレートを用い酵素抗体法で判定することも可能である。同様の手順で、合成型のモデル細胞に対する薬物の効果をカルポニン特異認識抗体で判定することができる。またこれらの細胞について、蛍光抗体染色や酵素抗体法の代わりに、平滑筋型又は非筋型ミオシン重鎖遺伝子やカルポニン遺伝子の発現を検出し、定量することにより薬物を選択することもできる。【００１２】もう一つの手段として、悪性型のモデル細胞と、合成型又は収縮型のモデル細胞を培養し、種々の薬物を添加し、一定時間の後、トリパンブルーで死細胞を染色し、悪性型のモデル細胞のみが染色される薬物を選択してもよい。【００１３】【実施例】以下、本発明の実施例を示す。（実施例１）（癌遺伝子導入トランスジェニックマウスからの株化血管平滑筋細胞の樹立）温度感受性変異株 ＳＶ４０ｔｓＡ５８ のラージＴ抗原遺伝子を導入した７週齢のトランスジェニックマウス４匹より大動脈を摘出した。血管細胞の分離及び回収は酵素法を用い、次のように行った。摘出した大動脈の周囲に付着している脂肪組織などを実体顕微鏡下で取り除き、６００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）で３３℃で５分間処理した。実体顕微鏡下で外膜を剥し細切して２本のエッペンドルフチューブに分けた。この血管を１ｍｇ／ｍｌのエラスターゼ（ワーシントン社製）５００μｌで３３℃、２０分間処理し、更に６００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ５００μｌを加えて３３℃、１時間処理した。更に培地〔１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭ１９９培地（ギブコ社製）〕を１ｍｌ加えて１０００×ｇで５分間遠心して細胞を回収した。【００１４】得られた細胞を２ｍｌの培地で懸濁してコラーゲン被膜した２４穴プレート、１ウェルにまいた。このとき得られた細胞数は、２×１０５ 個であった。細胞は温度３３℃、炭酸ガス濃度５％、湿度１００ ％で培養した。細胞が培養面に飽和するに従い、２４穴プレート−２ウェル、３５−ｍｍシャーレ、６０−ｍｍシャーレ、１００−ｍｍシャーレ（いずれもコラーゲン被膜したもの）にスケールアップした。【００１５】細胞のクローニングは次のように行った（コロニー形成法）。１００−ｍｍシャーレに５００個の細胞をまき、コロニーが形成されるまで培養した。顕微鏡下で平滑筋細胞の形態を保持しているコロニーを探し、シャーレの裏側にマークした。培地を吸引除去後、片側にグリースを塗ったクローニングカップをコロニーが中央にくるようにシャーレに立てた。カップ内にのみ０．２５％トリプシン液を加え、３３℃で１分間インキュベートした。培地をカップ内に加え、ピペッティングして細胞を剥し２４穴プレート、１ウェルにまいた。１次クローニングとして平滑筋細胞の形態を保持している３５クローンをピックアップした。この中から同様に２次選択を行い、１４クローンをピックアップした。これらのクローンについてマウス平滑筋型ミオシン重鎖特異認識単クローン抗体を用いて蛍光抗体法〔図説蛍光抗体法川生 明著 ソフトサイエンス社（１９８３）〕を行い、平滑筋型ミオシン重鎖を発現しているクローン６種を選択した。更にもう一段階、蛍光抗体法によるクローニングを行ったところ６種とも平滑筋型ミオシン重鎖を発現していた。得られた６種の細胞は樹立後１年以上経過した後も形態、機能上何ら変化はなく全く安定であった。６種のうち１種を ＳＶＳ３０−２−６ 株、別のもう１種を ＳＶＳ２４−１−１ 株と命名した。【００１６】ＳＶＳ３０−２−６ 株及び ＳＶＳ２４−１−１ 株は、ブダペスト条約に基づいて工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。ＳＶＳ３０−２−６ 株は平成４年１１月１０日付でＦＥＲＭ ＢＰ−４０８２として、また ＳＶＳ２４−１−１ 株は平成５年１１月１９日付でＦＥＲＭ ＢＰ−４４７３としてそれぞれ寄託されている。（実施例２）（樹立した株化血管平滑筋細胞におけるミオシン重鎖アイソフォームの発現）実施例１で得られた ＳＶＳ３０−２−６ 株及び ＳＶＳ２４−１−１ 株におけるミオシン重鎖アイソフォームの発現を増殖期及び定常期についてウエスタンブロッティングで調べた。細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いタンパク質を分離した。濃縮ゲルは３％、分離ゲルは４％を用いた。タンパク質のゲルから膜への転写はＴｏｗｂｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７６， ｐ．４３５０−４３５４， １９７９）でセミドライ型転写装置を用いて行った。マウス平滑筋型ミオシン重鎖特異認識抗体又は抗非筋型ミオシン重鎖抗体を転写膜の上にのせ室温で１時間インキュベートし、リンスバッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。２次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン ウサギ抗体（ダコ社製）を用い、ブロッキングバッファーで１０００倍希釈したものを転写膜に添加した。室温で１時間インキュベート後、リンスバッファーで３回洗浄した。検出はアマシャム社のＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムを用いて行った。【００１７】ＳＶＳ３０−２−６ 株は、増殖期では非筋型ミオシン重鎖を主に発現し、平滑筋型ミオシン重鎖はほとんど発現していなかった。しかし、３３℃定常期及び３９℃定常期になると逆に平滑筋型ミオシン重鎖を主に発現するようになり、非筋型ミオシン重鎖の発現は減少した（第１表）。ＳＶＳ２４−１−１ 株は、増殖期、定常期を通して平滑筋型ミオシン重鎖を発現しており、３９℃定常期で更に発現が強くなった。逆に非筋型ミオシン重鎖は増殖期、３３℃定常期で発現しているが、３９℃定常期には発現が減少した。一方、従来株化血管平滑筋細胞として用いられてきた Ａ１０細胞やＡ７ｒ５細胞は、平滑筋型ミオシン重鎖を全く発現していなかった（第１表）。【００１８】【表１】【００１９】（実施例３）（樹立した株化血管平滑筋細胞におけるカルポニンの発現）実施例１で得られた ＳＶＳ３０−２−６ 株及び ＳＶＳ２４−１−１ 株におけるカルポニンの発現を増殖期及び定常期についてウエスタンブロッティングで調べた。細胞抽出液の電気泳動、タンパク質のゲルから膜への転写、及び１次抗体として抗カルポニン抗体、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン ヤギ抗体（ダコ社製）又はアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン ヤギ抗体（プロメガ社製）を用いたカルポニンの検出は、実施例１と同様の方法で行った。【００２０】ＳＶＳ３０−２−６ 株は、何れの時期においてもカルポニンを発現していなかった。ＳＶＳ２４−１−１ 株は、増殖期から定常期に至るまで発現が認められ、特に３９℃定常期で発現が上昇した。一方、 Ａ１０細胞、Ａ７ｒ５細胞は、全くカルポニンを発現していなかった（第２表）。【００２１】【表２】【００２２】【発明の効果】本発明によれば、抗動脈硬化作用を有する薬物を探索する方法に利用可能な、株化血管平滑筋細胞を提供することができる。 平滑筋型ミオシン重鎖を発現する能力を有する株化血管平滑筋細胞。 細胞が温度感受性変異株 ＳＶ４０ｔｓＡ５８ のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス由来である請求項１記載の株化血管平滑筋細胞。 細胞が ＳＶＳ３０−２−６ 又は ＳＶＳ２４−１−１ である請求項１記載の株化血管平滑筋細胞。 細胞がカルポニンを発現する能力を有するものである請求項１記載の株化血管平滑筋細胞。 細胞が ＳＶＳ２４−１−１ である請求項４記載の株化血管平滑筋細胞。 温度感受性変異株 ＳＶ４０ｔｓＡ５８ のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス由来で、かつ平滑筋型ミオシン重鎖及びカルポニンを発現する能力を有する株化血管平滑筋細胞。